黄烷类化合物在制备抗肿瘤的药物中的用途的制作方法

1.本发明涉及黄烷类化合物在制备抗肿瘤的药物中的用途。


背景技术：

2.肿瘤作为一种严重危害人类健康的疾病，近年来，因社会人口老龄化、年轻人生活节奏紧凑、工作压力增大以及不良生活习惯的形成，其发病率和死亡率逐年上升。我国相关统计数据表明，肿瘤引起的死亡人数已经超过心血管疾病，目前已经成为城市及农村居民的第一大死因。抗肿瘤研究是医学界面临的一大难题，亦是社会亟待解决的重大问题，加快推动肿瘤生物学和肿瘤治疗药物的研发已迫在眉睫。近年来研究表明，从天然产物中寻找新型抗肿瘤药物具有广阔的前景和巨大的潜力。
3.血竭为棕榈科植物麟麟竭daemonorops draco bl.果实渗出的树脂经加工制成，龙血竭为百合科龙血树属植物剑叶龙血树dracaena cochinchinenis(lour)s.c.chen的含脂木材经乙醇提取得到的树脂，两者在活血化瘀、抗炎止痛、生肌敛疮、免疫调节等药理活性。由于血竭和龙血竭疗效显著，逐渐被人们所重视，也得到了越来越广泛的临床应用。其主要应用在心血管疾病，消化系统疾病，糖尿病及并发症，皮肤科疾病，妇科疾病，肛肠科疾病。
4.相关研究发现，血竭中分离所得的血竭素能够通过激活mapk信号通路进而诱导胶质瘤细胞u251和神经母细胞瘤细胞sh-sy5y发生凋亡。龙血竭75％乙醇提取部位可抑制人胆管癌细胞的增殖，并可通过激活caspase-8、parp、bax等促凋亡蛋白诱导人胆管癌细胞系hccc9810和qbc939发生凋亡。此外，龙血竭75％乙醇提取部位亦可抑制裸鼠胆管癌移植瘤模型中肿瘤的生长。从龙血竭中分离的三种芪类化合物中，除紫檀芪外，4
′
,5-二羟基-3-甲氧基二苯乙烯及白藜芦醇都能抑制人黑色素瘤细胞hsc-1的增殖，并具有时效和量效关系。4
′
,5-二羟基-3-甲氧基二苯乙烯及白藜芦醇在ic
50
浓度下作用72 h能显著促进hsc-1细胞发生凋亡，阻滞细胞周期，有效抑制体外癌细胞增殖是其抗癌作用机制之一。
5.龙血竭中含有龙血素a、龙血素b、剑叶龙血素b、黄酮类、高异黄烷酮类、黄酮寡聚体类、类黄酮化合物、黄烷类化合物等成分。cn105153100a公开了一种龙血竭中的类黄酮化合物的制备方法及应用；类黄酮化合物为龙血竭中分离得到的具有4
′-
羟苄基色原烷基本骨架的类黄酮化合物，其中化合物1为新化合物，化合物2和3为已知化合物。化合物命名为：化合物1为5,8-二甲氧基-7-羟基-4
′-
羟苄色原烷，化合物2为4-甲氧基-7-羟基-4
′-
羟苄色原烷，化合物3为7-羟基-4
′-
羟苄色原烷；上述类黄酮化合物具有促进mscs向成骨细胞方向分化的能力，具有潜在的治疗骨质疏松的功效。 cn108017609a公开了一种黄烷类单体化合物，其为(2s)-6,4
′-
二羟基-5-甲氧基黄烷，该黄烷类单体化合物可用于制备抗糖尿病作用、肝保护作用和抗肿瘤作用药物。
6.目前尚未发现血竭或龙血竭中的黄烷类化合物对肿瘤细胞具有显著的细胞毒活性。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明的目的在于提供黄烷类化合物在制备抗肿瘤的药物中的用途，本发明的黄烷类化合物能够有效抑制肿瘤细胞增殖，且对至少十一类肿瘤细胞具有细胞毒性作用，普适性强。
8.本发明采用如下技术方案实现上述目的。
9.本发明提供黄烷类化合物在制备抗肿瘤的药物中的用途，所述黄烷类化合物具有如式i所示的结构：
[0010][0011]
其中：
[0012]
r1选自-h或-ch3；
[0013]
r2选自-oh或-och3；
[0014]
r3选自-h或-ch3；
[0015]
r4选自-h、-oh或-och3；
[0016]
r5选自-h或-oh；
[0017]
r6选自-h或-och3或-och2ch3；
[0018]
r7选自-h或-oh；
[0019]
r8选自-h、-oh或-och3；以及
[0020]
r9选自-h或-oh；
[0021]
同时，当r2为-oh且r4为-och3时，r1、r5、r6、r7、r8、r9中至少一个不为-h。
[0022]
本发明中，优选地，所述黄烷类化合物中，r1选自-h或-ch3，r2为-oh，r3选自
