分子的细胞内靶向的制作方法

1.本发明涉及包含小分子配体以及待细胞内递送的货物分子的缀合物。


背景技术：

2.生物大分子是核酸、氨基酸的天然存在的杂聚物或合成杂聚物、核酸的合成衍生物或氨基酸的合成衍生物。生物聚合物的实例包括蛋白质、抗体、基因组dna(gdna)、信使rna(mrna)、小分子干扰rna(sirna)、反义寡核苷酸(aso)、寡脱氧核苷酸(odn)和锁核酸(lna)。
3.lna反义寡核苷酸为合成寡核苷酸，由经例如2
′‑
o，4
′‑
c
‑
亚甲基桥修饰的dna与rna的混合物组成。lna可用于调节mrna剪接，影响外显子跳跃，影响核糖核酸酶h介导的mrna降解，并且通过互补碱基配对减少mrna翻译成蛋白质。
4.生物大分子作为药物引人关注，因为其具有生物活性或可以用作酶活性的模板或底物，但是由于进入细胞内空间受限，因此这类疗法的开发受到药代动力学不佳的限制。
5.已经使用许多方法改善生物大分子作为细胞内疗法的生物活性，诸如病毒、聚合物、脂质、病毒和小分子靶向配体。
6.小分子靶向配体因其简便的化学合成和模块化结构而代表了一种特别引人关注的方法。一些已经过探索的靶向配体包括叶酸盐、n
‑
乙酰基半乳糖胺等，它们引起生物大分子
‑
配体复合物与细胞受体结合，在一些情况下触发内化作用。由于小分子配体与受体之间的亲和力低，因此这种方法的实用性可能有限。配体受体亲和力的改善可来自小分子配体的改变或多价配体的工程化改造，以利用活动性效应来改善亲和力。
7.因此，需要一种能够将治疗活性分子转运至细胞中的递送系统。


技术实现要素：

8.在第一方面，本发明涉及包含小分子靶向配体和货物分子的缀合物，该缀合物具有式i：
[0009][0010]
其中a选自由以下项组成的组：
[0011][0012]
b为
‑
c(o)
‑
o
‑
或
‑
c(o)
‑
n
‑
，
[0013]
n选自0或1
‑
6，
[0014]
r选自0或1
‑
6，
[0015]
m选自1
‑
6，并且
[0016]
r为货物分子。
[0017]
在本发明的一个特定实施例中，货物分子选自由肽、多肽、寡核苷酸组成的组。
[0018]
在本发明的一个特定实施例中，货物分子为抗体或寡核苷酸。
[0019]
在本发明的一个特定实施例中，货物分子为lna寡核苷酸。
[0020]
在本发明的一个特定实施例中，小分子靶向配体在其3
′
末端或5
′
末端，优选地在其5
′
末端连接至寡核苷酸。
[0021]
在本发明的一个特定实施例中，b为
‑
c(o)
‑
n
‑
。
[0022]
在本发明的一个特定实施例中，r＝0并且n＝6。
[0023]
在本发明的一个特定实施例中，m选自1
‑
4。
[0024]
在本发明的一个特定实施例中，a为
[0025][0026]
在本发明的一个特定实施例中，a选自由以下项组成的组：
[0027][0028]
在本发明的一个特定实施例中，a选自由以下项组成的组：
[0029][0030]
在本发明的一个特定实施例中，a选自由以下项组成的组：
[0031][0032]
在本发明的一个特定实施例中，a为
[0033][0034]
在本发明的一个特定实施例中，缀合物具有式ii给出的结构：
[0035][0036]
在第二方面，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的缀合物以及药用载体。
[0037]
在本发明的一个特定实施例中，药物制剂为用于眼部病况的局部用组合物。
[0038]
在第三方面，本发明涉及一种治疗患有眼部病况的个体的方法，该方法包括向个体的眼睛施用有效量的本发明的缀合物或本发明的药物组合物。
附图说明
[0039]
图1：使用1，2
‑
二硫环戊烷
‑4‑
甲酸的lna修饰增强了细胞摄取，通过荧光显微镜定量。带有异硫氰酸荧光素(fitc)标记的lna在未修饰的情况下使用，或与aspa缀合后使用。将细胞用指定的剂量处理，并且按照“细胞摄取方法”进行洗涤。图1a)对图像的荧光进行定量并作图；x轴表示lna的剂量，以纳摩尔为单位；y轴表示每帧的总细胞荧光除以细胞核数量。将经过aspa修饰的lna绘制为蓝色的左侧曲线，而未经修饰的lna则绘制为红色的右侧曲线。经aspa修饰的lna相对于未修饰lna的向左偏移表明，aspa靶向增强了这些条件下的细胞摄取和保留。图1b)由该实验得到的代表性图像；经aspa修饰的lna的剂量为200nm，而未修饰的lna的剂量为170nm；蓝色代表经dapi染色的细胞核，绿色代表内化的lna。
[0040]
图2：用aspa修饰靶向lna的malat1增强了由qpcr测得的生物活性。
具体实施方式
[0041]
定义
[0042]
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
[0043]“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于fv、fab、fab
′
、fab
′‑
sh、f(ab
′
)2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scfv和scfab)；单结构域抗体(dab)；以及由抗体片段形
成的多特异性抗体。关于某些抗体片段的综述，请参见holliger和hudson，nature biotechnology 23：1126
‑
1136(2005)。
[0044]
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在所述抗体中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
[0045]
