一种多功能抗菌敷料、制备方法及应用与流程

1.本发明涉及生物医学材料技术领域，具体涉及一种多功能抗菌敷料、制备方法及应用。


背景技术：

2.皮肤组织充当着人体首要的屏障器官，起到了防止有害物质进入机体的作用。但由于疾病或者创伤，会造成大面积的皮肤组织丧失，严重者可导致残疾。而与微生物感染相关的伤口是较为典型的疾病，传统疗法多以抗生素或辅助性药物进行治疗。但由于患者伤口的不规则性、暴露性以及抗生素耐药性的产生，传统的治疗方法效果欠佳，所以就敦促开发新型有效的治疗方法。
3.纳米科技带来了传统疗法的革命，而银纳米粒子(agnps)因其广谱的抗菌性、不产生耐药性而备受研究者的关注。agnps的合成方法多种多样：包括物理、化学和生物学的方法。通常物理方法包括热解、球磨、火花放电等方式，但是这些方法耗能较大且制备纳米颗粒尺寸不均匀，化学方法一般以化学还原剂还原银盐为主，这种方式虽然简单易行但是会引入有害的化学还原剂。近年来，不少研究者将目光集中在了通过生物方法介导的纳米银还原上来。如cn107441546a公开了一种含银抗菌敷料的制备方法，其特征在于利用蛋清溶液为生物还原剂，在90～100℃加热条件下有效还原出agnps。但是该制备方法需要90～100℃加热为条件，耗能较大的同时操作性不强，制备条件复杂。cn10868252a公开了一种以壳聚糖
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泊洛沙姆为基质的纳米银抗菌敷料及其制备方法和应用，通过紫外光介导了磷酸三钠还原出agnps，再以壳聚糖联合泊洛沙姆为载体装载agnps。该方法利用了光化学方式介导了agnps的合成，制备的纳米颗粒尺寸和分布均匀。但是需要壳聚糖联合泊洛沙姆为基底装载agnps后静置成膜的二次工序，使得制备过程过于复杂繁琐，并且制备的敷料直接覆盖在伤口部位难以适应实际伤口的不规则性，因此在实际使用中受限。cn103785857a公开了一种利用玫瑰茄提取液做生物还原剂来制备纳米银的方法，但是在制备抗菌敷料的时候，需要二次负载，还原和负载的过程相互脱离，需要在应用的时候二次添加，大大增加了使用的困难程度。那么开发一种在还原、负载和运用环节相互联系的纳米银伤口敷料的工作变得格外重要，而开发一种能在抗菌敷料制备同时原位还原agnps的工作仍未见报道。。


技术实现要素：

4.本发明针对现有技术存在的问题提供一种制备方法简单、抗菌性能优异，能适应伤口愈合过程各种要求的多功能抗菌敷料、制备方法及应用。
5.本发明采用的技术方案是：
6.一种多功能抗菌敷料的制备方法，包括以下步骤：
7.步骤1：配制胶原蛋白溶液，调节ph值后，加入壳聚糖溶液，充分混合加入光引发剂，得到混合溶液a；
8.步骤2：在步骤1得到的混合溶液a中加入硝酸银溶液和氧化多糖溶液，得到混合溶
液b，混合均匀后形成凝胶；
9.步骤3：将步骤2得到的凝胶通过注射器剪切稀化后注射到所需位置，重新形成凝胶；光固化反应一定时间，即可得到需要的抗菌敷料。
10.进一步的，所述步骤1中胶原蛋白溶液为胶原蛋白的醋酸溶液，胶原蛋白为甲基丙烯酸酐改性的ⅰ型胶原衍生物。
11.进一步的，所述壳聚糖为水溶性壳聚糖，壳聚糖溶液为水溶液；壳聚糖为乙二醇壳聚糖、羧甲基壳聚糖、季铵盐壳聚糖、羟乙基壳聚糖中的一种或两种及以上以任意比例构成的混合物。
12.进一步的，所述步骤2中的氧化多糖溶液为氧化多糖水溶液，氧化多糖为氧化透明质酸、氧化硫酸软骨素、氧化海藻酸钠、氧化葡聚糖中的一种或两种及以上以任意比例构成的混合物。