ꢀ-
h或-ch3，r4为-och3，r5为-h，r6为-och3，r7为-h，r8为-h，且r9为-h。
[0023]
本发明中，优选地，所述黄烷类化合物中，r1选自-h或-ch3，r2选自-oh或-och3， r3为-h，r4选自-h或-och3，r5为-h，r6为-h，r7选自-h或-oh，r8选自-oh或-och3，且r9为-h。
[0024]
本发明中，优选地，所述黄烷类化合物选自如下化合物中的一种或多种：
[0025]
5-羟基-7-甲氧基黄烷(化合物1)；
[0026]
(2r)-7-羟基-2,5-二甲氧基-6-甲基黄烷(化合物2)；
[0027]
(2s)-7-羟基-2,5-二甲氧基-6-甲基黄烷(化合物3)；
[0028]
(2r)-7-羟基-2,5-二甲氧基-6,8-二甲基黄烷(化合物4)；
[0029]
(2s)-7-羟基-2,5-二甲氧基-6,8-二甲基黄烷(化合物5)；
[0030]
7-羟基-2,5-二甲氧基-8-甲基黄烷(化合物6)；
[0031]
7,6
′-
二羟基-5-甲氧基-6-甲基黄烷(化合物7)；
[0032]
3,7-二羟基-2-乙氧基-5-甲氧基-6-甲基黄烷(化合物8)；
[0033]
7-羟基-4
′-
甲氧基黄烷(化合物9)；
[0034]
(2r)-7,4
′-
二羟基-8-甲基黄烷(化合物10)；
[0035]4′-
羟基-5,7-二甲氧基-8甲基黄烷(化合物11)；
[0036]
(2r)-4
′-
羟基-5,7-二甲氧基黄烷(化合物12)；
[0037]
(2r)-7,3
′-
二羟基-4
′-
甲氧基-8-甲基黄烷(化合物13)；
[0038]
(2r)-5,7-二羟基-4
′-
甲氧基-8-甲基黄烷(化合物14)；或
[0039]
(2r)-7,3
′-
二羟基-4
′-
甲氧基黄烷(化合物15)。
[0040]
本发明中，更优选地，所述黄烷类化合物选自如下化合物中的一种或多种：
[0041]
(2s)-7-羟基-2,5-二甲氧基-6-甲基黄烷(化合物3)；
[0042]4′-
羟基-5,7-二甲氧基-8甲基黄烷(化合物11)；
[0043]
(2r)-4
′-
羟基-5,7-二甲氧基黄烷(化合物12)；
[0044]
(2r)-7,3
′-
二羟基-4
′-
甲氧基-8-甲基黄烷(化合物13)；
[0045]
(2r)-5,7-二羟基-4
′-
甲氧基-8-甲基黄烷(化合物14)；或
[0046]
(2r)-7,3
′-
二羟基-4
′-
甲氧基黄烷(化合物15)。
[0047]
本发明中，再优选地，所述黄烷类化合物选自如下化合物中的一种或多种：
[0048]
(2r)-4
′-
羟基-5,7-二甲氧基黄烷(化合物12)；
[0049]
(2r)-7,3
′-
二羟基-4
′-
甲氧基-8-甲基黄烷(化合物13)；
[0050]
(2r)-5,7-二羟基-4
′-
甲氧基-8-甲基黄烷(化合物14)；或
[0051]
(2r)-7,3
′-
二羟基-4
′-
甲氧基黄烷(化合物15)。
[0052]
本发明中，最优选地，所述黄烷类化合物为(2r)-7,3
′-
二羟基-4
′-
甲氧基-8-甲基黄烷 (化合物13)。
[0053]
本发明中，优选地，所述肿瘤选自胃癌、肺癌、肝癌、结肠癌、宫颈癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、神经胶质瘤、卵巢癌和膀胱癌中的至少一种。
[0054]
根据本发明的用途，优选地，所述药物形成抗肿瘤的药物制剂；所述药物制剂包含所述黄烷类化合物，还包含药学上可接受的辅料。
[0055]
根据本发明的用途，优选地，所述药物制剂以所述黄烷类化合物作为唯一活性成分。
[0056]
本发明的黄烷类化合物可以用于制备抗肿瘤的药物，且不同化合物对各种肿瘤的抑制作用能力各异。化合物1～15对多种肿瘤细胞均表现出抑制肿瘤细胞生长的活性，普适性强，且表现出较强的肿瘤细胞毒性作用。(2r)-7,3
′-
二羟基-4
′-
甲氧基-8-甲基黄烷对各种肿瘤的抑制作用最强，特别适合制备治疗胃癌、肝癌、结肠癌、宫颈癌、神经胶质瘤的药物。