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：iga、igd、ige、igg和igm，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。在某些方面，抗体为igg1同种型。在某些方面，抗体为igg1同种型，其包含p329g、l234a和l235a突变以降低fc区效应子功能。在其他方面，抗体为igg2同种型。在某些方面，抗体为igg4同种型，其在铰链区包含s228p突变以改善igg4抗体的稳定性。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，所述两种类型称为卡帕(k)和兰姆达(λ)。
[0046]“框架”或“fr”是指除互补决定区(cdr)之外的可变结构域残基。可变结构域的fr通常由以下四个fr结构域组成：fr1、fr2、fr3和fr4。因此，cdr和fr序列通常在vh(或vl)中以如下序列出现：fr1
‑
cdr
‑
h1(cdr
‑
l1)
‑
fr2
‑
cdr
‑
h2(cdr
‑
l2)
‑
fr3
‑
cdr
‑
h3(cdr
‑
l3)
‑
fr4。
[0047]
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换地用于指代具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文所定义的fc区的重链的抗体。
[0048]
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。
[0049]“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
[0050]“人共有框架”是这样的框架，其表示在人免疫球蛋白vl或vh框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基。一般而言，人免疫球蛋白vl或vh序列的选择来自于可变结构域序列的亚组。一般而言，序列的亚组是如kabat等人，sequences of proteins of immunological interest，第五版，nih publication 91
‑
3242，bethesda md(1991)，第1至3卷中所述的亚组。在一个方面，对于vl，该亚组是如kabat等人，出处同上中的亚组k i。在一个方面，对于vh，该亚组是如kabat等人，出处同上中的亚组iii。[[根据需要进行调整以指代本发明的vh/vl的实际亚组]]
[0051]“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人cdr的氨基酸残基和来自人fr的氨基酸残基。在某些方面，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有cdr对应于非人抗体的cdr，并且所有或基本上所有的fr对应于人抗体的fr。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如非人抗体，是指已经进行过人源化的抗体。
[0052]
如本文所用的术语“高变区”或“hvr”是指抗体可变结构域中在序列上高变并确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“cdr”)。
[0053]
通常，抗体包含六个cdr；三个在vh中(cdr
‑
h1、cdr
‑
h2、cdr
‑
h3)，并且三个在vl中的(cdr
‑
l1、cdr
‑
l2、cdr
‑
l3)。本文中的示例性cdr包括：
[0054]
(a)存在于氨基酸残基26
‑
32(l1)、50
‑
52(l2)、91
‑
96(l3)、26
‑
32(h1)、53
‑
55(h2)和96
‑
101(h3)处的高变环(chothia和lesk，j.mol.biol.196：901
‑
917(1987))；
[0055]
(b)存在于氨基酸残基24
‑
34(l1)、50
‑
56(l2)、89
‑
97(l3)、31
‑
35b(h1)、50
‑
65(h2)和95
‑
102(h3)处的cdr(kabat等人，sequences of proteins of immunological interest，第5版，public health service，national institutes of health，bethesda，md(1991))；以及
[0056]
(c)存在于氨基酸残基27c
‑
36(l1)、46
‑
55(l2)、89
‑
96(l3)、30
‑
35b(h1)、47
‑
58(h2)和93
‑
101(h3)处的抗原接触点(maccallum等人，j.mol.biol.262：732
‑
745(1996))。
[0057]
除非另有说明，否则cdr根据kabat等人所述的方法(同上)确定。本领域的技术人员将理解，也可以根据chothia(同上)、mccallum(同上)所述的方法或任何其他在科学上接受的命名系统来确定cdr名称。[[用抗体工程方法确认要求保护的抗体具有如(a)、(b)或(c)所定义的cdr，其中kabat(b)为优选的定义。如果cdr不符合标准定义，则修订cdr的定义以包括要求保护的cdr残基。]]
[0058]“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒性剂缀合的抗体。
[0059]“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些方面，个体或受试者是人。
[0060]“经分离的”抗体为已从其自然环境的组分中分离的抗体。在一些方面，通过例如电泳(例如，sds
