一种诊疗一体化的凋亡小体及其制备方法与流程

1.本发明属于材料技术领域，具体涉及一种诊疗一体化的凋亡小体及其制备方法。


背景技术：

2.癌症又被称为恶性肿瘤，治愈起来非常的困难，而且是生长在身体中的定时炸弹，生长速度快，一旦爆发，势必会危及到生命健康。恶性肿瘤已经成为严重威胁中国人群健康的主要公共卫生问题之一，防控形势严峻。根据世界卫生组织国际癌症研究中心发布的2020年全球最新癌症负担数据，2020年全球新发癌症病例1929万例，其中中国新发癌症病例为457万例，占全球23.7％，居全球第一。2020年全球癌症死亡病例996万例，其中中国癌症死亡人数300.3万人，占癌症死亡总人数30.2％，居全球第一。早筛早诊早治是提高癌症患者术后五年生存率的重要手段。肿瘤早筛是指用快速、简便的方法，从大量看起来健康、尚未出现症状的目标人群中筛选出极少数肿瘤高危群体，可以及早发现肿瘤、降低发病风险，尤其是发病率和死亡率高、发展周期长的癌种，比如肺癌、胃癌、结直肠癌等。根据世界卫生组织数据，三分之一的癌症可以通过早期发现得到治疗。癌症的早期发现可以进行提前干预，明显降低死亡率、延长生存期，因此癌症早筛对癌症治疗的意义重大。传统癌症筛查方式主要分为影像学筛查、内镜筛查及肿瘤标志物筛查三种类型。传统癌症筛查方式存在放射性损害、滞后性、特异性、灵敏度较低等不足。
3.纳米技术的发展为癌症的早筛早诊早治提供了新的成像方法和技术。纳米药物经特定多肽(tat穿膜肽，ctx多肽等)或配体蛋白(转铁蛋白等)修饰后，实现靶向识别肿瘤细胞的功能。目前，纳米药物在肿瘤的精准诊断研究中已得到成功验证，并显示出良好的临床应用前景，但也存在着一些问题：化学修饰易改变配体分子的构象和生物活性，影响探针的药代动力学，降低了探针“接触式”识别肿瘤细胞的能力；因此，迫切需要发展高效靶向识别肿瘤的新药物并用于肿瘤的精准诊疗。