附图说明
[0057]
图1为化合物13的消旋体的hplc色谱图。
[0058]
图2为化合物13(即r构型)的hplc色谱图。
[0059]
图3为化合物13相应的s构型的hplc色谱图。
[0060]
图4为化合物13(即r构型)的单晶衍射结果。
[0061]
图5为化合物13相应的s构型的单晶衍射结果。
[0062]
图6为化合物7的1h nmr图谱。
[0063]
图7为化合物7的
13
c nmr图谱。
[0064]
图8为化合物8的1h nmr图谱。
[0065]
图9为化合物8的
13
c nmr图谱。
具体实施方式
[0066]
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
[0067]
本发明中，所述黄烷类化合物1、6、9和11均为本领域已知化合物，其制备方法可采用已知方法获得，例如可以从血竭药材或龙血竭药材中提取分离得到，也可以通过化学合成方法得到，还可以通过市售购买得到。因此上述化合物的制备方法在此不做赘述。
[0068]
本发明中，化合物7、8为新化合物，是从血竭药材中提取分离得到的。可采用如下方法制备：以血竭作为原料，粉碎，依次用浓度为95％、70％和50％的乙醇水溶液分别提取2次，回收溶剂后合并，得到血竭总提取物。将所述血竭总提物用水分散，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取，最终得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位。乙酸乙酯部位依次用石油醚-乙酸乙酯(10:1～1:3)、二氯甲烷-甲醇(20:1～0:1)洗脱，得到18 个流分(fr.a～r)，其中fr.g流份为黄烷聚集部位。fr.g流份进一步通过sephadex lh-20柱色谱分离，洗脱剂为体积比为50:50的ch2cl
2-meoh，得到5个流份，分别为 fr.g1～g5。其中fr.g2经半制备液相纯化，流动相为体积比为65:35的乙腈-水，得到化合物7(t
r 13.5min)。fr.g3流份经半制备液相纯化，流动相为体积比为70:30 的乙腈-水，得到化合物8(t
r 17.3min)。
[0069]
本发明中，化合物2～5、10、12～15的消旋体均为已知化合物，可以根据文献记载的方法制备获得，例如可以从血竭药材或龙血竭药材中提取分离得到，也可以通过化学合成方法得到，还可以通过市售购买得到。将相应的消旋体进行手性拆分，即可分别得到作为光学异构体的纯的化合物2～5、10、12～15。手性拆分的方法可以采用本领域内常规拆分方法。
[0070]
本发明提供黄烷类化合物在制备抗肿瘤的药物中的用途，所述黄烷类化合物具有如式i所示的结构：
[0071][0072]
其中：r1选自-h或-ch3；r2选自-oh或-och3；r3选自-h或-ch3；r4选自-h、-oh 或-och3；r5选自-h或-oh；r6选自-h或-och3或-och2ch3；r7选自-h或-oh；r8选自-h、-oh或-och3；以及r9选自-h或-oh；同时，当r2为-oh且r4为-och3时， r1、r5、r6、r7、r8、r9中至少一个不为-h。
[0073]
所述黄烷类化合物对人胃癌细胞系hgc-27、mgc-803，人肺癌细胞系nci-h1299、 nci-h358，人肝癌细胞系hepg2、sk-hep-1，人结肠癌细胞系hct-116、ht29，人宫颈癌细胞系
hela，人胰腺导管上皮癌细胞系panc-1，人黑色素瘤细胞系a875，人乳腺癌细胞系mcf-7，人神经胶质瘤细胞系h4，人卵巢癌细胞系sk-ov-3、caov-3，人膀胱癌细胞系t24均具有较好的细胞毒活性，具有良好的肿瘤细胞增殖抑制作用。因此，所述黄烷类化合物具有抗肿瘤作用，所述肿瘤选自胃癌、肺癌、肝癌、结肠癌、宫颈癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、神经胶质瘤、卵巢癌和膀胱癌中的至少一种。
[0074]
根据本发明优选的实施方式，所述黄烷类化合物的结构如式ⅱ所示，即5-羟基-7
-ꢀ