‑
page、等电聚焦(ief)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相hplc)方法测定，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评定抗体纯度的方法的综述，请参见例如flatman等人，j.chromatogr.b 848：79
‑
87(2007)。
[0061]
术语“核酸分子”或“多核苷酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基组成，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸酯基团。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为从5
′
至3
′
。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(dna)(包括例如互补dna(cdna)和基因组dna)、核糖核酸(rna)(特别是信使rna(mrna))、dna或rna的合成形式，以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的实例包括具有衍生化的糖或磷酸主链键或经化学修饰的残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合作为用于本发明的抗体的体外和/或体内(例如，在宿主或患者体内)直接表达的载体的dna和rna分子。此类dna(例如cdna)或rna(例如mrna)载体可以是未修饰的或经修饰的。例如，可以对mrna进行化学修饰以增强rna载体的稳定性和/或编码分子的表达，使得可以将mrna注射到受试者体内以在体内产生抗体(参见例如stadler等人，nature medicine2017，在线发表于2017年6月12日，doi：10.1038/nm.4356或ep 2 101 823 b1)。
[0062]“经分离的”核酸是指已自其自然环境的组分中分离的核酸分子。经分离的核酸包
括这样的核酸分子，其包含在通常含有所述核酸分子的细胞中，但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
[0063]
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量形式存在)之外，包含该群体的各个抗体是相同的及/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组dna方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
[0064]“裸抗体”是指不缀合至异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可存在于药物组合物中。
[0065]“天然抗体”是指具有不同结构的天然免疫球蛋白分子。例如，天然igg抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由经二硫键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从n端至c端，每条重链均具有可变结构域(vh)，亦称为可变重链结构域或重链可变区，随后为三个恒定重链结构域(ch1、ch2和ch3)。同样地，从n端到c端，每条轻链均具有可变结构域。
[0066]
术语“药物组合物”或“药物制剂”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。
[0067]“药用载体”是指药物组合物或制剂中除有效成分之外的成分，其对受试者无毒。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂，或防腐剂。
[0068]
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的疾病的自然病程，并且可以执行以用于预防或在临床病理学过程中执行的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些方面，本发明的缀合物用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
[0069]
小分子配体与货物分子的缀合可使用多种化学连接基进行。例如，如果货物分子为多肽(特别是抗体)，则小分子配体与多肽(特别是抗体)可使用多种双功能蛋白偶联剂诸如n
‑
琥珀酰亚胺基
‑3‑
(2
‑
吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)、琥珀酰亚胺
‑4‑
(n
‑
马来酰亚胺基甲基)环己烷
‑
l
‑
甲酸酯(smcc)、亚氨基硫杂环戊烷(it)、亚氨基酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双
‑
(对重氮苯甲酰基)
‑
乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6
‑
二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5
‑
二氟
‑
2，4
‑
二硝基苯)进行缀合。连接基可以是便于在递送至脑后释放效应子实体的“可裂解连接基”。例如，可使用酸不稳定的连接基、肽酶敏感的连接基、光不稳定的连接基、二甲基连接基或含二硫键的连接基(chari等人，cancer res.52：127