13.进一步的，所述胶原蛋白溶液的质量浓度为0.5wt.％～1.5wt.％，壳聚糖溶液的质量浓度为0.5wt.％～2.0wt.％，氧化多糖溶液的质量浓度为2.0wt.％～3.5wt％；胶原蛋白溶液与壳聚糖溶液的体积比为1:1；壳聚糖溶液与氧化多糖溶液的体积比为2:1。
14.进一步的，所述步骤2中反应时间为20s～100s；步骤3中光固化时间为30s～120s。
15.进一步的，所述步骤2中混合溶液b中硝酸银的摩尔浓度为0.5mmol/l。
16.进一步的，所述步骤1中混合溶液a中光引发剂的质量浓度为1wt.％；光引发剂为苯基
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2,4,6
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三甲基苯甲酰基亚磷酸锂。
17.一种多功能抗菌敷料的应用，抗菌敷料可抑制革兰氏阴性和革兰氏阳性菌生长，用于感染伤口。
18.本发明的有益效果是：
19.(1)本发明得到抗菌敷料为装载agnps的双网络可注射水凝胶，生物相容性好，并且在针对由微生物感染引发的伤口的治疗过程中，显示出较好的抑制微生物生长的能力，能显著加速伤口的愈合；
20.(2)本发明中的抗菌敷料中通过氧化多糖上的醛基和胶原蛋白、壳聚糖上的氨基反应形成动态席夫碱网络，注射过程中剪切稀化，然后注射到伤口处；通过光固化形成与席夫碱网络互穿的第二层光交联网络，同时还原出agnps；第二层网络的形成使得水凝胶网络更加稳定；
21.(3)本发明动态席夫碱网络具有自愈合的性质，可以有效延长使用时间，减少更换伤口敷料带来的二次伤害。
附图说明
22.图1为实施例1得到的抗菌敷料的sem图。
23.图2实施例1得到的抗菌敷料的紫外可见光谱，实线为对比例得到的不载agnps的敷料，虚线为实施例1得到载agnps的抗菌敷料。
24.图3为实施例1得到的抗菌敷料的可注射演示图(3a)和自愈合演示图(图3b)。
25.图4为实施例1得到的抗菌敷料的抑菌性能测试结果抑菌环图。
26.图5为实施例1得到的抗菌敷料的细胞毒性测试结果cck8结果图。
27.图6为实施例1得到的抗菌敷料的全层型感染伤口的愈合实验结果图。
具体实施方式
28.下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
29.一种多功能抗菌敷料的制备方法，包括以下步骤：
30.步骤1：配制胶原蛋白溶液，调节ph值后，加入壳聚糖溶液，充分混合加入光引发剂，得到混合溶液a；胶原蛋白溶液为胶原蛋白的醋酸溶液，胶原蛋白为甲基丙烯酸酐改性的ⅰ型胶原衍生物。壳聚糖为水溶性壳聚糖，壳聚糖溶液为水溶液；壳聚糖为乙二醇壳聚糖、羧甲基壳聚糖、季铵盐壳聚糖、羟乙基壳聚糖中的一种或两种及以上以任意比例构成的混合物。混合溶液a中光引发剂的质量浓度为1wt.％；光引发剂为苯基
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2,4,6
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三甲基苯甲酰基亚磷酸锂。
31.步骤2：在步骤1得到的混合溶液a中加入硝酸银溶液和氧化多糖溶液，得到混合溶液b，混合均匀反应完全(反应时间为20s～100s)，形成凝胶。氧化多糖溶液为氧化多糖水溶液，氧化多糖为氧化透明质酸、氧化硫酸软骨素、氧化海藻酸钠、氧化葡聚糖中的一种或两种及以上以任意比例构成的混合物。混合溶液b中硝酸银的摩尔浓度为0.5mmol/l。
