白细胞介素-37b在制备用于预防和治疗川崎病产品中的用途的制作方法

白细胞介素
‑
37b在制备用于预防和治疗川崎病产品中的用途
技术领域
1.本发明涉及生物制药领域，具体涉及白细胞介素
‑
37b在制备用于治疗川崎病产品中的用途。


背景技术：

2.川崎病(kawasaki disease,kd)是一种可引起全身免疫性血管炎的疾病，主要影响儿童。kd最严重的并发症是冠状动脉损伤，包括冠状动脉扩张、冠状动脉动脉瘤(caa)和狭窄。临床上，最先进的治疗策略是静脉注射免疫球蛋白(ivig)联合口服阿司匹林。在没有早期干预的情况下，约25％的kd患者会发展为caa。即使及时治疗，仍存在不可接受的caa的高风险。因此，探索新的、潜在的治疗策略来临床治疗kd及其并发症迫在眉睫。
3.白细胞介素
‑
37(il
‑
37)是新近报道的il
‑
1家族成员，是一种新型的抗炎细胞因子，具有抑制炎症反应和免疫反应的功能。目前已经鉴定出5种人il
‑
37的剪接变异体(il
‑
37a、il
‑
37b、il
‑
37c、il
‑
37d和il
‑
37e)。研究报道，细胞外il
‑
37通过结合il
‑
1r8来缓解炎症，il
‑
1r8被称为il
‑
1相关的单一igg受体(sigirr)，只有一个单一的ig结构域，能够对炎症起到抑制作用。目前il
‑
37及其亚型是否能改善kd血管炎仍不清楚。
4.众所周知，内皮细胞损伤和炎症是kd发生的关键病理机制，而减轻内皮细胞损伤或炎症是治疗kd的有效手段。il
‑
37可在包括内皮细胞等多种细胞中产生抗炎反应。但到目前为止，il
‑
37及其亚型是否能抑制内皮细胞凋亡，特别是kd引起的凋亡，仍然是未知的。


技术实现要素：

5.针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供白细胞介素
‑
37b在抑制内皮细胞凋亡中的用途。
6.本技术研究发现，白细胞介素
‑
37b通过il
‑
1r8受体介导的erk和nfκb失活来抑制内皮细胞凋亡和血管炎症，从而减轻川崎病冠状动脉炎，最终达到预防和治疗川崎病的用途(参见图39)。
7.一方面，本发明提供了白细胞介素
‑
37b在制备用于预防和/或治疗川崎病产品中的用途。所述产品能够调控川崎病冠状动脉损伤、内皮细胞凋亡和/或血管炎症；优选的，所述产品能够降低川崎病冠状动脉损伤、内皮细胞凋亡和/或血管炎症；优选的，所述内皮细胞选自冠状动脉内皮细胞或人脐静脉内皮细胞。
8.在本技术的一种实施方式中，所述产品通过il
‑
1r8通路来调控川崎病冠状动脉损伤、内皮细胞凋亡和/或血管炎症；优选的，白细胞介素
‑
37b结合所述il
‑
1r8通路中的il
‑
1r8蛋白来降低川崎病冠状动脉损伤、内皮细胞凋亡和/或血管炎症。
9.另一方面，本发明提供了白细胞介素
‑
37b在非治疗目的降低炎症细胞粘附中的用途，所述炎症细胞选自巨噬细胞和/或中性粒细胞。
10.另一方面，本发明提供了白细胞介素
‑
37b在非治疗目的抑制血管细胞黏附分子1表达中的用途；
11.优选的，所述抑制血管细胞黏附分子1表达为抑制血管细胞黏附分子1的转录水平和/或蛋白水平的表达；
12.优选的，所述抑制血管细胞黏附分子1表达为抑制血管细胞黏附分子1蛋白水平的表达。
13.另一方面，本发明提供了白细胞介素
‑
37b在非治疗目的降低炎症相关因子表达中的用途，所述炎症相关因子选自il
‑
1β、il
‑
6、tnf
‑
α、icam
‑
1、mcp
‑
1、vcam
‑
1、e
‑
selectin和rantes中的至少一种；优选的，所述降低炎症相关因子表达为降低炎症相关因子的转录水平和/或蛋白水平的表达；优选的，所述降低炎症相关因子表达为降低炎症相关因子的mrna转录水平的表达。
14.另一方面，本发明提供了白细胞介素
‑
37b在非治疗目的降低凋亡相关因子表达中的用途，所述凋亡相关因子选自bax和/或bcl
‑