甲氧基黄烷(化合物1)。
[0075][0076]
5-羟基-7-甲氧基黄烷(化合物1)对胃癌、肺癌、肝癌、结肠癌、宫颈癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、神经胶质瘤、卵巢癌和膀胱癌均具有抑制作用，特别对胃癌、宫颈癌、神经胶质瘤、卵巢癌和膀胱癌抑制作用显著。因此，根据本发明一种优选的实施方式，所述黄烷类化合物为5-羟基-7-甲氧基黄烷，且所述肿瘤选自胃癌、宫颈癌、神经胶质瘤、卵巢癌和膀胱癌中的至少一种。
[0077]
根据本发明另一优选的实施方式，所述黄烷类化合物的结构如式ⅲ所示，其中， r1选自-h或-ch3，r3选自-h或-ch3；
[0078][0079]
根据本发明优选的实施方式，式ⅲ所示的黄烷类化合物选自(2r)-7-羟基-2,5-二甲氧基-6-甲基黄烷(化合物2)、(2s)-7-羟基-2,5-二甲氧基-6-甲基黄烷(化合物3)、(2r)-7
-ꢀ
羟基-2,5-二甲氧基-6,8-二甲基黄烷(化合物4)、(2s)-7-羟基-2,5-二甲氧基-6,8-二甲基黄烷(化合物5)、7-羟基-2,5-二甲氧基-8-甲基黄烷(化合物6)中的任一种或几种。
[0080]
本发明中，所述化合物2～6对胃癌、肺癌、肝癌、结肠癌、宫颈癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、神经胶质瘤、卵巢癌和膀胱癌均具有抑制作用，且各化合物对各肿瘤的针对性有所不同。根据本发明的一个优选的实施方式，所述黄烷类化合物为化合物2，且所述肿瘤选自胃癌、肺癌、神经胶质瘤、卵巢癌和膀胱癌的至少一种。根据本发明的一个优选的实施方式，所述黄烷类化合物为化合物3，且所述肿瘤选自肺癌、肝癌、结肠癌、神经胶质瘤的至少一种。根据本发明的一个优选的实施方式，所述黄烷类化合物为化合物4，且所述肿瘤选自胃癌、肺癌、肝癌、神经胶质瘤的至少一种。根据本发明的一个优选的实施方式，所述黄烷类化合物为化合物5，且所述肿瘤选自胃癌、肺癌、肝癌、神经胶质瘤的至少一种。根据本发明的一个优选的实施方式，所述黄烷类化合物为化合物6，且所述肿瘤选自肺癌、肝癌、神经胶质瘤和膀胱癌的至少一种。
[0081]
本发明中，化合物2和3为光学异构体，且总体上看，化合物3(s型)的肿瘤抑制率略
高于化合物2(r型)。本发明中，化合物4和5为光学异构体，且总体上看，化合物4(r型)与化合物5(s型)的肿瘤抑制率相当。
[0082]
根据本发明再一优选的实施方式，所述黄烷类化合物的结构如式ⅳ所示，即7,6
′-ꢀ
二羟基-5-甲氧基-6-甲基黄烷(化合物7)，
[0083][0084]
7,6
′-
二羟基-5-甲氧基-6-甲基黄烷(化合物7)对胃癌、肺癌、肝癌、结肠癌、宫颈癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、神经胶质瘤、卵巢癌和膀胱癌均具有抑制作用，特别对胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌和神经胶质瘤抑制作用显著。因此，根据本发明一种优选的实施方式，所述黄烷类化合物为7,6
′-
二羟基-5-甲氧基-6-甲基黄烷，且所述肿瘤选自胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌和神经胶质瘤中的至少一种。
[0085]
根据本发明再一优选的实施方式，所述黄烷类化合物的结构如式
ⅴ
所示，即3,7
-ꢀ
二羟基-2-乙氧基-5-甲氧基-6-甲基黄烷(化合物8)，
[0086][0087]
3,7-二羟基-2-乙氧基-5-甲氧基-6-甲基黄烷(化合物8)对胃癌、肺癌、肝癌、结肠癌、宫颈癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、神经胶质瘤、卵巢癌和膀胱癌均具有抑制作用，特别对肝癌、神经胶质瘤和卵巢癌抑制作用显著。因此，根据本发明一种优选的实施方式，所述黄烷类化合物为3,7-二羟基-2-乙氧基-5-甲氧基-6-甲基黄烷，且所述肿瘤选自肝癌、神经胶质瘤和卵巢癌中的至少一种。
[0088]