32.胶原蛋白溶液的质量浓度为0.5wt.％～1.5wt.％，壳聚糖溶液的质量浓度为0.5wt.％～2.0wt.％，氧化多糖溶液的质量浓度为2.0wt.％～3.5wt％；胶原蛋白溶液与壳聚糖溶液的体积比为1:1；壳聚糖溶液与氧化多糖溶液的体积比为2:1。
33.此时，利用氧化多糖上的醛基与胶原蛋白、壳聚糖上的氨基发生席夫碱反应而形成基于动态席夫碱键的第一层网络。
34.步骤3：将步骤2得到的凝胶通过注射器剪切稀化后注射到所需位置后重新形成凝胶，再进行光固化，同时原位还原出纳米银，即可得到需要的抗菌敷料，另外光固化时间为30s～120s。
35.一种纳米银抗菌敷料，所述步骤2中得到的凝胶，注射到所需模具后进行步骤3的光固化。用注射器注射到不同形状的模具中，模具的形状根据实际伤口设置，然后置于光交联仪下促进胶原蛋白之间形成与第一层网络互穿的第二层光交联网络，同时还原出纳米银粒子，即可得到所述的纳米银抗菌敷料。形成的席夫碱网络可以通过注射器注射过程剪切稀化，然后原位注射到不规则伤口处，能够有效覆盖伤口并在贴合伤口组织后重新形成网络，赋予了材料体系原位可注射、自愈合、组织黏附的特征。
36.纳米银抗菌敷料可抑制革兰氏阴性和革兰氏阳性菌生长，可用于感染的伤口。敷料在形成双网络的同时原位还原出纳米银颗粒，适用于众多感染的伤口，如压疮、糖尿病足、烧伤创面等。
37.实施例1
38.一种多功能抗菌敷料的制备方法，包括以下步骤：
39.步骤1：将0.2g甲基丙烯酸酐改性的ⅰ型胶原衍生物溶解于20ml的0.5mol/l醋酸水溶液中得到质量浓度为1.0wt.％的可光交联的ⅰ型胶原衍生物溶液。将0.4g季铵盐壳聚糖溶解于20ml超纯水中，得到质量浓度为2.0wt.％的季铵盐壳聚糖溶液。
40.将可光交联的ⅰ型胶原衍生物溶液在4℃冰浴下用氢氧化钠调节ph至7.4。取0.4ml可光交联的ⅰ型胶原衍生物溶液和0.4ml季铵盐壳聚糖溶液混合均匀后加入30μl质量分数为1wt.％的光引发剂，得到混合溶液a。
41.步骤2：将0.7g氧化葡聚糖溶解于20ml超纯水中，得到质量浓度为3.5wt.％的氧化
葡聚糖溶液。在步骤1得到的混合溶液a中加入20μl浓度为0.5mol/l的硝酸银溶液(硝酸银的终浓度为1.0mmol/l)和0.2ml氧化葡聚糖溶液得到混合溶液b。充分混合均匀，反应完全形成凝胶。此时，利用氧化葡聚糖上的醛基与ⅰ型胶原、季铵盐壳聚糖上的氨基发生席夫碱反应而形成第一层网络。
42.步骤3：将步骤2得到的凝胶用18g注射器注射进不同形状的模具后，再置于蓝光交联仪下固化形成第二层网络的同时原位还原出纳米银粒子，即可得到所述的纳米银抗菌敷料。
43.对实施例1得到的载agnps抗菌敷料冻干后进行喷金处理，使用扫描电镜观察实施例1制备的纳米银抗菌敷料中纳米银分布。如图1所示，纳米银成功制备并均匀的分布于敷料的表面。
44.取实施例1得到的载agnps抗菌敷料，其他步骤均与实施例1相同，不加入硝酸银得到不载agnps的敷料作为对比例。
45.在700nm～300nm光谱范围内运用固体紫光可见光谱仪对该抗菌敷料进行紫外
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可见光谱扫描。如图2所示，与不载agnps的敷料相比，可以看到在404nm处归属于agnps的表面等离子体激发元带，这说明agnps的有效还原。
46.图3为实施例1得到的抗菌敷料的可注射演示图(3a)和自愈合演示图(图3b)。基底材料选为甲基丙烯酸酐改性的ⅰ型胶原衍生物、季铵盐壳聚糖、和氧化葡聚糖，与实施例1中一致，将形成的第一层席夫碱网络的水凝胶用罗丹明b染色后，再用18g注射器注射进37℃生理盐水中，如附图3(a)中所示，剪切稀化的凝胶可以实现连续注射，这在适应伤口的不规则和深浅不一上具有重大意义。另外，如图3(b)中所示，将两层网络均形成的水凝胶切开后拼合在一起，一段时间后基于动态席夫碱键的重新形成，两块分开的凝胶会发生自愈合，这在临床应用中也具有很大的价值。