2；优选的，所述白细胞介素
‑
37b能够降低bax与bcl
‑
2的比值；优选的，所述降低凋亡相关因子表达为降低凋亡相关因子的mrna转录水平和/或蛋白水平的表达；优选的，所述降低凋亡相关因子表达为降低凋亡相关因子的蛋白水平的表达。
15.另一方面，本发明提供了白细胞介素
‑
37b在非治疗目的调控细胞外信号调节激酶和/或人核转录因子nf
‑
κb
‑
p65激活中的用途；
16.优选的，所述白细胞介素
‑
37b能够降低抑制细胞外信号调节激酶和/或人核转录因子nf
‑
κb
‑
p65的磷酸化水平。
17.在本技术的一种实施方式中，所述白细胞介素
‑
37b通过il
‑
1r8通路来实现所述用途；
18.优选的，白细胞介素
‑
37b结合所述il
‑
1r8通路中的il
‑
1r8蛋白来实现所述用途。
19.在本技术的一种实施方式中，所述白细胞介素
‑
37b选自重组人白细胞介素
‑
37b。
20.本发明的有益效果如下：
21.1、本发明在小鼠模型以及细胞试验中证明，白细胞介素
‑
37b能够抑制川崎病冠脉炎症，及降低内皮细胞凋亡和炎症反应。
22.2、本发明白细胞介素
‑
37b通过il
‑
1r8通路来抑制erk和nfκb的激活从而降低内皮细胞凋亡和炎症反应，从而减轻川崎病冠状动脉炎。
23.3、本发明通过il
‑
1r8基因沉默后的小鼠模型以及细胞试验中进一步证明，白细胞介素
‑
37b通过结合il
‑
1r8受体来降低内皮细胞凋亡和炎症反应。
24.4、本发明的研究结果表明白细胞介素
‑
37b在川崎病冠脉损伤中发挥了有效的保护作用，为白细胞介素
‑
37b作为治疗川崎病的潜在候选药物提供了新证据。
附图说明
25.图1为il
‑
37蛋白的酶联免疫吸附试验结果；
26.图2为il
‑
37基因5个剪接变异体的mrna相对表达水平；
27.图3为il
‑
37b蛋白的western blot结果；
28.图4为il
‑
37b蛋白相对表达水平；
29.图5为kd小鼠模型中内皮细胞的苏木精
‑
伊红(h&e)染色结果；
30.图6为kd小鼠模型中vcam
‑
1的免疫组织化学染色结果；
31.图7为kd小鼠模型中巨噬细胞的免疫组织化学染色结果；
32.图8为kd小鼠模型中中性粒细胞的免疫组织化学染色结果；
33.图9为kd小鼠模型中炎症相关因子的mrna相对表达水平；a为kd小鼠模型中细胞因子的mrna相对表达水平，b为kd小鼠模型中粘附分子的mrna相对表达水平，c为kd小鼠模型中趋化因子的mrna相对表达水平；
34.图10为不同浓度il
‑
37b处理内皮细胞后的细胞活力结果；
35.图11为内皮细胞的tunel染色结果；
36.图12为内皮细胞的bax和bcl
‑
2的western blot结果；
37.图13为内皮细胞炎症相关因子的mrna相对表达水平；a为内皮细胞细胞因子的mrna相对表达水平，b为内皮细胞粘附分子的mrna相对表达水平，c内皮细胞趋化因子的mrna相对表达水平；
38.图14为内皮细胞中il
‑
1r8受体的mrna相对表达水平；
39.图15为内皮细胞中il
‑
1r8受体的western blot结果；
40.图16为il
‑
1r8沉默后内皮细胞中il
‑
1r8受体的mrna相对表达水平；
41.图17为il
‑
1r8沉默后kd处理的内皮细胞中il
‑
1r8受体的mrna相对表达水平；
42.图18为il
‑
1r8沉默后内皮细胞中il
‑
1r8受体的蛋白相对表达水平；
43.图19为il
‑
1r8沉默后内皮细胞的tunel染色结果；
44.图20为il
‑
1r8沉默后内皮细胞中bax和bcl
‑
2的western blot结果；
45.图21为il
‑
1r8沉默后内皮细胞炎症相关因子的mrna相对表达水平；
46.图22为内皮细胞中nf
‑
κb信号通路组分的western blot结果；
47.图23为内皮细胞中nf
‑
κb信号通路组分的蛋白相对表达水平；