根据本发明再一优选的实施方式，所述黄烷类化合物的结构如式
ⅵ
所示，其中， r1选自-h或-ch3，r2选自-oh或-och3，r4选自-h或-och3，r7选自-h或-oh，r8选自-oh或-och3。
[0089][0090]
根据本发明优选的实施方式，式
ⅵ
所示的黄烷类化合物选自7-羟基-4
′-
甲氧基黄烷 (化合物9)、(2r)-7,4
′-
二羟基-8-甲基黄烷(化合物10)、4
′-
羟基-5,7-二甲氧基-8甲基黄烷(化合物11)、(2r)-4
′-
羟基-5,7-二甲氧基黄烷(化合物12)、(2r)-7,3
′-
二羟基
ꢀ-4′-
甲氧基-8-甲基黄烷(化合物13)、(2r)-5,7-二羟基-4
′-
甲氧基-8-甲基黄烷(化合物 14)或
(2r)-7,3
′-
二羟基-4
′-
甲氧基黄烷(化合物15)中的任一种或几种。
[0091]
本发明中，所述化合物9～15对胃癌、肺癌、肝癌、结肠癌、宫颈癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、神经胶质瘤、卵巢癌和膀胱癌均具有抑制作用，且各化合物对各肿瘤的针对性有所不同。根据本发明的一个优选的实施方式，所述黄烷类化合物为化合物9，且所述肿瘤选自肝癌、宫颈癌、胰腺癌、乳腺癌和神经胶质瘤的至少一种。根据本发明的一个优选的实施方式，所述黄烷类化合物为化合物10，且所述肿瘤选自胃癌、肝癌和神经胶质瘤的至少一种。根据本发明的一个优选的实施方式，所述黄烷类化合物为化合物11，且所述肿瘤选自胃癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤和神经胶质瘤的至少一种。根据本发明的一个优选的实施方式，所述黄烷类化合物为化合物12，且所述肿瘤选自胃癌、肺癌、宫颈癌、黑色素瘤和神经胶质瘤的至少一种。根据本发明的一个优选的实施方式，所述黄烷类化合物为化合物14，且所述肿瘤选自胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、神经胶质瘤和膀胱癌的至少一种。根据本发明的一个优选的实施方式，所述黄烷类化合物为化合物15，所述肿瘤选自胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌和膀胱癌的至少一种。
[0092]
本发明中，化合物10、12～15均为r型异构体，其抑制肿瘤细胞增殖的活性均显著高于各自相应的s构型。特别是化合物13，对多种肿瘤细胞增殖的抑制效果均十分显著，且明显高于其s型异构体。
[0093]
本发明中，优选地，所述黄烷类化合物选自化合物3、11～15中的一种或多种，所述化合物抗肿瘤效果更佳。更优选地，所述黄烷类化合物选自化合物12～15中的一种或多种，所述化合物抗肿瘤效果显著。
[0094]
根据本发明的一个特别优选的实施方式，所述黄烷类化合物为化合物13，且所述肿瘤选自胃癌、肝癌、结肠癌、宫颈癌、神经胶质瘤中的至少一种，更优选为肝癌。本发明对大量黄烷类化合物进行了抗肿瘤活性筛选实验，发现上述化合物1～15对多种肿瘤细胞均表现出抑制肿瘤细胞生长的活性，普适性强，且具有较强的肿瘤细胞毒性作用。而多种其他黄烷类化合物，即使结构类似，抗肿瘤活性也较差，有一部分甚至不表现出肿瘤细胞毒性作用；还有些仅针对某几种肿瘤细胞系表现出肿瘤细胞毒性作用，对大部分肿瘤细胞系均不表现出肿瘤细胞毒性作用，普适性较差。例如化合物10的s型光学异构体、化合物13的s型光学异构体、化合物16(如式
ⅶ
所示)等，均存在活性差及普适性差的问题。
[0095][0096]
本发明中，所述抗肿瘤的药物可以为原料药，也可以为药物制剂。
[0097]
本发明中，所述药物可以形成抗肿瘤的药物制剂；所述药物制剂包含所述黄烷类化合物，还包含药学上可接受的辅料。
[0098]
本发明中，所述药物制剂可以所述黄烷类化合物作为唯一活性成分；也可以包含其他具有抗肿瘤的活性成分。优选地，所述药物制剂以所述黄烷类化合物作为唯一活性成分。
[0099]