‑
131(1992)；美国专利号5,208,020)。
[0070]
共价缀合可直接完成，也可通过连接基完成。在某些实施例中，直接缀合通过在小
分子配体的两个部分之一的反应基团与货物分子上的相应基团或受体之间形成共价键。在某些实施例中，直接缀合通过修饰(即，遗传修饰)待缀合的两种分子中之一以包括反应性基团(作为非限制性实例，该反应性基团为巯基基团或羧基基团)，该反应性基团在适当条件下与待缀合的另一种分子形成共价连接。核酸与蛋白质共价缀合的方法也是本领域已知的(即光交联，参见例如zatsepin等人russ.chem.rev.74：77
‑
95(2005))。也可使用多种连接基进行缀合。例如，单价结合实体与效应子实体可使用多种双功能蛋白偶联剂诸如n
‑
琥珀酰亚胺基
‑3‑
(2
‑
吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)、琥珀酰亚胺
‑4‑
(n
‑
马来酰亚胺基甲基)环己烷
‑
l
‑
甲酸酯(smcc)、亚氨基硫杂环戊烷(it)、亚氨基酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双
‑
(对重氮苯甲酰基)
‑
乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6
‑
二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5
‑
二氟
‑
2，4
‑
二硝基苯)进行缀合。也可以使用包含通过肽键连接的1至20个氨基酸的肽连接基。在某些此类实施例中，氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。在某些其他此类实施例中，氨基酸中的一种或多种选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。连接基可以是便于在递送至脑后释放效应子实体的“可裂解连接基”。例如，可使用酸不稳定的连接基、肽酶敏感的连接基、光不稳定的连接基、二甲基连接基或含二硫键的连接基(chari等人，cancer res.52：127
‑
131(1992)；美国专利号5,208,020)。
[0071]
药物组合物
[0072]
在另一方面，提供了包含本文所提供的缀合物中任一者的药物组合物，其例如用于以下治疗方法中的任一者中。在一个方面，药物组合物包含本文所提供的缀合物中的任一者以及药用载体。在另一方面，药物组合物包含本文所提供的缀合物中的任一者以及如下文所述的至少一种附加治疗剂。
[0073]
本文所述的缀合物的药物组合物通过将此类具有所需纯度的缀合物与一种或多种任选的药用载体混合(remington
′
s pharmaceutical sciences第16版，osol，a.ed.(1980))，制成冻干组合物或水溶液的形式。药用载体通常在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，包括但不限于：缓冲剂，诸如组氨酸、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3
‑
戊醇；间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(peg)。本文的示例性药用载体进一步包含间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(shasegp)，例如，人类可溶性ph
‑
20透明质酸酶糖蛋白，诸如rhuph20(halozyme，inc.)。某些示例性shasegp和使用方法，包括rhuph20，描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面中，将shasegp与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。
[0074]
本文的药物组合物还可含有多于一种对于所治疗的特定适应症是必需的活性成
分，优选是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。
[0075]
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或在粗乳液中。此类技术公开于remington
′
s pharmaceutical sciences第16版，osol，a.ed.(1980)。
[0076]
可以制备用于缓释的药物组合物。缓释制剂的合适实例包括含有缀合物的固态疏水聚合物的半透性基质，这些基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。
[0077]
如本文所用，术语“寡核苷酸”定义为如技术人员通常理解的包含两个或以上共价联接的核苷的分子。这样的共价结合的核苷也可以称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常在实验室中通过固相化学合成然后纯化的方式制备。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸。
[0078]
如本文所用，术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸，特别是与靶核酸上的连续序列(子序列)杂交来调节靶基因的表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，因此不是sirna。优选地，本发明的反义寡核苷酸是单链的。
[0079]