47.图4为实施例1得到的抗菌敷料的抑菌性能测试结果抑菌环图。将实施例1制备载agnps抗菌敷料与不载agnps的敷料，分别对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行抑菌圈实验。取100μl细菌悬液浓度为108cfu/ml的菌液滴加到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，用玻璃棒均匀涂布，将准备好载agnps抗菌敷料与不载agnps的敷料置于培养基上，在37℃的恒温培养箱培养24小时后，观察抑菌圈大小。从图4可以看出，制备的纳米银抗菌敷料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均产生了抑菌圈，这表明实施例1得到的纳米银抗菌敷料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用，可以有效防止微生物介导的伤口感染。
48.图5为实施例1得到的抗菌敷料的细胞毒性测试结果cck8结果图。将小鼠成纤维细胞(l929)培养在含有10％胎牛血清的高糖培养基中，并在5％co2浓度，37℃环境下培养。养至第7代后，将细胞按5000个/孔接种在24孔板中，在含有10％胎牛血清的高糖培养基中培养24小时。按《gb/t 16886》中对水凝胶细胞毒性的评价方法来制备不同浓度的材料浸提液，其中浸提介质为含有10％胎牛血清的高糖培养基。在37℃条件下浸提24h后，取其浸提液，并用不同浓度的浸提液再培养l929细胞24小时。之后，将细胞用pbs溶液冲洗3次，每孔加入含有20μlcck8溶液的200μl的完全培养基。在37℃、黑暗环境下孵育2小时后，将培养液转移到新的96孔板中，每孔100μl。使用酶标仪在450nm波长下测量溶液的光密度(od)值，计算细胞存活率(细胞存活率＝实验组od值/阴性对照组od值)。如附图5所示，0.2g/ml的抗菌敷料浸提液都表现出较低的毒性，细胞存活率都在80％以上，显示出较好的生物相容性。
49.图6为实施例1得到的抗菌敷料的全层型感染伤口的愈合实验结果图。选取纱布处理的为空白组，以实施例1制备的载agnps抗菌敷料来处理的为实验组，以不载agnps的敷料对照组。选取12只体重在200
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250g的雄性sd大鼠，随机分为3组，分别为空白组，实验组和对照组，每组8个平行样。麻醉大鼠后剔除其背部多余毛发，接下来用手术剪刀制作出一个直径为10mm的圆形全层型皮肤缺损，然后向伤口处打入100μl金黄色葡萄球菌(108cfu/ml)来构建感染模型，感染24h后再向每组大鼠分别使用提前制备的圆形纱布、原位注射成型的不载agnps的敷料以及原位注射成型的载agnps抗菌敷料来处理伤口。到第七天和十四天的时候观察大鼠伤口的愈合情况如图6所示，与空白组相比，对照组和实验组伤口愈合速度明显加快，而且实验组愈合速度优于对照组，载agnps的水凝胶抗菌敷料不仅可以提供一个湿润的愈合环境加速伤口愈合，还由于agnps的存在能有效抵抗细菌感染。由此可见，本发明的可注射纳米银抗菌敷料对于微生物介导的感染创面具有较好的适应和修复潜力。
50.实施例2
51.一种多功能抗菌敷料的制备方法，包括以下步骤：