本发明中，所述药物制剂的剂型不限，可以为片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、口服液、注射剂等。所述药物制剂还可以包含药学上可接受的辅料。所述药学上可接受的辅料的种类不做限制。辅料可以为填充剂、矫味剂、润滑剂等。填充剂又称稀释剂，例如小麦淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、糊精、乳糖等。矫味剂的实例包括但不限于蔗糖素、异麦芽酮糖、阿斯巴甜、安赛蜜等。润滑剂实例包括但不限于硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶、月桂醇硫酸镁等。
[0100]
以下通过具体制备例和实施例说明本发明的技术效果。
[0101]
制备例1-化合物2、3的制备
[0102]
将7-羟基-2,5-二甲氧基-6-甲基黄烷消旋体进行手性拆分，分别获得相应化合物的r 型和s型化合物，即化合物2和3。采用半制备液相色谱进行制备。型号：shimadzu lc-20at(日本岛津公司)，手性色谱柱：chiralpak ia 5μm，4.6mm
×
150mm，旋光检测器：rudolph autopol iv全自动旋光仪(美国鲁道夫公司)。制备条件如下：
[0103]
流动相：乙醇-正己烷10:90；
[0104]
流速：0.5ml/min。
[0105]
制备例2-化合物4、5的制备
[0106]
将7-羟基-2,5-二甲氧基-6,8-二甲基黄烷消旋体进行手性拆分，分别获得相应化合物的r型和s型化合物，即化合物4和5。采用半制备液相进行制备。型号：岛津lc-20at (日本岛津公司)，手性色谱柱：chiralpak ia 5μm，4.6mm
×
150mm，旋光检测器：rudolph autopol iv全自动旋光仪(美国鲁道夫公司)。
[0107]
制备条件如下：
[0108]
流动相：乙醇-正己烷15:85；
[0109]
流速：0.5ml/min。
[0110]
制备例3-化合物10、12、13、14和15的制备
[0111]
分别将化合物10、12、13、14和15相应的消旋体进行手性拆分，分别获得相应化合物的r型和s型化合物，其中的r型化合物即为上述化合物10、12、13、14和 15。
[0112]
仪器：shimadzu lc-20a(日本岛津公司)，色谱柱：superchiral s-ad(上海勤路生物技术有限公司),0.46cm
×
15cm,5um，柱温：35℃，流动相：meoh/fomic acid＝ 100/0.05(v/v)，紫外检测波长：220nm，旋光检测器：advanced laser polarimeter
@
670nm (pdr-separations llc)，流速：0.5ml/min。
[0113]
以化合物13的拆分结果为例，其手性拆分结果见图1～图3。图2的峰为r构型化合物，图3的峰为s构型化合物，两个构型纯度均>98％。拆分完成后，经核磁共振和单晶衍射验证，结构及构型准确。单晶衍射结果见图4和图5。图4为r构型，图5 为s构型。化合物10、12、14、15的消旋体进行手性拆分后，均得到相应的r构型和 s构型化合物，经核磁共振和单晶衍射验证，结构及构型准确，这里不再一一描述。
[0114]
制备例4-化合物7、8的制备
[0115]
将麒麟竭的果实(4.1kg)粉碎后，依次用浓度为95％、70％和50％的乙醇水溶液提取2次，回收溶剂后合并，得到血竭总提取物。将所述血竭总提物用水分散，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取，最终得到石油醚部位(24.6g)、乙酸乙酯部位(682.6g)和水部位(368.9g)。乙酸乙酯部位依次用石油醚-乙酸乙酯(10:1～1:3)、二氯甲烷-甲醇(20:1～0:1)洗脱，得
到18个流分(fr.a～r)，经鉴定其中fr.g流份为黄烷聚集部位。fr.g通过sephadex lh-20柱色谱分离，洗脱条件ch2cl2-meoh(体积比50:50)，得到5个流份，分别为fr.g1～g5。其中的fr.g2经半制备液相纯化，流动相为乙腈
-ꢀ
水(体积比为65:35)，得到化合物7(3.5mg，t