lna反义寡核苷酸是包含至少一个lna核苷的反义寡核苷酸。在一些实施例中，lna反义寡核苷酸为lna缺口聚物寡核苷酸。
[0080]
术语“连续核苷酸序列”是指与靶核酸互补的寡核苷酸区域。该术语在本文中与术语“连续核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”互换地使用。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷酸构成连续核苷酸序列。在一些实施例中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列，并且可任选地包含其他核苷酸，例如可用于将官能团接合至连续核苷酸序列的核苷酸连接基区域。核苷酸连接基区域可以与靶核酸互补或可以不互补。
[0081]
核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的结构单元，并且出于本发明的目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。实际上，核苷酸诸如dna和rna核苷酸包括核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸酯基团(它们在核苷中不存在)。核苷和核苷酸也可以可互换地称为“单元”或“单体”。
[0082]
如本文所用，术语“经修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与同等的dna或rna核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。在一些实施例中，经修饰的核苷包含经修饰的糖部分。术语经修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或经修饰的“单元”或经修饰的“单体”互换地使用。
[0083]
如技术人员通常所理解的，术语“经修饰的核苷间键”定义为除磷酸二酯(po)键以外的键，其将两个核苷共价偶联在一起。包含修饰的核苷间键的核苷酸也称为“经修饰的核苷酸”。在一些实施例中，与磷酸二酯键相比，经修饰的核苷间键增加了寡核苷酸的核酸酶抗性。对于天然存在的寡核苷酸，核苷间键包括在相邻核苷之间产生磷酸二酯键的磷酸酯基团。经修饰的核苷间键特别可用于稳定寡核苷酸供体内使用，并且可以在本发明寡核苷酸中的dna核苷或rna核苷区域(例如在缺口聚物寡核苷酸的缺口区内部)以及在经修饰的核苷区域中起到保护免受核酸酶剪切的作用。
[0084]
在一个实施例中，寡核苷酸包含一个或多个由天然磷酸二酯修饰为例如对核酸酶的攻击更具抗性的核苷间键。核酸酶抗性可以通过在血清中孵育寡核苷酸或通过使用核酸酶抗性测定(例如蛇毒磷酸二酯酶(svpd))来确定，两者均是本领域中众所周知的。能够增强寡核苷酸的核酸酶抗性的核苷间键称为抗核酸酶核苷间键。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键经修饰，诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少90％的寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的核苷间键是经修饰的。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的全部核苷间键是经修饰的。应当认识到的是，在一些实施例中，将本发明的寡核苷酸与非核苷酸官能团诸如缀合物连接的核苷可以是磷酸二酯。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的所有核苷间键都是抗核酸酶核苷间键。
[0085]
经修饰的核苷间键可选自包含硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯(diphosphorothioate)及硼烷磷酸酯(boranophosphate)的组。在一些实施例中，经修饰的核苷间键与本发明的寡核苷酸的核糖核酸酶h募集兼容，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯。
[0086]
在一些实施例中，所述核苷间键包含硫(s)，诸如硫代磷酸酯核苷间键。
[0087]
硫代磷酸酯核苷间键由于核酸酶抗性、有益的药代动力学和易于制造而特别有用。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键是硫代磷酸酯，诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少90％的寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的核苷间键是硫代磷酸酯。在一些实施例中，所述寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的全部核苷间键均为硫代磷酸酯。
[0088]
在一些实施例中，该寡核苷酸包含一个或多个中性核苷间键，特别是选自磷酸三酯、甲基膦酸酯、mmi、酰胺
‑
3、甲缩醛或硫代甲缩醛的核苷间键。
[0089]
其他的核苷间键公开于wo2009/124238中(以引用方式并入本文中)。在一实施例中，该核苷间键选自公开于wo2007/031091中的接头(以引用方式并入本文中)。特别是，该核苷间键可选自
‑
o
‑
p(o)2‑
o
‑
、
‑
o
‑
p(o，s)
‑
o
‑
、
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‑
