一种具有抗肿瘤活性的GalNAc/CpG脂质体疫苗、制备方法及应用与流程

一种具有抗肿瘤活性的galnac/cpg脂质体疫苗、制备方法及应用
技术领域
1.本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的糖脂质体疫苗，更具体的，本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的galnac/cpg脂质体疫苗、制备方法及应用。


背景技术：

2.肿瘤疫苗(cancer vaccine)是利用肿瘤相关抗原和免疫佐剂的激活功能，刺激机体产生特异性针对肿瘤的免疫应答，进而有效地杀伤肿瘤，是肿瘤免疫治疗领域有前景的策略。肿瘤相关糖抗原(tumor associated carbohydrate antigens，tacas)来自于肿瘤细胞表面的糖萼结构，是由于细胞在癌变的过程中，糖基转移酶及糖苷酶的功能受限，造成糖蛋白和糖脂等糖缀合物中糖基的改变所形成的变异糖分子，包括以糖蛋白形式存在的连接在丝氨酸或苏氨酸残基上的tn、tf、stn抗原，以及以糖脂形式存在的神经节苷脂、globo类抗原等。tacas区别于蛋白质抗原的优势在于其结构简单，易于修饰，生物相容性好，代谢产物安全无毒。因此，近年来基于tacas的肿瘤疫苗研究一直是研究的热点。然而，大部分tacas是t细胞非依赖的抗原，不能直接结合主要组织相容性复合物mhc去激活t细胞。更重要的是，没有t细胞帮助，单独的tacas只能很弱地激活b细胞产生低抗体滴度的igm。
3.目前基于tacas肿瘤疫苗的研究存在较多局限。tacas具有很强的亲水性，因此许多研究通常将碳水化合物抗原与增强抗原呈递的免疫活性蛋白或肽载体连接一起。然而，蛋白质或多肽载体本身可引起强免疫力并因此抑制对糖抗原的免疫应答，同时疫苗载体合成步骤复杂，疫苗组分难以定性的问题亟待解决，因此在其临床应用中仍然有很大的限制。
4.免疫佐剂(immune adjuvant)是肿瘤疫苗不可或缺的组分，将其和肿瘤抗原联合使用，通过激活固有免疫系统，能够增强免疫应答的强度或改变免疫应答的方式。免疫佐剂激活固有免疫系统主要通过模式识别受体，例如toll样受体(tlrs)和c
‑
型凝集素受体(clrs)等。cpg寡脱氧核苷酸(cpg oligodeoxynucleotide，cpg odn)是tlr9激动剂，一般由20个左右的核苷酸组成，序列中含cg碱基序列。cpg odn的免疫学功能非常多样化，不但能够激活固有免疫抵抗病原体感染，还能够增强th1免疫应答减缓过敏性疾病。此外，cpg odn还能够显著地刺激b细胞产生抗体，增强杀伤性t细胞和nk细胞的抗肿瘤能力，因此在肿瘤疫苗和免疫治疗中具有重要的地位。
5.近年来，随着纳米科学的发展，纳米材料逐渐成为肿瘤疫苗研发的重要方向。鉴于大分子组装体在调控材料结构与性能方面的优势，以及在小分子药物、基因装载与控释方面取得的成就，利用自组装手段构建新型肿瘤疫苗成为研究的热点领域。
6.相关的研究表明，基于tacas的肿瘤疫苗能够显著地诱导机体产生多种免疫保护机制，不局限于特异性抗体，还包括针对肿瘤的t细胞免疫应答。


技术实现要素：

7.本发明目的在于提供一种具有较好抗肿瘤活性的肿瘤相关糖抗原tn的脂质体疫
苗，针对于蛋白质或多肽载体的免疫力，利用tn抗原(galnac)修饰的胆固醇材料，通过薄膜
‑
超声的方法构建了内部包载cpg odn免疫佐剂的脂质体疫苗，本发明的目的在于提供一种功能性糖纳米疫苗，并同时从体液免疫和细胞免疫两个方面评估了该脂质体疫苗的抗肿瘤功能，希望为基于tacas肿瘤疫苗的研发提供新的研究思路。
8.本发明产品galnac/cpg liposome疫苗，可以特异性利用肿瘤相关糖抗原tn(galnac)作为抗原，免疫佐剂cpg odn作为激动剂，从而激活机体免疫系统产生针对tn抗原的高亲和性抗体并激活t细胞的功能，发挥抗肿瘤作用。