48.图24为il
‑
1r8沉默后内皮细胞中nf
‑
κb信号通路组分的western blot结果；
49.图25为il
‑
1r8沉默后内皮细胞中nf
‑
κb信号通路组分的蛋白相对表达水平；
50.图26为内皮细胞中nf
‑
κb蛋白的免疫荧光染色结果；
51.图27为kd小鼠模型中bax和bcl
‑
2蛋白的western blot结果；
52.图28为kd小鼠模型中内皮细胞的tunel染色结果；
53.图29为kd小鼠模型中内皮细胞炎症相关因子的双染色法结果；
54.图30为kd小鼠模型中内皮细胞nf
‑
κb信号通路组分的western blot结果；
55.图31为kd小鼠模型中内皮细胞nf
‑
κb信号通路组分的的双染色法结果；
56.图32为kd小鼠模型中il
‑
1r8的mrna相对表达水平；
57.图33为kd小鼠模型中il
‑
1r8沉默后内皮细胞的苏木精
‑
伊红染色结果；
58.图34为kd小鼠模型中il
‑
1r8沉默后凋亡相关因子的免疫组织化学染色；
59.图35为kd小鼠模型中il
‑
1r8沉默后内皮细胞的tunel染色结果；
60.图36为kd小鼠模型中il
‑
1r8沉默后内皮细胞中bax和bcl
‑
2的western blot结果；
61.图37为kd小鼠模型中il
‑
1r8沉默后内皮细胞凋亡相关因子的western blot结果；
62.图38为kd小鼠模型中il
‑
1r8沉默后内皮细胞炎症相关因子的mrna相对表达水平；
63.图39为il
‑
37b挽救川崎病内皮细胞损伤的图解模型；
64.上述图中，*表示相同条件下的两种处理结果在α＝0.05水平下差异显著，**表示相同条件下的两种处理结果在α＝0.01水平下差异极显著。
具体实施方式
65.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
66.下述实施例中所用的重组人il
‑
37b购自r&d system，其他所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
67.实施例1
68.从每位健康对照和kd急性期患者中采集2ml血液标本,然后进行离心收集血清。收集的血清样本在采集后4h内常规保存在
‑
80℃中供以后使用。此外，对于所有参与者，他们的临床信息和用于学术研究的血液样本都签署了书面知情同意。本研究接受温州医科大学伦理委员会委托，按照《赫尔辛基宣言》进行。
69.il
‑
37的血清浓度按厂家说明书用相应的酶联免疫吸附试验(elisa)试剂盒测定。人il
‑
37elisa试剂盒购自solarbio(中国北京)。
70.为了初步证实il
‑
37可能参与了kd的病理过程，我们首先检测了kd患者血清中il
‑
37的水平，并与健康对照(hc)进行了比较。如图1所示，酶联免疫吸附试验(elisa)显示，kd患者血清中il
‑
37水平明显降低。
71.接下来，用qrt
‑
pcr方法检测20％kd血清处理24h后的人脐静脉内皮细胞(huvecs)中il
‑
37基因5个剪接变异体il
‑
37a、il
‑
37b、il
‑
37c、il
‑
37d和il
‑
37e的mrna相对表达水平。qrt
‑
pcr方法如下：收集细胞和/或组织，放入trizol中裂解，总rna的收集和逆转录成cdna分别采用primescriptrt试剂盒和gdna eraser(takara)完成。接下来，使用power tb green pcr master mix(takara)在applied biosystems quantstudio 3real
‑
time pcr system(thermofisher)上进行40个循环的实时pcr。gapdh特异性引物作为内参对照，所有目的基因的表达均通过gapdh进行标准化，并用2
‑
δδct