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‑
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‑
、
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‑
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‑
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、
‑
nrh
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‑
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‑
，并且/或者核苷间连接基可选自由以下项组成的组：
‑
o
‑
co
‑
o
‑
、
‑
o
‑
co
‑
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、
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ch2‑
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、
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‑
co
‑
、
‑
ch2‑
nch3‑
o
‑
ch2‑
，其中rh选自氢和c1‑4烷基。
[0090]
抗核酸酶键诸如硫代磷酸酯键，在与靶标核酸形成双链体时能够募集核酸酶的寡核苷酸区域中特别有用，诸如缺口聚物的区域g或尾聚物和头聚物的未修饰的核苷区域。但是，硫代磷酸酯键合也可用于非核酸酶募集区域和/或亲和力增强区域，如缺口聚物的区域f和f
′
或尾聚物和头聚物的未修饰的核苷区域。
[0091]
但是，设计区域中的每一个均可包含除硫代磷酸酯以外的核苷间键，例如磷酸二酯键，特别是在经修饰的核苷(例如lna)保护键免于核酸酶降解的区域中。特别是，在经修饰的核苷单元之间或邻近区域(通常在非核酸酶募集区域)包含磷酸二酯键诸如一个或两个键，可改变寡核苷酸的生物利用度和/或生物分布，参见wo2008/113832，该专利以引用方式并入本文。
[0092]
在一个实施例中，寡核苷酸中的所有核苷间键均为硫代磷酸酯键和/或硼烷磷酸酯键。在一些实施例中，寡核苷酸中的核苷间键均为硫代磷酸酯键。
[0093]
术语“核碱基”包括存在于核苷及核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤及鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的背景中，术语“核碱基”也涵盖经修饰的核碱基，其可以不同于天然存在的核碱基，但是在核酸杂交期间起作用。在此背景中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。此类变体例如描述于hirao等人(2012)accounts of chemical research第45卷第2055页和bergstrom(2009)current protocols in nucleic acid chemistry suppl.371.4.1中。
[0094]
在一些实施例中，核碱基部分被修饰，其方式是将嘌呤或嘧啶改变为经修饰的嘌呤或嘧啶，诸如取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5
‑
甲基胞嘧啶、5
‑
噻唑胞嘧啶、5
‑
丙炔基胞嘧啶、5
‑
丙炔基尿嘧啶、5
‑
溴尿嘧啶、5
‑
噻唑尿嘧啶、2
‑
硫代尿嘧啶、2’硫代胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6
‑
氨基嘌呤、2
‑
氨基嘌呤、2，6
‑
二氨基嘌呤和2
‑
氯
‑6‑
氨基嘌呤的核碱基。
[0095]
核碱基部分可以由每一个相应核碱基的字母代码来表示，例如a、t、g、c或u，其中每一个字母可以任选地包括具有同等功能的经修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，核碱基部分选自a、t、g、c和5
‑
甲基胞嘧啶。任选地，对于lna缺口聚物，可以使用5
‑
甲基胞嘧啶lna核苷。
[0096]
术语经修饰的寡核苷酸描述了一种寡核苷酸，其包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间键。术语“嵌合”寡核苷酸是在文献中已用于描述具有修饰的核苷的寡核苷酸的术语。
[0097]
术语“互补性”描述了核苷/核苷酸的watson
‑
crick碱基配对的能力。watson
‑
crick碱基对是鸟嘌呤(g)
‑
胞嘧啶(c)和腺嘌呤(a)
‑
胸腺嘧啶(t)/尿嘧啶(u)。应当理解，寡核苷酸可包含具有修饰的核碱基的核苷，例如，经常使用5
‑
甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，因此，术语“互补性”涵盖未修饰的和经修饰的核碱基之间的watson crick碱基配对(参见例如hirao等人(2012)accounts of chemical research第45卷第2055页和bergstrom(2009)current protocols in nucleic acid chemistry suppl.371.4.1)。
[0098]