9.具体而言，本发明采用的技术方案如下：
10.本发明提供一种具有抗肿瘤活性的galnac/cpg脂质体疫苗，其包含tn抗原galnac、胆固醇和核酸佐剂cpg odn；其是利用tn抗原galnac修饰的胆固醇chol
‑
galnac作为原料，通过薄膜
‑
超声的方法构建内部包载cpg odn的脂质体疫苗；其中：chol
‑
galnac的化学结构式如下：
[0011][0012]
cpg odn的核酸序列为5
’‑
tccatgacgttcctgatgct
‑3’
。
[0013]
本发明中，薄膜
‑
超声方法如下：先将dopc、dppc和chol
‑
galnac溶于有机溶剂中，通入惰性气氛旋转干燥成均匀膜，真空干燥去除多余溶剂，获得脂膜；接着将脂膜和cpg odn搅拌重悬于pbs缓冲液中，室温下水合制备galnac/cpg脂质体疫苗。
[0014]
本发明还提供一种根据上述的具有抗肿瘤活性的galnac/cpg liposome疫苗在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用；
[0015]
本发明中，肿瘤为乳腺癌。
[0016]
本发明中，抗肿瘤脂质体galnac/cpg liposome作为抗肿瘤疫苗的应用，其溶于生理盐水后直接注射使用。
[0017]
进一步的，本发明提供一种上述的具有抗肿瘤活性galnac/cpg liposome疫苗的制备方法，具体步骤如下：
[0018]
(1)以胆固醇甲酰氯chol
‑
cocl、2
‑
叠氮基乙醇为原料，通过酯化反应制备chol
‑
c2‑
n3，chol
‑
c2‑
n3的结构式为
[0019]
(2)以chol
‑
c2‑
n3、galnac
‑
yne为原料，在cubr催化下通过click反应制备chol
‑
galnac复合物；其中：galnac
‑
yne的结构式为
[0020]
(3)薄膜
‑
超声法制备包载cpg odn的脂质体疫苗：先将dopc、dppc和chol
‑
galnac
溶于有机溶剂中，通入惰性气氛旋转干燥成均匀膜，真空干燥去除多余溶剂，获得脂膜；接着将脂膜和cpg odn搅拌重悬于pbs缓冲液中，室温下水合制备galnac/cpg脂质体疫苗。
[0021]
和现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0022]
1、本发明针对于蛋白质或多肽载体的免疫原性强，利用低免疫原性和生物可降解特性的胆固醇作为载体，通过薄膜
‑
超声的方法构建了内部包载cpg odn免疫佐剂的脂质体疫苗。
[0023]
2、本发明所提供的galnac/cpg liposome疫苗合成步骤简单，疫苗组分可以清晰定性。具有抗肿瘤活性的galnac，经过药学上可接受的化学修饰后，在制备抗乳腺癌(4t1)药物中作为主要活性成分发挥作用，包载的cpg odn 1668佐剂没有药学改变，同样作为主要活性成分发挥作用。
[0024]
3、galnac/cpg liposome疫苗尺寸纳米级，且分布窄，具有良好的粒径和稳定性，可以很好地诱导小鼠骨髓来源bmdcs和脾脏b细胞的成熟，诱导小鼠产生特异性抗体，同时可以有效地激活小鼠细胞免疫，从而为基于糖脂质体疫苗的研究和开发提供新的思路和理论基础。
[0025]
4、本发明提供了一种功能性与可生物降解的糖纳米疫苗，并同时从体液免疫和细胞免疫两个方面验证了该脂质体疫苗的抗肿瘤潜力，有望为基于tacas肿瘤疫苗的研发提供新的研究思路。
附图说明
[0026]
图1为chol
‑
c2‑
n
31
h nmr表征。
[0027]
图2为chol
‑
c2‑
n
313
c nmr表征。
[0028]
图3为galnac
‑
yne 1
h nmr表征。
[0029]
图4为galnac
‑
yne
13
c nmr表征。
[0030]
图5为glunac
‑
