一种菟丝子发酵活性提取液的制备方法和应用与流程

1.本发明涉及一种菟丝子发酵活性提取液的制备方法和应用，属于化妆品技术领域。


背景技术：

2.菟丝子为旋花科植物，寄生在其他植物之上，其干燥的成熟种子常被用于中药复配。菟丝子作为一味中药，所含化学物质种类繁多，主要包括黄酮、多糖、甾醇类、香豆素、蛋白质、氨基酸、脂肪酸等天然护肤因子，具有较强的抗氧化、抗衰老的功效。
3.基于天然化妆品原料在市场中的需求日益上升，目前用于提取菟丝子中活性成分的方法为水提法或有机溶剂提取法，极少有涉及利用发酵的方法制备菟丝子活性提取物的研究与报道。采用水提法或有机溶剂提取法提取菟丝子活性物质时，原料长时间处于70℃以上的较高温状态，破坏菟丝子主活性成分，同时存在着耗能高、提取率低、废水排放量大、提取液气味不佳、颜色稳定性差等一系列问题。现有技术急需一种耗能低、提取率高、无污染，稳定并且不破坏菟丝子生物活性成分的方法来满足现有技术的不足。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是：目前提取菟丝子活性物质的方法存在耗能高、提取率低、废水排放量大且提取液活性成分含量低、气味不佳、颜色稳定性差等问题。
5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种菟丝子发酵活性提取液的制备方法，包括以下步骤：
6.步骤1：将布氏乳杆菌接入种子培养基中进行活化培养，得到种子培养液；
7.步骤2：将菟丝子粉配制成发酵培养基；
8.步骤3：在发酵培养基中接入种子培养液，进行发酵培养，得到发酵混合液；
9.步骤4：将发酵混合液经过滤除渣除菌后，收集滤液，在所述滤液中加入多元醇并调节ph值，即得菟丝子发酵活性提取液。
10.优选地，所述步骤1中的布氏乳杆菌为布氏乳杆菌mf060，其保藏编号为：cgmcc no.19125，分类命名为：布氏乳杆菌mf060，拉丁文名称为：lactobacillus buchneri，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2019年12月12日。
11.优选地，所述步骤1中种子培养基的配方为：葡萄糖0.4wt％，酪蛋白0.4wt％，磷酸氢二钾0.04wt％，磷酸二氢钾0.04wt％，硫酸镁0.01wt％，硫酸锰0.005wt％，以及余量的水，ph值为6.2
±
0.2；所述种子培养基在使用前进行灭菌处理。
12.优选地，所述步骤1中活化培养的方式为静置培养，温度为37℃，时间为12～24h。
13.优选地，所述步骤2中配制的发酵培养基的成分包括：菟丝子粉0.1
‑
2.0wt％，葡萄糖0.1
‑
2.0wt％，酪蛋白0.001
‑
0.04wt％，维生素c 0.001
‑
0.01wt％，以及余量的水；所述菟丝子粉的粒径为60～100目；所述发酵培养基在使用前进行灭菌处理。
no.19125，分类名：布氏乳杆菌，拉丁名：lactobacillus buchneri。
32.实施例1
33.一种菟丝子发酵活性提取液的制备方法，包括以下步骤：
34.1)种子培养基的制备
35.按照质量分数，分别称取葡萄糖0.4％，酪蛋白0.4％，磷酸氢二钾0.04％，磷酸二氢钾0.04％，硫酸镁0.01％，硫酸锰0.005％，其余用水补足，将ph值调节至6.2
±
0.2，高压蒸汽灭菌15min后，冷却至室温。
36.2)布氏乳杆菌种子液的制备
37.向1)得到的培养基中接入保藏菌种布氏乳杆菌cgmcc no.19125在37℃下活化培养24h，制得活化后的种子培养液。