本文所用术语“％互补”是指在给定位置，与不同的核酸分子(例如靶核酸)在给定位置处的连续核苷酸序列互补(即与之形成watson crick碱基对)的核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的核苷酸数的百分比。通过以下方式计算百分比：计数两个序列之间形成配对的对齐碱基的数目，除以寡核苷酸中核苷酸的总数并且乘以100。在这种比较中，未对齐(形成碱基对)的核碱基/核苷酸被称为错配。
[0099]
术语“完全互补”是指100％的互补性。
[0100]
如本文所用，术语“同一性”是指在给定位置，与不同的核酸分子(例如靶核酸)在给定位置处的连续核苷酸序列相同(即在其与互补性核苷形成watson crick碱基对的能力方面)的核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的核苷酸数的百分比。通过以下方式计算该百分比：计数两个序列(包括缺口)之间相同的对齐碱基的数目，除以寡核苷酸中核苷酸的总数并且乘以100。同一性百分比＝(匹配
×
100)/对齐区域(包括缺口)的长度。
[0101]
如本文所用，术语“杂交”(hybridizing/hybridizes)应当理解为两条核酸链在相
反链上的碱基对之间形成氢键从而形成双链体(例如寡核苷酸和靶核酸)。两条核酸链之间结合的亲和力是杂交的强度。它通常用解链温度(tm)来描述，解链温度(tm)定义为一半寡核苷酸与靶核酸形成双链体的温度。在生理条件下，tm与亲和力并非严格成正比(mergny和lacroix，2003，oligonucleotides 13：515
‑
537)。标准状态吉布斯自由能δg
°
是结合亲和力的更精确的表述并且与反应的解离常数(kd)通过δg
°
＝
‑
rtln(kd)相关，其中r是气体常数并且t是绝对温度。因此，寡核苷酸与靶核酸之间反应的非常低的δg
°
反映了寡核苷酸和靶核酸之间强力杂交。δg
°
是与其中水浓度为1m、ph为7并且温度为37℃的反应相关的能量。寡核苷酸与靶核酸杂交是自发反应，并且对于自发反应，δg
°
小于零。δg
°
可实验上测量，例如，可利用如hansen等人，1965，chem.comm.36
‑
38及holdgate等人2005年在drug discov today中所描述的等温滴定量热(itc)法测量。本领域的技术人员将知道商业设备可用于测量δg
°
。也可以通过使用如santalucia，1998，proc natl acad sci usa.95：1460
‑
1465所述的最近相邻模型，适当使用sugimoto等人，1995，biochemistry34：11211
‑
11216和mctigue等人，2004，biochemistry 43：5388
‑
5405描述的推导的热力学参数在数值上估计δg
°
。为了具有通过杂交调节其预期的核酸靶标的可能性，对于长度为10
‑
30个核苷酸的寡核苷酸，本发明的寡核苷酸以低于
‑
10kcal的δg
°
估值与靶核酸杂交。在一些实施例中，依据标准状态吉布斯自由能δg
°
测量杂交的程度或强度。对于长度为8
‑
30个核苷酸的寡核苷酸，寡核苷酸可与靶核酸以低于
‑
10kcal，诸如低于
‑
15kcal、诸如低于
‑
20kcal和诸如低于
‑
25kcal的δg
°
估值杂交。在一些实施例中，寡核苷酸与靶核酸以
‑
10kcal至
‑
60kcal诸如
‑
12kcal至
‑
40kcal诸如
‑
15kcal至
‑
30kcal或
‑
16kcal至
‑
27kcal诸如
‑
18kcal至
‑
25kcal的δg
°
估计值杂交。
[0102]
本文所用的术语“靶序列”意指存在于靶核酸中的核苷酸的序列，其包含与本发明的寡核苷酸为互补的核碱基序列。在一些实施例中，靶序列由靶核酸上的区域组成，所述区域具有与本发明的寡核苷酸的连续核苷酸序列互补的核碱基序列。在一些实施例中，所述靶序列比单一寡核苷酸的互补序列更长，并且可以例如代表所述靶核酸的被本发明的若干寡核苷酸所靶向的优选区域。
[0103]
靶序列可以是靶核酸的子序列。
[0104]
寡核苷酸包含与靶核酸(诸如靶核酸的子序列，诸如本文所述的靶序列)互补或杂交的连续核苷酸序列。
[0105]
寡核苷酸包含与靶核酸分子中存在的靶序列互补或杂交的具有至少8个核苷酸的连续核苷酸序列。连续核苷酸序列(以及因此靶序列)包含至少8个连续核苷酸，诸如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续核苷酸，诸如12
‑
25个连续核苷酸，诸如14
‑
18个连续核苷酸。
[0106]
本文所用的术语“靶细胞”是指正在表达靶核酸的细胞。在一些实施例中，靶细胞可以在体内或体外。在一些实施例中，所述靶细胞是哺乳动物细胞，诸如啮齿动物细胞，诸如小鼠细胞或大鼠细胞，或灵长类动物细胞，诸如猴子细胞或人类细胞。
[0107]
本文所用的术语“表达的调节(modulation of expression)”是一个总体术语，用以描述与施用寡核苷酸前的靶基因表达量相比，所述寡核苷酸改变靶基因表达量的能力。备选地，表达的调节可参照对照实验进行确定。如普遍所知，对照是以盐水组合物处理的单个或靶细胞，或是以非靶向寡核苷酸(模拟品)处理的单个或靶细胞。但是，对照也可以是接
受标准护理的个体。
[0108]
一种调节类型是寡核苷酸抑制、下调、降低、阻遏、去除、停止、阻断、阻止、减少、减低、避免或终止nf
‑
k b2表达的能力，例如通过降解mrna或阻断转录来实现。
[0109]
高亲和力修饰的核苷是一种经修饰的核苷，当并入所述寡核苷酸中时，可增强所述寡核苷酸对其互补靶的亲和力，例如以解链温度(tm)所测定的。本发明的高亲和力修饰的核苷优选地使每一经修饰的核苷的解链温度增加 0.5℃至 12℃，更优选地是 1.5℃至 10℃，最优选地是 3℃至 8℃。许多高亲和力修饰的核苷是本领域已知的，并且包括例如许多2’取代的核苷以及锁核酸(lna)(参见例如freier&altmann；nucl.acid res.，1997，25，4429