yne 1
h nmr表征。
[0031]
图6为chol
‑
galnac 1
h nmr表征。
[0032]
图7为chol
‑
glunac 1
h nmr表征。
[0033]
图8为galnac/cpg liposometem图。
[0034]
图9为galnac/cpg liposome促进bmdcs成熟结果图。
[0035]
图10为galnac/cpg liposome促进小鼠脾脏b细胞成熟结果图。
[0036]
图11为galnac/cpg liposome可以特异性与tn抗体结合。
[0037]
图12为galnac/cpg liposome可以诱导小鼠产生针对tn抗原的特异性抗体结果图。
[0038]
图13为galnac/cpg liposome可以诱导小鼠产生体液和细胞免疫结果图。
具体实施方式
[0039]
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
[0040]
实施例中，具有抗肿瘤活性的galnac/cpg liposome疫苗，是基于肿瘤相关tn糖抗
原和胆固醇化学修饰合成的chol
‑
galnac组分用于制备脂质体，并包载佐剂cpg odn1668(简称cpg)；galnac，为乙酰氨基半乳糖，cpg odn 1668核酸序列为：5
’‑
tccatgacgttcctgatgct
‑3’
(20mer)。
[0041]
实施例中，同时合成对照组，采用乙酰氨基葡萄糖glunac，免疫佐剂cpg odn 1668control(简称cpg ctrl)的序列为：5
’‑
tccatgagcttcctgatgct
‑3’
(20mer)。
[0042]
实施例中，chol
‑
galnac、chol
‑
glunac合成路线如下：
[0043][0044]
实施例1
[0045]
1、chol
‑
c2‑
n3的合成
[0046]
将2
‑
叠氮基乙醇(0.67g，7.8mmol)和三乙胺(0.73ml，5.1mmol)溶于二氯甲烷(40ml)，在冰浴的条件下逐滴加入胆固醇甲酰氯chol
‑
cocl(4.1g，9.2mmol)，随后将溶液恢复至室温，搅拌反应过夜。反应结束后，用饱和碳酸氢钠溶液清洗，无水硫酸镁干燥。减压蒸馏去除多余溶剂，硅胶柱层析分离，流动相为石油醚/乙酸乙酯(20/1)，rf＝0.5，所得产物用1h nmr和
13
c nmr表征的结果分别如图1、图2所示：1h nmr(400mhz,cdcl3):δ5.44
‑
5.31(m,1h),4.56
‑
4.43(m,1h),4.31
‑
4.22(m,1h),3.58
‑
3.46(m,1h),3.25(s,2h),2.45
‑
2.22(m,2h),2.06
‑
1.76(m,5h),1.73
‑
0.79(m,39h)。
13
c nmr(100mhz,cdcl3):δ155.58 140.04 123.08 78.39 77.36 77.04 76.72 74.29 65.65 56.69 56.13 49.99 42.31 39.52 36.1936.54 35.81 31.90 31.83 28.33 28.24 28.03 27.65 24.29 23.84 22.84 22.58 21.05 18.72 11.86。
[0047]
2、galnac
‑
yne的合成
[0048]
将galnac(2.62mmol)和催化剂h2so4·
sio2溶于炔丙醇(4ml)中，65℃油浴搅拌反应至固体完全溶解。反应产物用快速柱层析分离，流动相开始为二氯甲烷，后为二氯甲烷/甲醇(5/1)。异丙醇中重结晶，得到galnac
‑
yne。glunac
‑
yne的合成采用同样的方法。所得产物galnac
‑
yne用1h nmr和
13