38.3)发酵培养基的制备
39.将菟丝子粉碎过100目筛，获得菟丝子粉。本发酵体系包含0.1wt％菟丝子粉、2wt％葡萄糖、0.04wt％酪蛋白、0.01wt％维生素c，其余用水补足，充分摇匀后于121℃、15min灭菌。
40.4)发酵
41.将布氏乳杆菌种子培养基活化后稀释定量为1
×
109cfu/ml的种子菌液。向发酵培养基中加入质量为发酵体系质量的0.5wt％的种子菌液，30℃发酵72h。
42.5)提取
43.将步骤4)获得的发酵物依次采用40μm、5μm、1μm、0.45μm、0.22μm的滤膜逐级过滤除渣除菌获得发酵滤液和滤渣，在滤液中加入滤液质量5.1％的丙三醇，并调节ph值至5.0
‑
6.0，即得菟丝子发酵活性提取液。滤渣可采用超声波剪切破碎菌体、均质后制成泥膜。
44.实施例2
45.一种菟丝子发酵活性提取液的制备方法，包括以下步骤：
46.1)种子培养基的制备
47.方法如实施例1。
48.2)布氏乳杆菌种子液的制备
49.向1)得到的培养基中接入保藏菌种布氏乳杆菌cgmcc no.19125在37℃下活化培养24h，制得活化后的种子培养液。
50.3)发酵培养基的制备
51.将菟丝子粉碎过80目筛，获得菟丝子粉。本发酵体系包含1wt％菟丝子粉、1wt％葡萄糖、0.002wt％酪蛋白、0.005wt％维生素c，其余用水补足，充分摇匀后于121℃、15min灭菌。
52.4)发酵
53.将布氏乳杆菌种子培养基活化后稀释定量为1
×
109cfu/ml的种子菌液。向发酵培养基中加入质量为发酵体系质量的1.5wt％的种子菌液，37℃发酵24h。
54.5)提取
55.将步骤4)获得的发酵物依次采用40μm、5μm、1μm、0.45μm、0.22μm的滤膜逐级过滤除渣除菌获得发酵滤液和滤渣，在滤液中加入滤液质量5.3％的丁二醇，并调节ph值至5.0
‑
6.0，即得菟丝子发酵活性提取液。滤渣可采用超声波剪切破碎菌体、均质后制成泥膜。
56.实施例3
57.一种菟丝子发酵活性提取液的制备方法，包括以下步骤：
58.1)种子培养基的制备
59.方法如实施例1。
60.2)布氏乳杆菌种子液的制备
61.向1)得到的培养基中接入保藏菌种布氏乳杆菌cgmcc no.19125在37℃下活化培养24h，制得活化后的种子培养液。
62.3)发酵培养基的制备
63.将菟丝子粉碎过60目筛，获得菟丝子粉。本发酵体系包含2wt％菟丝子粉、0.1wt％葡萄糖、0.001wt％酪蛋白、0.001wt％维生素c，其余用水补足，充分摇匀后于121℃、15min灭菌。
64.4)发酵
65.将布氏乳杆菌种子培养基活化后稀释定量为1
×
109cfu/ml的种子菌液。向发酵培养基中加入质量为发酵体系质量的3wt％的种子菌液，40℃发酵12h。
66.5)提取
67.将步骤4)获得的发酵物依次采用40μm、5μm、1μm、0.45μm、0.22μm的滤膜逐级过滤除渣除菌获得发酵滤液和滤渣，在滤液中加入滤液质量5.6％的丙二醇，并调节ph值至5.0
‑
6.0，即得菟丝子发酵活性提取液。滤渣可采用超声波剪切破碎菌体、均质后制成泥膜。
68.对比例1
69.水提法制备菟丝子提取液：
70.将菟丝子粉碎后过100目筛，获得100目的菟丝子粉末。称取水提体系质量的0.1wt％菟丝子粉末，其余用水补足，100℃回流3h。提取结束后，上清液用孔径为0.22μm滤膜除去植物残渣，在滤液中加入滤液质量5.6％的己二醇，并调节ph值至5.0
‑
6.0，制成菟丝子提取液。
71.对比例2
72.水提法制备菟丝子提取液：