方法计算基因表达的相对变化，本研究使用的引物如表1所示，结果如图2所示。由图2可知，与hc血清处理的内皮细胞相比，kd血清处理的内皮细胞中只有il37b显著下调。
72.表1引物信息
[0073][0074]
使用免疫印迹分析western blot进一步分析il
‑
37b蛋白表达水平，免疫印迹分析的方法包括：收集心脏和人脐静脉内皮细胞，用蛋白提取试剂裂解，然后，将复合物在4℃下以12000rpm离心20min，上清液用bca试剂定量，得到的蛋白质用10％或12％的凝胶分离，然后转移到pvdf膜上，在tbst中用5％脱脂牛奶封闭2h后，用下列一抗在4℃下孵育过夜：il
‑
37(proteintech,chicago,usa,1:1000,cat.no:60296
‑1‑
lg),il
‑
1r8(proteintech,chicago,usa,1:1000,cat.no:27828
‑1‑
ap),atp1a1(proteintech,chicago,usa,1:10000,
cat.no:14418
‑1‑
ap),p
‑
erk(affinity biosciences,cincinnati,oh,usa,1:1000,cat.no:af1015),p
‑
jnk(affinity biosciences,cincinnati,oh,usa,1:1000,cat.no:af3318),p
‑
p38(affinity biosciences,cincinnati,oh,usa,1:1000,cat.no:af4001),p
‑
nfkb p65(affinity biosciences,cincinnati,oh,usa,1:1000,cat.no:af2006),bax(signalway antibody,california,usa,1:1000,cat.no:40635),bcl
‑
2(signalway antibody,california,usa,1:1000,cat.no:40639),gapdh(proteintech,chicago,usa,1:2000,cat.no:60004
‑1‑
lg)。用tbst(含0.05％tween
‑
20的tbs)洗涤3次后，用辣根过氧化物酶标记的二抗(1：10000)在室温下反应2h。信号由chemidocxrs 成像系统(bio
‑
radlaboratory，hercules，ca，usa)可视化。用image j软件获得蛋白质印迹条带的密度值，并进行统计分析，结果如图3
‑
4所示。由图3
‑
4可知，kd血清处理后il
‑
37b蛋白表达水平下降。
[0075]
综上所述，kd血清处理后内皮细胞中il
‑
37b表达下调。
[0076]
实施例2
[0077]
用白色念珠菌nbrc1385制备caws。简而言之，白色念珠菌在27℃，转速为170rpm的c
‑
limiting培养基中培养2天。接下来，加入等量的乙醇，放入4℃的冰箱中过夜。离心收集沉淀，将沉淀溶于水中，搅拌2h后再次离心。最后得到可溶性部分，加入等量的乙醇后4℃的冰箱中过夜，再次离心。得到的沉淀物用丙酮收集，风干后，将得到的caws溶解在pbs缓冲液中，并在使用前进行高压灭菌。
[0078]
kd动物模型选用3～4周龄雄性c57bl/6小鼠，购自温州医科大学，证号：scxk[zj]2005
‑
0019.所有动物实验程序均经温州医科大学伦理委员会批准，并按照《实验动物关爱与使用指南》执行。饲养温度为23
±
2℃，湿度为50
±
5％。将小鼠随机分为3组：pbs组、caws组和caws il
‑
37b组，caws(4mg/只)组小鼠每天腹腔注射一次，连续5天，pbs组小鼠腹腔注射pbs缓冲液。重组蛋白il
‑
37b(40μg/kg体重)在caws加入前2天和后2天分别腹腔注射给小鼠，在最后一次注射caws的4周后，麻醉小鼠，处死小鼠，收集心脏组织并进行后续实验。
[0079]
使用苏木精
‑
伊红(h&e)染色和免疫组织化学染色检测血管细胞黏附分子