r 13.5min)。fr.g3经半制备液相纯化，流动相为乙腈-水(体积比70:30)，得到化合物8(4.2mg，t
r 17.3min)。化合物7和8的核磁共振图谱见图6-9。
[0116]
实施例1
[0117]
1.实验材料及测定指标
[0118]
dmem基础培养基、1640基础培养基、mccoy
′
s 5a基础培养基、胎牛血清、青霉素链霉素混合液、0.25％胰蛋白酶-edta购自美国corning公司。
[0119]
二甲基亚砜dmso、mtt试剂购自美国sigma公司。
[0120]
人胃癌细胞系hgc-27、mgc-803、sgc-7901，人肺癌细胞系nci-h1299、 nci-h358，人肝癌细胞系hepg2、sk-hep-1，人结肠癌细胞系hct-116、ht29，人宫颈癌细胞系hela，人胰腺导管上皮癌细胞系panc-1，人黑色素瘤细胞系a875，人乳腺癌细胞系mcf-7，人神经胶质瘤细胞系h4，人卵巢癌细胞系sk-ov-3、caov-3，人膀胱癌细胞系t24购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。其中mgc-803、 hepg2、sk-hep-1、ht29、panc-1、a875、mcf-7、h4、caov-3、t24细胞用dmem 完全培养基培养(含有10％的fbs、100u/ml青霉素、100g/ml链霉素)，hgc-27、 sgc-7901、nci-h1299、nci-h358、hela细胞用1640完全培养基培养(含有10％的 fbs、100u/ml青霉素、100g/ml链霉素)，hct-116、sk-ov-3细胞用mccoy
′
s 5a完全培养基培养(含有10％的fbs、100u/ml青霉素、100g/ml链霉素)，细胞培养条件为37℃，5％co2，饱和湿度培养。
[0121]
雄性balb/c裸鼠：18-22g，年龄4-5周，购于北京维通利华公司。
[0122]
2.实验方法
[0123]
2.1 mtt法细胞增殖实验
[0124]
取对数生长期的上述各肿瘤细胞，分别制备细胞悬液，调整细胞数量为2
×
104个 /ml，加入96孔板，每孔100μl。细胞培养24小时使其完全贴壁，将黄烷类化合物1～15、化合物13的s构型异构体、化合物10的s构型异构体以及化合物16的母液用完全培养基稀释成不同浓度的工作液，每个浓度设置6个复孔。分别于加药48小时后，析出孔板中原来的培养基，将5mg/ml mtt试剂用基础培养基配成10％的浓度并加入到96 孔板中，将孔板放在37℃细胞培养箱中孵育4个小时。而后取出，每孔加入150μl dmso 溶解震摇10min，于570nm波长下用酶标仪测定其od值(optical density)，并以公式计算各组的抑制率。
[0125]
细胞增殖抑制率(％)＝(1－实验组平均od值/空白对照组平均od值)
×
100％。
[0126]
2.2裸鼠移植瘤模型给药实验
[0127]
将人肝癌hepg2细胞培养至对数生长期，用不含edta的0.25％胰酶消化，pbs 洗涤细胞两次，1000rpm离心5min，pbs调整细胞悬液浓度至2
×
107/ml，每只裸鼠项肩部皮下注射0.2ml。待肿瘤体积达到100-200mm3时将裸鼠随机平均分为两组，每组8只，分别设为空白对照组和化合物13治疗组。空白对照组每天腹腔注射同体积的空白溶剂，化合物13治疗组每天腹腔注射20mg/kg。每日观察精神、饮食、活动、大小便等一般情况，每隔两天称量裸鼠体重，用游标卡尺测量瘤体最大长度(a)、宽度 (b)，根据公式v＝ab2/2，计算肿瘤体积变化倍数，计算抑瘤率。
[0128]
抑瘤率＝(1-治疗组肿瘤体积变化倍数/空白组肿瘤体积变化倍数)
×
100％。
[0129]
3.实验结果
[0130]
3.1化合物13对肿瘤细胞的增殖抑制作用
[0131]
化合物13(即r构型的光学异构体)能够抑制多种人肿瘤细胞的增殖，但其s构型的光学异构体则对多种人肿瘤细胞的增殖抑制作用不明显或无效。
[0132]