c nmr表征的结果分别如图3、图4所示：1h nmr(400mhz,meod)δ5.02(d,j＝3.8hz,1h),4.32(dd,j＝11.1,3.7hz,1h),4.27(dd,j＝3.2,2.5hz,2h),3.94
‑
3.85(m,1h),3.84
‑
3.64(m,4h),2.85(t,j＝2.4hz,1h),1.99(s,3h)。
13
cnmr(100mhz,cdcl3):δ172.56 95.98 78.67 74.58 71.55 68.94 68.14 61.34 53.95 49.8321.20。所得产物glunac
‑
yne用1h nmr表征的结果如图5所示：1h nmr(400mhz,cdcl3):δ4.99(d,j＝
3.6hz,1h),4.27(dd,j＝4.4,2.4hz,2h),3.94(dd,j＝10.8,3.7hz,1h),3.82(dd,j＝11.9,2.3hz,1h),3.72
–
3.54(m,4h),3.41
–
3.32(m,2h),2.86(t,j＝2.4hz,1h),1.99(s,3h)。
[0049]
3、chol
‑
galnac的合成
[0050]
将chol
‑
c2‑
n3(35.8mg，0.078mmol)和galnac
‑
yne(0.078mmol)溶于dmf/dcm(3/2)中，氮气鼓泡15分钟排除空气。再将溴化亚铜(0.0078mmol)和pmdeta(0.0078mmol)溶于上述溶液中，再次氮气鼓泡15分钟排除空气。40℃油浴搅拌反应过夜，通过炔基与叠氮的点击反应，将galnac修饰到胆固醇上。用硅胶柱层析分离。chol
‑
glunac的合成采用同样的方法。所得产物chol
‑
galnac用1h nmr表征的结果如图6所示：1hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.74(s,1h),7.06(s,1h),5.38(d,j＝4.2hz,1h),5.31
‑
5.26(m,1h),5.11
‑
3.60(m,14h),3.48(s,1h),2.93(dd,j＝44.0,15.1hz,1h),2.46
‑
0.78(m,45h),0.68(d,j＝6.4hz,3h)。所得产物chol
‑
glunac用1h nmr表征的结果如图7所示：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.68(s,1h),6.87(d,j＝7.9hz,1h),5.45
–
5.24(m,1h),4.99
–
4.79(m,1h),4.67(dd,j＝15.2,9.4hz,2h),4.52(t,j＝4.6hz,2h),4.04(d,j＝8.0hz,2h),3.85(d,j＝4.6hz,2h),3.79
–
3.66(m,2h),3.66
–
3.54(m,1h),2.37(d,j＝7.8hz,1h),2.09
–
1.76(m,7h),1.75
–
1.20(m,20h),1.20
–
0.74(m,21h),0.68(s,3h)。
[0051]
4、包载cpg脂质体疫苗的制备
[0052]
糖脂质体采用薄膜
‑
超声的方法制备。将1,2
‑
二油酰基
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱dopc(10mg，0.013mmol)、二棕榈酰磷脂酰胆碱dppc(9.54mg，0.013mmol)和chol
‑
galnac(0.0065mmol)溶于氯仿中，通入氮气旋转干燥成均匀膜，真空干燥去除多余溶剂，在4℃条件下储存过夜。将脂膜和cpg(3.3mg/ml)搅拌并重悬于pbs(3ml，ph 7.2，10mm)中，室温下水合3小时制备糖脂质体，用sephadex g
‑
50柱去除未包载的cpg，用pbs调节浓度为1mg/ml。所得产物的tem图如图8所示，galnac/cpg liposome疫苗形貌是球形结构，粒径在150nm左右，符合纳米疫苗的要求。为了更好地验证galnac/cpg liposome疫苗的功能，本发明同时制备合成不同材料作为对照组，各组分分别命名为vaccine 1