‑
1(vcam
‑
1)、巨噬细胞标志物f4/80和中性粒细胞标志物在冠脉内皮细胞中的表达水平。
[0080]
苏木精
‑
伊红(h&e)染色和免疫组织化学染色的方法包括以下步骤：取小鼠心脏，用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋。5μm厚心脏切片脱蜡、水合，he液染色，光镜下观察，结果如图5所示。由图5可知，il
‑
37b治疗后显著减轻了冠状动脉炎症。
[0081]
免疫组织化学(ihc)染色f4/80、中性粒细胞和血管细胞黏附分子
‑
1(vcam
‑
1)，切片脱蜡和水合，然后在3％h2o2中孵育15min。用5％bsa在37℃环境下封闭30min，在4℃下孵育一抗过夜。然后，用辣根过氧化物酶(hrp)偶联二抗进行检测。以二氨基联苯胺(dab)为底物进行显色，所有载玻片均用苏木精染色，用光学显微镜获得组织学染色切片的图像，检测结果如如图6
‑
8所示。由图6
‑
8可知，caws处理小鼠后，冠脉内膜vcam
‑
1表达显著上调，并伴有巨噬细胞和中性粒细胞参与的炎症细胞浸润增加；加入il
‑
37b后显著降低了vcam
‑
1表达水平，巨噬细胞和中性粒细胞参与的炎症细胞浸润减少。
[0082]
使用qrt
‑
pcr方法检测kd小鼠模型中细胞因子(il
‑
1β、il
‑
6和tnf
‑
α)、粘附分子(icam
‑
1、mcp
‑
1、vcam
‑
1和e
‑
selectin)和趋化因子(mip1
‑
a和rantes)的mrna相对表达水平。qrt
‑
pcr方法如下：收集心脏组织细胞，放入trizol中裂解，总rna的收集和逆转录成
cdna分别采用primescriptrt试剂盒和gdna eraser(takara)完成。接下来，使用power tb green pcr master mix(takara)在applied biosystems quantstudio 3real
‑
time pcr system(thermofisher)上进行40个循环的实时pcr。gapdh特异性引物作为内参对照，所有目的基因的表达均通过gapdh进行标准化，并用2
‑
δδct
方法计算基因表达的相对变化，所使用的引物如表2所示，结果如图9所示。由图9可知，细胞因子(il
‑
1β、il
‑
6和tnf
‑
α)、粘附分子(icam
‑
1、mcp
‑
1、vcam
‑
1和e
‑
selectin)和趋化因子(mip1
‑
a和rantes)在kd小鼠模型中的表达显著上调，而il
‑
37b的加入显著降低了炎症相关因子的表达。
[0083]
表2引物信息
[0084][0085]
实施例3
[0086]
按照实施例1的方法得到kd患者血清(kd)和健康对照血清(hc)。
[0087]
以人脐静脉内皮细胞(huvecs)和人单核细胞白血病细胞系(thp1)为研究对象。huvecs和thp1由基因检测生物技术公司(中国苏州)和keycen生物技术公司(中国南京)通过短串联重复序列(str)标记进行鉴定，并且没有支原体污染。huvec和thp1按以前的报道常规培养，必要时，用il
‑
37b蛋白预处理人脐静脉内皮细胞1h，然后与thp1细胞共培养24h，所有培养物放在健康对照血清或kd患者血清中生长，血清在dmem培养基中稀释。
[0088]
为了研究il
‑
37b的保护作用，我们将不同浓度的il
‑
37b(0ng/ml、10ng/ml和100ng/ml)加入人脐静脉内皮细胞，将其与kd血清处理的thp1细胞共培养。使用cck8比色法检测细胞活力，结果如图10所示。由图10可知，il
‑
37b可明显挽救细胞活力，其中100ng/ml il
‑
37b挽救效果最好。因此，在后续实验中，我们选择100ng/ml il
‑
37b处理细胞。
[0089]
使用tunel染色分析内皮细胞dna片段化，方法包括以下步骤：在盖玻片上培养内皮细胞，并用血清处理，用4％的pfa处理和用0.3％的triton x