采用mtt法分别测定了0.2μm～1.0μm浓度下的化合物13对人胃癌细胞系hgc-27、mgc-803，人肺癌细胞系nci-h1299、nci-h358，人肝癌细胞系hepg2、 sk-hep-1，人结肠癌细胞系hct-116、ht29，人宫颈癌细胞系hela，人胰腺导管上皮癌细胞系panc-1，人黑色素瘤细胞系a875，人乳腺癌细胞系mcf-7，人神经胶质瘤细胞系h4，人卵巢癌细胞系sk-ov-3、caov-3，人膀胱癌细胞系t24增殖活性的影响, 结果如表1所示。随着药物浓度的增加，增殖抑制率显著上升。由此，化合物13对多种肿瘤细胞有明显的增殖抑制作用。
[0133]
化合物13的s构型的光学异构体对人胃癌细胞系hgc-27、mgc-803，人肝癌细胞系hepg2增殖活性显示抑制作用，但即便加大浓度，其活性依然远低于化合物13，且对多种人肿瘤细胞的增殖抑制作用微弱或基本无效，结果如表2所示。
[0134]
表1化合物13对多种肿瘤细胞的增殖抑制率
[0135][0136]
表2化合物13的s型异构体对肿瘤细胞的增殖抑制率
[0137][0138]
3.2化合物1～12、14～15、化合物10相应的s构型异构体和化合物16的抗肿瘤作用
[0139]
采用mtt法分别测定了5μm～20μm浓度下，黄烷类化合物1～12、14～15、化合物10相应的s构型异构体和化合物16对人胃癌细胞系hgc-27、mgc-803，人肺癌细胞系nci-h1299、nci-h358，人肝癌细胞系hepg2、sk-hep-1，人结肠癌细胞系hct-116、ht29，人宫颈癌细胞系hela，人胰腺导管上皮癌细胞系panc-1，人黑色素瘤细胞系a875，人乳腺癌细胞系mcf-7，人神经胶质瘤细胞系h4，人卵巢癌细胞系 sk-ov-3、caov-3，人膀胱癌细胞系t24增殖活性的影响，结果如表3所示。随着药物浓度的增加，其增殖抑制率显著上升。由此可以看出，黄烷类化合物1～12、14～15对上述全部肿瘤细胞有明显的增殖抑制作用。而化合物10的s构型异构体和化合物16 则仅对其中几种肿瘤细胞显示出了抑制作用，且抑制率较低，对其余肿瘤细胞则不显示抑制作用，具体结果见表17和表18。
[0140]
表3化合物1对肿瘤细胞的增殖抑制率
[0141][0142]
表4化合物2对肿瘤细胞的增殖抑制率
[0143]
[0144][0145]
表5化合物3对肿瘤细胞的增殖抑制率
[0146][0147]
表6化合物4对肿瘤细胞的增殖抑制率
[0148][0149][0150]
表7化合物5对肿瘤细胞的增殖抑制率
[0151][0152]
表8化合物6对肿瘤细胞的增殖抑制率
[0153][0154]
表9化合物7对肿瘤细胞的增殖抑制率
[0155]
[0156][0157]
表10化合物8对肿瘤细胞的增殖抑制率
[0158][0159]
表11化合物9对肿瘤细胞的增殖抑制率
[0160][0161][0162]
表12化合物10对肿瘤细胞的增殖抑制率
[0163][0164]
表13化合物11对肿瘤细胞的增殖抑制率
[0165]
[0166][0167]
表14化合物12对肿瘤细胞的增殖抑制率
[0168][0169]
表15化合物14对肿瘤细胞的增殖抑制率
[0170]
[0171][0172]
表16化合物15对肿瘤细胞的增殖抑制率
[0173][0174]
表17化合物10的s型异构体对肿瘤细胞的增殖抑制率
[0175][0176][0177]
表18化合物16对肿瘤细胞的增殖抑制率
[0178][0179]
3.3化合物13的体内抗肿瘤活性
[0180]
将约2
×
106个人肝癌hepg2细胞接种于裸鼠皮下(0.2ml)，待肿瘤体积生长至 100-200mm3左右时，腹腔注射给药化合物13，用量20mg/kg，每天一次，定期观察，测定肿瘤的生长情况。结果如表19所示，化合物13能够有效抑制肝癌hepg2细胞的体内成瘤能力，其肿瘤抑制率为35.46％。体重数据如表20所示，化合物13没有明显改变裸鼠的体重。
[0181]
表19化合物13对人肝癌hepg2细胞的抗肿瘤作用
[0182][0183]
表20化合物13对裸鼠的体重的影响
[0184][0185]
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。