技术实现要素：

4.为了解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的目的在于提供一种诊疗一体化的凋亡小体及其制备方法。
5.为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：一方面，本发明提供了一种诊疗一体化的凋亡小体的制备方法，包括以下步骤：
6.(1)将细胞在含抗肿瘤药物和纳米造影剂的培养基中培养一段时间，因抗肿瘤药物毒性诱导细胞发生凋亡得到凋亡细胞的培养基；
7.(2)将所述凋亡细胞的培养基进行离心得上清液；
8.(3)将所述上清液进行过滤得到滤液；
9.(4)将所述滤液进行离心，得到的沉淀即为诊疗一体化的凋亡小体。
10.进一步地，步骤(1)中所述细胞包括巨噬细胞、免疫细胞、癌细胞或正常细胞。
11.进一步地，步骤(1)中所述抗肿瘤药物包括各种抗癌药物、对细胞有毒性的药物。
12.进一步地，所述对细胞有毒性的药物包括高剂量有毒低剂量无毒的药物。
13.进一步地，步骤(1)中所述细胞培养的时间为1
‑
48h。
14.进一步地，步骤(2)具体为：将凋亡细胞的培养基离心以除去死细胞和细胞碎片，离心后，为去除上清中残留的混杂细胞，再一次取上清重复离心一次。
15.进一步地，步骤(2)中所述离心的条件包括：离心力为500
‑
1500g，离心时间为3
‑
20min。
16.进一步地，步骤(3)中所述过滤采用滤膜，所述滤膜的孔径为2
‑
20μm。
17.进一步地，步骤(4)中所述离心的条件包括：离心力为12000g～180000g，离心时间为18min～23min。
18.进一步地，步骤(4)中所述离心在1
‑
26℃下进行。
19.另一方面，本发明提供了一种诊疗一体化的凋亡小体，其由上述任一所述的诊疗一体化的凋亡小体的制备方法制备得到。
20.本发明的有益效果是：本发明采用抗肿瘤药物诱导细胞形成装载有抗肿瘤药物和纳米造影剂的巨噬细胞凋亡小体，利用血液中单核细胞主动吞噬凋亡小体的特性，将纳米探针(巨噬细胞凋亡小体)搭载到单核细胞上；通过单核细胞自身主动躲避网状内皮系统的截留和清除，延长纳米探针(巨噬细胞凋亡小体)的体内循环时间；在肿瘤干细胞释放的趋化因子的招募下，单核细胞携带抗肿瘤药物和造影剂主动渗透到肿瘤浸润区。这种新型的探针设计思路充分发挥了自身免疫细胞的独特优势，突破了靶向配体和受体“接触式”识别的传统模式。本发明为成像引导肿瘤精准治疗提供新方法和新技术。
21.本发明制备方法获得的巨噬细胞凋亡小体活性高，具有优良的治疗肿瘤的效果，并且毒性低，显示出巨大的临床应用前景。
附图说明
22.图1为本发明实施例1制备得到的诊疗一体化的凋亡小体的荧光显微镜图；
23.图2为本发明实施例1制备得到的诊疗一体化的凋亡小体的靶向性测定实验结果图。
具体实施方式
24.为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限以下实施例。
25.实施例1：诊疗一体化的凋亡小体的制备
26.(1)将巨噬细胞在含抗肿瘤药物(阿霉素)和纳米造影剂(fe3o4)的培养基中培养1
‑
48h，因抗肿瘤药物毒性诱导细胞发生凋亡得到凋亡细胞的培养基；
27.(2)将凋亡细胞的培养基收集在50ml离心管中，在900g下离心10min，以除去死细胞和细胞碎片，离心后，为去除上清中残留的混杂细胞，再一次取上清重复离心一次；
28.(3)慢慢的将上清移至10ml的无菌注射器中，安装滤膜过滤装置，给予轻微压力，缓慢使上清通过5μm的滤膜；
29.(4)离心管收集滤液，放入高速离心机中在4℃下，12000g～180000g离心18min～23min，得到的沉淀即为凋亡小体。
30.将实施例1制备得到的凋亡小体与细胞膜染料dil共孵育后采用荧光显微镜进行观看，如图1所示，从图1可以看到凋亡小体的大小大概是5
‑
10μm。
31.实施例2：检测实施例1制备得到的凋亡小体对肿瘤的靶向效果
32.将处于对数生长期的肿瘤细胞收集，用无血清基质10.0ml，于1500转/分、离心3min，连续洗1
‑
2次；最后用无血清基质混匀，并用血球计数器定量肿瘤细胞数量(平均4个中方格的细胞计数
×
104即是细胞数/毫升)。使用无血清基质将肿瘤细胞密度调至5
×
106个/ml(最少应为2
×
106个/ml)，每只小鼠皮下接种100μl(即5
×
105个肿瘤细胞)，10天左右肿瘤即可使用。
33.尾静脉注射一定量的凋亡小体(细胞膜染料did染凋亡小体的细胞膜)并在不同的时间点观察凋亡小体的分布情况，实验结果如图2所示，从图2可以看出，随着时间的延长，凋亡小体在肿瘤部位的蓄积越多，并在3h时达到最大，随后慢慢降低。说明凋亡小体对肿瘤有很强的靶向性。
34.实施例3：检测实施例1制备得到的凋亡小体的抗肿瘤效果
35.将处于对数生长期的肿瘤细胞收集，用无血清基质10.0ml，于1500转/分、离心3min，连续洗1
‑
2次；最后用无血清基质混匀，并用血球计数器定量肿瘤细胞数量(平均4个中方格的细胞计数
×
104即是细胞数/毫升)。使用无血清基质将肿瘤细胞密度调至5
×
106个/ml(最少应为2
×
106个/ml)，每只小鼠皮下接种100μl(即5
×
105个肿瘤细胞)，10天左右肿瘤即可使用。
36.将24只c6胶质瘤皮下瘤裸鼠随机分4组：(1)凋亡小体，(2)control，(3)空白凋亡小体(采用紫外线诱导产生凋亡小体)，(4)阿霉素组。每组6只。待皮下瘤体积至50mm2时，尾静脉注射一定量的相应物质，间隔2天注射一次，连续注射3次。通过每隔一天测量肿瘤的生长速率来评估不同治疗方法的肿瘤抑制效率。control组与空白凋亡小体组的肿瘤增长最快，且二者之间未见统计学差异，这表明空白凋亡小体不能抑制肿瘤生长。阿霉素组肿瘤前期生长缓慢，后期生长迅速。而凋亡小体组治疗后14天内体积减小，16天时肿瘤开始缓慢增长，在治疗终点，其肿瘤体积与上述三组相比，具有统计学差异，说明凋亡小体能较好的治疗肿瘤。相应地，凋亡小体也延长了小鼠的生存期。此外，治疗组小鼠的体重没有明显波动，说明治疗生物安全性高。
37.以上所述仅为本发明的具体实施方式，不是全部的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。