73.将菟丝子粉碎后过80目筛，获得80目的菟丝子粉末。称取水提体系质量的1wt％菟丝子粉末，其余用水补足，100℃回流3h。提取结束后，上清液采用孔径为0.22μm滤膜除去植物残渣，在滤液中加入滤液质量5.6％的丙三醇，并调节ph值至5.0
‑
6.0，制成菟丝子提取液。
74.对比例3
75.水提法制备菟丝子提取液：
76.将菟丝子粉碎后过60目筛，获得60目的菟丝子粉末。称取水提体系质量的2wt％菟丝子粉末，其余用水补足，100℃回流3h。提取结束后，上清液采用孔径为0.22μm滤膜除去植物残渣，在滤液中加入滤液质量5.6％的丙二醇，并调节ph值至5.0
‑
6.0，制成菟丝子提取液。
77.将实施例1
‑
3制备的菟丝子发酵提取液和对比例1
‑
3制备的菟丝子水提液分别进行多糖含量、多糖分子量大小、黄酮含量、氨基酸含量和蛋白质含量的测定。
78.检测方法如下：
79.1、多糖含量的测定：
80.参考标准：sn/t 2409
‑
1998。
81.2、多糖分子量大小的测定：
82.采用凝胶渗透色谱进行菟丝子多糖分子量大小的测定。采用乙酸
‑
乙酸钠为流动相，流速0.8ml/min，温度25℃。分别采用分子量为400kda、200kda、100kda、80kda、40kda及10kda的葡聚糖进行标准曲线的制作，并测定实施例1
‑
3的菟丝子发酵提取液与对比例1的菟丝子水提液中菟丝子多糖分子量的大小。测得多糖分子量标准曲线为：y＝10
(0.8t 9.762)
。其中y为相应多糖样品分子量大小，t为相应多糖出峰时间。
83.3、黄酮含量的测定：
84.1)标准溶液配制
85.精密称取芦丁对照品0.06g，加60％甲醇适量，置于超声锅中超声溶解，静置至室温，以60％甲醇定容于100ml容量瓶中，摇匀备用，配成芦丁含量为0.06wt％的标准溶液，备用。
86.2)标准曲线的制作
87.加2.5ml不同稀释倍数的标准液，加400μl 5wt％nano2，静置5min，加400μl10wt％al(no3)3，静置6min，加600μl 10wt％naoh，静置6min，30％乙醇定容至10ml，静置10min，510nm处测吸光度。
88.3)待测样的检测
89.将2)中标准液改成待测液即可。
90.4、氨基酸含量的测定：
91.参考标准：qb/t 2409
‑
1998。
92.5、蛋白质含量的测定：
93.参考标准：gb/t 6432
‑
2018。
94.对实施例1
‑
3与对比例1
‑
3进行上述测试，其具体数据如表1所示。
95.表1实施例1
‑
3与对比例1
‑
3的测试结果
[0096][0097][0098]
实施例1
‑
3与对比例1凝胶色谱图如图1～4所示。
[0099]
实施例4
[0100]
一种保湿修复抗氧化护肤水，成分包括以质量分数计的水80％、菟丝子发酵提取液10％、甘油5％、丙二醇2％、戊二醇2％、水溶性维生素e 0.5％、透明质酸钠0.1％、乙基己基甘油0.1％和柠檬酸钠0.3％。
[0101]
上述的保湿修复抗氧化护肤水的制备方法为：
[0102]
将水、甘油、丙二醇、戊二醇、水溶性维生素e、透明质酸钠、乙基己基甘油、柠檬酸钠加入水相锅中，加热至80℃，保温搅拌溶解均匀；降温至40℃，加入菟丝子发酵提取液搅拌均匀，获得保湿修复抗氧化护肤水。
[0103]
实施例5
[0104]
一种保湿美白抗氧化护肤水，成分包括以质量分数计的水70％、菟丝子发酵提取液20％、甘油5％、丙二醇2％、戊二醇2％、白藜芦醇0.5％、透明质酸钠0.1％、乙基己基甘油0.1％和柠檬酸钠0.3％。
[0105]
上述的保湿美白抗氧化护肤水制备方法为：
[0106]