52.步骤1：将0.3g甲基丙烯酸酐改性的ⅰ型胶原衍生物溶解于20ml的0.5mol/l醋酸水溶液中得到质量浓度为1.5wt.％的可光交联的ⅰ型胶原衍生物溶液。将0.4g羧甲基壳聚糖溶解于20ml超纯水中，得到质量浓度为2.0wt.％的羧甲基壳聚糖溶液。
53.将可光交联的ⅰ型胶原衍生物溶液在4℃冰浴下用氢氧化钠调节ph至7.4。取0.4ml可光交联的ⅰ型胶原衍生物溶液和0.4ml羧甲基壳聚糖溶液混合均匀后加入20μl质量分数为1wt.％的光引发剂，得到混合溶液a。
54.步骤2：将0.6g氧化透明质酸溶解于20ml超纯水中，得到质量浓度为3.0wt.％的氧化透明质酸溶液。在步骤1得到的混合溶液a中加入10μl浓度为0.5mol/l的硝酸银溶液(硝酸银的终浓度为0.5mmol/l)和0.2ml氧化透明质酸溶液得到混合溶液b。充分混合均匀，反应完全形成凝胶。此时，利用氧化透明质酸上的醛基与ⅰ型胶原、羧甲基壳聚糖上的氨基发生席夫碱反应而形成第一层网络。
55.步骤3：将步骤2得到的凝胶用18g注射器注射进不同形状的模具后，再置于蓝光交联仪下固化形成第二层网络的同时原位还原出纳米银粒子，即可得到所述的纳米银抗菌敷料。
56.实施例3
57.一种多功能抗菌敷料的制备方法，包括以下步骤：
58.步骤1：将0.1g甲基丙烯酸酐改性的ⅰ型胶原衍生物溶解于20ml的0.5mol/l醋酸水溶液中得到质量浓度为0.5wt.％的可光交联的ⅰ型胶原衍生物溶液。将0.2g季铵盐壳聚糖溶解于20ml超纯水中，得到质量浓度为1.0wt.％的羧甲基壳聚糖溶液。
59.将可光交联的ⅰ型胶原衍生物溶液在4℃冰浴下用氢氧化钠调节ph至7.4。取0.4ml可光交联的ⅰ型胶原衍生物溶液和0.4ml季铵盐壳聚糖溶液混合均匀后加入60μl质量分数为1wt.％的光引发剂，得到混合溶液a。
60.步骤2：将0.6g氧化葡聚糖溶解于20ml超纯水中，得到质量浓度为3.0wt.％的氧化葡聚糖溶液。在步骤1得到的混合溶液a中加入20μl浓度为0.5mol/l的硝酸银溶液(硝酸银的终浓度为1mmol/l)和0.2ml氧化葡聚糖溶液得到混合溶液b。充分混合均匀，反应完全形成凝胶。此时，利用氧化透明质酸上的醛基与ⅰ型胶原、羧甲基壳聚糖上的氨基发生席夫碱
反应而形成第一层网络。
61.步骤3：将步骤2得到的凝胶用18g注射器注射进不同形状的模具后，再置于蓝光交联仪下固化形成第二层网络的同时原位还原出纳米银粒子，即可得到所述的纳米银抗菌敷料。
62.本发明以可光交联的胶原蛋白和水溶性壳聚糖作为纳米银颗粒的生物还原剂和稳定剂。结果显示在405nm蓝光的介导下安全有效的还原出分布均匀的纳米银颗粒。通过细胞毒性和抗菌性的表征，显示所还原出的纳米银延续了银离子广谱的抗菌性能，并且具有较低毒性、更高抗菌活性的特点。相对于抗生素来说，纳米银不产生耐药性，同时也能抑制产生生物膜的细菌生长。通过可注射和自愈合效果的演示，说明以氧化多糖上的醛基和胶原蛋白、壳聚糖上的氨基反应形成的动态席夫碱网络，再通过注射器注射过程中剪切稀化，然后原位注射到不规则伤口处，能够有效地覆盖伤口并在贴合伤口组织后重新形成网络，此后在光固化仪的照射下，形成与席夫碱网络互穿的第二层光交联网络。同时还原出agnps，第二层网络的形成使得水凝胶网络更加稳定。此外，在具体的临床实例中，水凝胶型的伤口敷料在伤口处常常面临着破裂掉落的风险。本发明中的动态席夫碱网络具有自愈合的性质，可以有效延长使用时间，减少更换伤口敷料带来的二次伤害，装载agnps的双网络可注射水凝胶，显示出较好的生物相容性，并且在针对感染伤口的治疗过程中，显示出较好的抑制微生物生长的能力，能显著加速伤口的自愈合。