‑
6，具体组分和粒径数据见表1。具体描述如下：
[0053]
vaccine 1:cpg ctrl；
[0054]
vaccine 2:cpg；
[0055]
vaccine 3:glunac/cpg ctrl liposome；
[0056]
vaccine 4:glunac/cpg liposome；
[0057]
vaccine 5:galnac/cpg ctrl liposome；
[0058]
vaccine 6:galnac/cpg liposome；
[0059]
表1
[0060][0061]
实施例2
[0062]
1、流式细胞仪检测小鼠骨髓来源的树突状细胞bmdcs抗原提呈功能
[0063]
实验过程：
[0064]
手术分离balb/c小鼠的股骨和胫骨，剪去骨两端，用1ml注射器吸取pbs反复冲洗骨髓腔，吹散骨髓组织，用ack裂解液去除红细胞，获得骨髓单细胞悬液。调整细胞密度为1
×
106/ml，用rpmi 1640完全培养基培养细胞，其中加入il
‑
4(10ng/ml)和gm
‑
csf(20ng/ml)刺激骨髓来源树突状细胞bmdcs分化。每隔两天半量更换新鲜培养基和细胞因子。至第7天，收集悬浮和松散贴壁的细胞即为bmdcs。糖脂质体疫苗(10μg/ml)刺激bmdcs48小时，收集细胞。用anti
‑
cd40、anti
‑
cd80、anti
‑
cd86和anti
‑
i
‑
a
d
荧光抗体标记bmdcs，流式细胞术检测相关分子的表达。实验结果如图9所示。
[0065]
从图中结果可以看出，与其他对照组相比，galnac/cpg liposome疫苗显著地增强了bmdcs表达mhc ii类分子i
‑
a
d
以及cd40、cd80和cd86共刺激分子，说明可以有效地促进bmdcs成熟。
[0066]
2、elisa检测糖脂质体疫苗促进bmdcs分泌细胞因子
[0067]
糖脂质体疫苗(10μg/ml)刺激bmdcs 48小时，收集上清液，用il
‑
12elisa试剂盒检测il
‑
12的分泌，具体实验过程如下：
[0068]
(1)il
‑
12包被抗体在4℃条件下孵育过夜；
[0069]
(2)pbst洗3遍，每孔体积200μl；
[0070]
(3)elisa稀释液封闭2小时，加入标准品或检测样品孵育2小时；
[0071]
(4)pbst洗3遍，每孔体积200μl；
[0072]
(5)加入检测抗体孵育1小时，加入hrp
‑
avidin孵育30分钟，tmb显色；
[0073]
(6)利用酶标仪检测450nm下的吸光度。用il
‑
12标准品的吸光度拟合曲线，计算样品中il
‑
12浓度。实验结果如图9所示。
[0074]
从图中结果可以看出，galnac/cpg liposome疫苗刺激bmdcs分泌il
‑
12细胞因子，说明疫苗可促进bmdcs活化。
[0075]
3、流式细胞仪检测小鼠脾脏b细胞抗原提呈功能
[0076]
实验过程：
[0077]
手术分离balb/c小鼠脾脏，用碾磨棒压碎脾脏，ack裂解液去除红细胞，获得脾脏单细胞悬液。使用miltenyi公司macs分选试剂盒分选b细胞，具体步骤简述如下：脾脏单细胞悬液首先标记biotin
‑
antibody cocktail，再标记anti
‑
biotin microbeads，将磁珠标记的单细胞悬液加入置于磁场中ls分选柱，洗脱未被吸附的细胞即为b细胞。用anti
‑
cd80、anti
‑
cd86和anti
‑
i
‑
a
d
荧光抗体标记脾脏b细胞，流式细胞术检测相关分子的表达。实验结果如图10所示。
[0078]
从图中结果可以看出，galnac/cpg liposome疫苗可以特异性激活b细胞表达mhc ii类分子i