将水、甘油、丙二醇、戊二醇、白藜芦醇、透明质酸钠、乙基己基甘油、柠檬酸钠加入水相锅中，加热至80℃，保温搅拌溶解均匀；降温至40℃，加入菟丝子发酵提取液搅拌均匀，获得保湿美白抗氧化护肤水。
[0107]
对比例4
[0108]
一种植物保湿护肤水，成分包括以质量分数计的水70％、菟丝子发酵提取液20％、甘油5％、丙二醇2％、戊二醇2％、白藜芦醇0.5％、水溶性纤维素e 0.5％、透明质酸钠0.1％、乙基己基甘油0.1％和柠檬酸钠0.3％。
[0109]
上述的植物保湿护肤水的制备方法为：
[0110]
将水、甘油、丙二醇、戊二醇、白藜芦醇、水溶性微生物e、透明质酸钠、乙基己基甘油、柠檬酸钠加入水相锅中，加热至80℃，保温搅拌溶解均匀；降温至40℃，加入菟丝子发酵提取液搅拌均匀，获得植物保湿护肤水。
[0111]
将实施例4
‑
5和对比例4制备的护肤水进行如下测试：
[0112]
1、脂肪氧化酶检测：
[0113][0114]
试剂配制：
[0115]
lox酶：1体积5
‑
lox酶加50体积蒸馏水。
[0116]
底物：将吐温20以0.5ml/l浓度分散于0.2mol/l硼酸缓冲液中，再以0.54ml/l浓度加入亚油酸(亚油酸纯度＞99％)，混匀后用1mol/l氢氧化钠调节缓冲液ph为9.0。
[0117]
采用以下公式计算脂氧合酶抑制率：
[0118][0119]
2、酪氨酸酶抑制率检测：
[0120]
试剂配制：
[0121]
1)ph6.8 pbs溶液的配制：
[0122]
取0.2mol/l na2hpo4
·
12h2o 154.5ml加入0.1mol/l一水柠檬酸45.5ml，配制成200ml ph为6.8的pbs溶液；
[0123]
2)酪氨酸酶溶液：用ph6.8 pbs配制浓度为100u/ml的酪氨酸酶溶液，现配现用。
[0124]
3)左旋多巴溶液：用ph6.8 pbs配制浓度为1mg/ml的左旋多巴溶液，避光保存。
[0125]
[0126]
依次加入样品溶液、pbs溶液与酪氨酸酶溶液后于37℃水域中孵育10min；添加左旋多巴溶液，反应5min后快速于475nm波长下测定吸光值，采用以下公式计算酪氨酸酶抑制率：
[0127][0128]
3、hacat细胞毒试验：
[0129]
步骤1：将hacat细胞以105cell/ml的浓度接种于96孔板中，每孔加入100μl(104cell/孔)细胞悬液。
[0130]
步骤2：将96孔板放在培养箱中孵育24小时(37℃，5％co2)使细胞贴壁生长。加入10μl不同浓度(0.025、0.05、0.1、0.15、0.2mg/ml)的混合样品溶液，对照组加入10μl空白细胞培养液，每个组做3
‑
6个重复，结果取平均值。
[0131]
步骤3：继续将96孔板放在培养箱(37℃，5％co2)中孵育48小时后取出。向每孔加入10μl cck
‑
8溶液。
[0132]
步骤4：再将96孔板放在培养箱(37℃，5％co2)中孵育2小时后取出。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0133]
根据下列公式计算细胞活性：
[0134][0135]
上述测试结果如表2所示：
[0136]
表2实施例4
‑
5和对比例4制备的护肤水的测试结果
[0137]
样品脂肪氧化酶抑制率(％)酪氨酸酶抑制率(％)细胞活性(％)实施例418.2457.4898.4实施例519.3667.3997.8对比例49.4634.2595.3
[0138]
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。