‑
100使细胞通透性增加，然后用pbs洗涤细胞，在37℃黑暗环境中与tunel反应混合物孵育1h，之后用dapi染色，最后，在共聚焦激光显微镜(nikon,tokyo,japan)下扫描并捕获图像。结果如图11所示。由图11可知，il
‑
37b显著抑制了kd血清诱导的内皮细胞凋亡，降低了tunel阳性细胞百分比，
[0090]
使用western blot进一步分析内皮细胞内bax和bcl
‑
2蛋白的表达。western blot的方法参考实施例1。结果如图12所示。由图12可知，il
‑
37b显著下调了bax/bcl
‑
2比值。
[0091]
使用qrt
‑
pcr方法检测kd/hc血清处理的内皮细胞中细胞因子(il
‑
1β、il
‑
6和tnf
‑
α)、粘附分子(icam
‑
1、mcp
‑
1、vcam
‑
1和e
‑
selectin)和趋化因子(mip
‑
1α和rantes)的mrna相对表达水平。qrt
‑
pcr方法参考实施例1，所使用的引物如表3所示，结果如图13所示。
[0092]
表3
[0093][0094]
由图13可知，il
‑
37b治疗显著降低了kd处理的内皮细胞中炎症相关因子的表达水平，包括il
‑
1β、il
‑
6、tnf
‑
α、icam
‑
1、mcp
‑
1、vcam
‑
1、e
‑
selectin和rantes。以上数据表明，il
‑
37b的加入可以抑制kd处理的内皮细胞凋亡和炎症反应。
[0095]
实施例4
[0096]
按照实施例3的方法获得血清处理后的内皮细胞。采用定量rt
‑
pcr方法检测血清处理后的内皮细胞il
‑
1r8 mrna的表达，结果如图14所示。由图14可知，kd血清处理显著上调了il
‑
1r8表达，而添加il
‑
37b后进一步上调其表达。
[0097]
使用western blot检测内皮细胞表面和细胞内il
‑
1r8蛋白的表达水平。western blot的方法参考实施例1；gapdh作为细胞质蛋白的内参对照，atp1a1作为细胞表面膜蛋白的内参对照，结果如图15所示。由图15可知，各组细胞内il
‑
1r8蛋白的表达水平均保持不变。而在经kd处理的内皮细胞中，表面il
‑
1r8蛋白表达明显增加，il
‑
37b进一步上调表面il
‑
1r8蛋白表达，这与mrna结果一致，提示il
‑
37b可能通过il
‑
1r8发挥作用。
[0098]
用非靶向对照sirna(sictrl)或il
‑
1r8特异性sirna(siil
‑
1r8)瞬时转染内皮细胞，然后瞬时转染siil
‑
1r8的内皮细胞用kd血清处理的thp1处理后，从mrna水平和蛋白水平检测il
‑
1r8的表达，结果如图16
‑
18所示。由图16可知，il
‑
1r8 sirna显著抑制了il
‑
1r8的表达。由图17可知，il
‑
1r8 sirna显著抑制了经kd处理的内皮细胞中il
‑
1r8的上调。由图18可知，il
‑
1r8的表达变化也在蛋白水平上得到证实。
[0099]
il
‑
1r8表达沉默后，用tunel染色分析dna片段化，tunel染色分析参考实施例3。结果如图19所示。由图19可知，在il
‑
1r8沉默后，il
‑
37b对凋亡的抑制作用发生明显逆转，tunel阳性细胞比例增加。
[0100]
il
‑
1r8表达沉默后，使用western blot进一步分析内皮细胞内bax和bcl
‑
2蛋白的表达，western blot的方法参考实施例1，结果如图20所示。由图20可知，在il
‑
1r8沉默后，
il
‑
37b的加入使得内皮细胞中bax/bcl
‑
2蛋白的比例升高。使用qrt
‑
pcr方法检测tnf
‑
α、il
‑
1β和il
‑
6蛋白的表达，qrt
‑
pcr方法参考实施例1，结果如图21所示。由图21可知，il
‑
37b介导的tnf