‑
a
d
以及cd80和cd86共刺激分子，说明疫苗可以促进b细胞成熟。
[0079]
实施例3
[0080]
1、elisa鉴定糖脂质体疫苗与tn抗体的结合能力
[0081]
实验过程：
[0082]
在37℃条件下，将糖脂质体疫苗(10μg/ml)与anti
‑
tn抗体(isotype igm，5μg/ml)共孵育2小时，5000rpm离心后收集上清液。利用elisa的方法，用tn抗原包被96孔板过夜，用生物素标记的anti
‑
igm抗体作为检测抗体检测anti
‑
tn抗体的浓度，以对照组5μg/ml作为标准计算样品中anti
‑
tn抗体的浓度，具体实验步骤如实施例2(2)所述。实验结果如图11所
示。
[0083]
从图中结果可以看出，galnac/cpg liposome疫苗可以特异性的与tn抗体结合，表现出良好的抗原性。
[0084]
2、elisa检测免疫小鼠血清抗体滴度
[0085]
实验过程：
[0086]
将糖脂质体疫苗(100μl，1mg/ml)皮下接种于balb/c小鼠两侧腹股沟，每隔14天再接种免疫三次。末次接种后7天，从小鼠眼眶采取，加入10％肝素抗凝，1000g离心收集血清。用生理盐水按不同的比例稀释血清(1/100、1/200、1/400、1/800、1/1600、1/3200、1/6400)。利用elisa的方法，用tn抗原包被96孔板过夜，用anti
‑
light chain
‑
hrp作为检测抗体检测特异性抗体的浓度，具体实验步骤如实施例2(2)所述。实验结果如图12所示。
[0087]
从图中结果可以看出，galnac/cpg liposome疫苗可以促进小鼠产生特异性抗tn抗原的抗体，说明疫苗可以激活小鼠免疫系统产生tn抗原特异性抗体。
[0088]
3、elisa检测免疫小鼠血清抗体亚型
[0089]
实验过程：
[0090]
取上述实验步骤2中1/800比例稀释的血清，用tn抗原包被96孔板过夜，用生物素标记的anti
‑
iga、anti
‑
igg1、anti
‑
igg2a、anti
‑
igg2b、anti
‑
igg3和anti
‑
igm作为检测抗体检测特异性抗体的浓度，具体实验步骤如实施例2(2)所述。实验结果如图13所示。
[0091]
从图中结果可以看出，galnac/cpg liposome疫苗可以促进小鼠产生高滴度igg2a抗体，诱导了th1型细胞免疫反应。
[0092]
实施例4
[0093]
流式细胞仪检测抗原特异性t细胞功能
[0094]
取接种免疫后的balb/c小鼠，手术分离腹股沟处的引流淋巴结，用磨砂玻璃片磨碎，获得淋巴结单细胞悬液。使用miltenyi公司macs分选试剂盒分选t细胞，具体步骤如下：
[0095]
(1)缓冲液重悬淋巴结单细胞悬液，调整细胞密度为107/100μl。
[0096]
(2)加入10μlanti
‑
cd3
‑
biotin抗体混匀，2
‑
8℃孵育10min。
[0097]
(3)1
‑
2ml缓冲液重悬细胞，300
×
g离心10min。
[0098]
(4)加入80μl缓冲液重悬细胞。
[0099]
(5)再加入20μl体积anti
‑
biotin microbeads，混匀孵育15min。
[0100]
(6)将磁珠标记的单细胞悬液加入置于磁场中ld分选柱，被吸附的细胞即为t细胞。
[0101]
(7)将ld分选柱移出磁场，用pbs用力冲洗，收集被洗脱的t细胞。
[0102]
用丝裂霉素c(10μg/ml)灭活4t1肿瘤细胞(即小鼠乳腺癌细胞)1小时。将t细胞和灭活的4t1肿瘤细胞按4/1比例共培养48小时，收集上清液。用elisa试剂盒检测ifn
‑
γ浓度，具体实验步骤如实施例2(2)所述。实验结果如图13所示。
[0103]
从图中结果可以看出，galnac/cpg liposome疫苗可以引起小鼠t细胞活化分泌ifn
‑
γ，激活小鼠细胞免疫实现抗肿瘤效果。