‑
α、il
‑
1β和il
‑
6的mrna表达下降在il
‑
1r8沉默后也发生了明显消除。以上结果表明，il
‑
37b通过il
‑
1r8通路抑制kd处理的内皮细胞凋亡和炎症。
[0101]
实施例5
[0102]
按照实施例3的方法获得血清处理后的内皮细胞。使用western blot检测了内皮细胞p38、c
‑
jun n
‑
末端激酶(jnk)、细胞外信号调节激酶(erk)和核转录因子nf
‑
κb p65的磷酸化水平。western blot的方法参考实施例1，结果如图22
‑
23所示。由图22
‑
23可知，kd血清处理后，erk和nf
‑
κb p65显著磷酸化并激活，而il
‑
37b的加入显著降低了erk和nf
‑
κb p65的磷酸化水平，提示il
‑
37b可抑制erk和nf
‑
κbp65的激活。
[0103]
接着，为了进一步证实il
‑
37b通过il
‑
1r8调节erk和nf
‑
κb p65的激活，我们沉默了il
‑
1r8，western blot检测结果如图24
‑
25所示，由图24
‑
25可知，il
‑
1r8表达的降低显著逆转了erk和nf
‑
κb p65的磷酸化水平。
[0104]
使用免疫荧光染色检测进一步检测erk和nf
‑
κb p65的激活；免疫荧光染色的方法包括以下步骤：在脱蜡和水合后，心脏切片在3％h2o2中孵育15min，然后用5％的bsa在37℃环境下封闭30min。随后，将切片与p
‑
erk、tnf
‑
α、cd31的一抗在4℃下孵育过夜，然后在37℃下与alexa fluor647或alexa fluor488(1：1000，abcam)孵育1h。对于huvecs细胞，将其在4％的pfa中固定30min，之后在37℃环境下用5％的bsa封闭30分钟，然后，将细胞与抗nf
‑
κb p65一抗在4℃下孵育过夜，之后用alexa fluor488二抗以1：1000的比例稀释1h，细胞核用dapi标记。这些图像是在共聚焦激光显微镜(nikon,tokyo,japan)下拍摄的，结果如图26所示。由图26可知，il
‑
37b处理后，nf
‑
κb p65转位入核减弱。然而，与il
‑
37b处理组相比，il
‑
1r8沉默后nf
‑
κb p65的入核增强，进一步说明il
‑
37b抑制了nf
‑
κb的激活。这些数据表明il
‑
37b处理可以影响erk和nf
‑
κb的激活。
[0105]
实施例6
[0106]
为了进一步在体内探讨il
‑
37b的保护机制，我们检测了凋亡相关蛋白bax和bcl
‑
2在kd小鼠模型心脏组织中的表达水平。小鼠不同处理组的获得参考实施例2。
[0107]
使用western blot进一步分析il
‑
37b对kd小鼠模型bax和bcl
‑
2蛋白的表达。western blot的方法参考实施例1，结果如图27所示。由图27可知，il
‑
37b处理后，bax/bcl
‑
2的比值显著降低。
[0108]
用tunel(绿色)和cd31(内皮细胞标志物，红色)共定位染色，观察il
‑
37b处理对内皮细胞dna片段化的影响，放大倍数：
×
200，比例尺＝50μm，结果如图28所示。由图28可知，il
‑
37b显著降低了kd小鼠模型冠脉内皮中tunel阳性细胞的百分比。
[0109]
用tnf
‑
α(绿色)和cd31(红色)双染色法检测冠脉内皮细胞tnf
‑
α的表达水平。放大倍数：
×
200，比例尺＝50μm；结果如图29所示。由图29可知，il
‑
37b显著下调了冠状动脉内皮中tnf
‑
α的表达。
[0110]
使用western blot检测心脏组织中erk和nf
‑
κb的活性，结果如图30所示。由图30可知，il
‑
37b处理显著降低了erk和nf
‑
κb p65磷酸化水平。
[0111]
使用p
‑
erk/cd31双重染色法检测冠状动脉内皮细胞中p
‑
erk的表达。放大倍数：
×
200，比例尺＝50μm，结果如图31所示。由图31可知，il
‑
37b处理后，p
‑
erk免疫荧光强度也明
显减弱。以上结果表明，il
‑
37b可能通过降低erk和nf
‑
κb激活来减轻内皮损伤。
[0112]
实施例7
[0113]
为了在体内验证il
‑
37b是否通过il
‑
1r8受体参与kd小鼠模型的抗凋亡和抗炎功能，我们首先测定il
‑
1r8的表达水平。小鼠不同处理组的获得参考实施例2。
[0114]
使用western blot检测小鼠细胞内il
‑
1r8的表达水平。western blot的方法参考实施例1，结果如图32所示。由图32可知，与体外结果一致，caws组il
‑
1r8 mrna水平显著上调，il
‑
37b的添加进一步增加了其表达。
[0115]
为了评估il
‑
1r8在体内的作用，将小鼠随机分为4组：pbs组、caws组、caws il
‑
37b组、caws il
‑
37b aav9
‑
il
‑
1r8 sirna组，caws(4mg/只)组小鼠每天腹腔注射一次，连续5天；pbs组小鼠腹腔注射pbs缓冲液。caws il
‑
37b组(40μg/kg体重)在caws加入前2天和后2天分别腹腔注射给小鼠；caws il
‑
37b aav9
‑
il
‑
1r8 sirna组对il
‑
1r8的腺相关病毒9介导的rna干扰(aav9
‑
il
‑
1r8 sirna)被注射到il
‑
37b处理的kd小鼠模型中。在最后一次注射caws的4周后，麻醉小鼠，处死小鼠，收集心脏组织并进行后续实验。
[0116]
使用苏木精
‑
伊红(h&e)染色观察il
‑
1r8沉默对冠脉炎的影响，放大率：
×
200.比例尺＝100μm，苏木精
‑
伊红(h&e)染色的方法参考实施例2，结果如图33所示。由图33可知，il
‑
1r8基因沉默显著取消了il
‑
37b对冠状动脉炎症的抑制作用。
[0117]
使用免疫组织化学染色检测细胞黏附分子
‑
1(vcam
‑
1)、巨噬细胞标志物f4/80和中性粒细胞标志物在冠脉内皮细胞中的表达水平，免疫组织化学染色的方法参考实施例2。结果如图34所示。由图34可知，il
‑
1r8基因沉默显著取消了il
‑
37b对冠状动脉炎症的抑制作用。与il
‑
37b相比，沉默il
‑
1r8也上调了vcam
‑
1的表达，增加了巨噬细胞和中性粒细胞对内皮细胞的浸润
[0118]
为了进一步阐明il
‑
1r8对体内内皮细胞凋亡和炎症反应的影响，我们检测了凋亡相关参数和炎症因子表达。il
‑
1r8表达沉默后，用tunel染色分析dna片段化，tunel染色分析参考实施例3。结果如图35所示。由图35可知，沉默il
‑
1r8后，冠脉内皮细胞中tunel阳性细胞的百分比增加。
[0119]
il
‑
1r8表达沉默后，使用western blot进一步分析内皮细胞内bax和bcl
‑
2蛋白的表达，及erk和nf
‑
κbp65的磷酸化水平；western blot的方法参考实施例1，结果如图36
‑
37所示。由图36可知，沉默il
‑
1r8后，冠脉内皮细胞中bax/bcl
‑
2蛋白的比例显著增加；由图37可知，il
‑
1r8基因沉默后erk和nf
‑
κb p65磷酸化水平也显著升高。使用qrt
‑
pcr方法检测tnf
‑
α、il
‑
1β和il
‑
6蛋白的表达，qrt
‑
pcr方法参考实施例1，结果如图38所示。由图36可知，沉默il
‑
1r8后，冠脉内皮细胞中bax/bcl
‑
2蛋白的比例显著增加。由图37可知，il
‑
1r8基因沉默也可以影响il
‑
37b介导的il
‑
6、tnf
‑
α和il
‑
1β的mrna表达下调，由图38可知，erk和nf
‑
κb p65磷酸化水平也显著升高。
[0120]
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