‑
4443和uhlmann；curr.opinion in drug development，2000，3(2)，293
‑
213)。
[0110]
与dna和rna中发现的核糖部分相比时，本发明的寡聚物可包含一种或多种具有经修饰的糖部分(即糖部分的修饰)的核苷。
[0111]
已经制备了许多具有核糖部分的修饰的核苷，主要目的是改善寡核苷酸的某些性质，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。
[0112]
这些修饰包括这样的修饰，其中对核糖环结构进行修饰，例如替代为己糖环(hna)或双环，其通常在核糖环(lna)上的c2与c4碳原子之间具有双基桥(biradicle bridge)的双环，或通常在c2与c3碳原子之间缺少键的未连接的核糖环(例如una)。其他糖修饰的核苷包括，例如，双环己糖核酸(wo2011/017521)或三环核酸(wo2013/154798)。经修饰的核苷还包括其中糖部分被替换为非糖部分的核苷，例如在肽核酸(pna)或吗啉代核酸的情况下。
[0113]
糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基更改为氢以外的基团或天然存在于dna和rna核苷中的2
′‑
oh基团所做出的修饰。例如，可以在2
′
、3
′
、4
′
或5
′
位置引入取代基。具有经修饰糖部分的核苷还包括2
′
修饰的核苷，例如2
′
取代的核苷。事实上，人们已花费很多精力开发2
′
取代的核苷，并且发现许多2
′
取代的核苷并入寡核苷酸后具有有益的特性，诸如增强的核苷抗性和增强的亲和力。
[0114]
lna核苷是经修饰的核苷，其在核苷酸的核糖环的c2
′
与c4
′
之间包含连接基基团(称为双基或桥)。这些核苷在文献中也称为桥连核酸或双环核酸(bna)。示例性lna核苷公开于wo99/014226、wo00/66604、wo98/039352、wo2004/046160、wo00/047599、wo10036698、wo07090071、wo2010/036698和wo11156202中。
[0115]
核酸酶介导的降解意指一寡核苷酸能够在与互补核苷酸序列形成双链体时，居中影响所述序列的降解。
[0116]
在一些实施例中，寡核苷酸可经由靶核酸的核酸酶介导的降解而发挥作用，其中本发明的寡核苷酸能够募集核酸酶，特别是核酸内切酶，优选内切核糖核酸酶(rnase)诸如核糖核酸酶h。经由核酸酶介导的机制而运作的寡核苷酸设计实例是这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸通常包含一个长度为至少5或6个连续dna核苷的区域，并且在所述区域的一例或两侧上侧接有亲和力增强核苷，例如缺口聚物、头聚物及尾聚物。
[0117]
反义寡核苷酸的核糖核酸酶h活性是指其与互补rna分子形成双链体时募集核糖核酸酶h的能力。wo01/23613提供了用于确定核糖核酸酶h活性的体外方法，其可以用于确定募集核糖核酸酶h的能力。如果寡核苷酸在提供互补靶核酸序列时具有的初始速率是使用wo01/23613(通过引用并入本文)示例91至95提供的方法测量(以pmol/l/min计)具有与所测试修饰的寡核苷酸相同的碱基序列但仅包含在寡核苷酸中所有单体之间均具有硫代
磷酸酯键合的dna单体的寡核苷酸初始速率的至少5％，诸如至少10％或超过20％时，则一般认为能够募集核糖核酸酶h。
[0118]
如本文所用，术语“缺口聚物”是指一种反义寡核苷酸，其包含核糖核酸酶h募集寡核苷酸(缺口)的区域，该区域在5
′
端和3
′
端侧接有包含一个或多个亲和力增强修饰核苷(侧翼或翼)的区域。各种缺口聚物设计如本文所述。尾聚物和头聚物是能够募集核糖核酸酶h的寡核苷酸，其中侧翼之一缺失，即该寡核苷酸仅有一个末端包含亲和力增强修饰核苷。头聚物缺失3
′
侧翼(即5
′
侧翼包含亲和力增强修饰核苷)，尾聚物则缺失5
′
侧翼(即3
′
侧翼包含亲和力增强修饰核苷)。
[0119]
术语lna缺口聚物是指一种缺口聚物寡核苷酸，其中亲和力增强修饰核苷中的至少一个为lna核苷。
[0120]
术语混合翼缺口聚物或混合侧翼缺口聚物是指这样的lna缺口聚物，其中侧翼区域中的至少一个包含至少一个lna核苷和至少一个非lna修饰的核苷，诸如至少一个2
′
取代的修饰的核苷，诸如一个或多个
′‑
o
‑
烷基
‑
rna、2
′‑
o
‑
甲基
‑
rna、2
′‑
烷氧基
‑
rna、2
′‑
o
‑
甲氧基乙基
‑
rna(moe)、2
′‑
氨基
‑
dna、2
′‑
氟
‑
rna和2
′‑
f
‑
ana核苷。在一些实施例中，混合翼缺口聚物具有一个仅包含lna核苷(例如5
′
或3
′
)的侧翼，而另一个侧翼(分别为3
′
或5
′
)包含2
′
取代的修饰的核苷并且任选地包含lna核苷。
[0121]
实例
[0122]
生物大分子具有多样化的生化活性和无与伦比的特异性，因此是引人关注的药物。虽然细胞外生物大分子疗法(尤其是重组蛋白和治疗性抗体)为多个医学领域带来了变革，但这些形式作为采用细胞内作用机制的市售产品的使用仍然仅限于六种寡核苷酸或寡核苷酸类似物(福米韦生(fomiversen)、米泊美生(mipomersen)、伊诺特生(inotersen)、帕替斯垣(patisiran)、诺西那生钠(nusinersen)和依特立生(eteplirsen))以及原位施用的病毒形式阿利泼金(alipogene tiparvovec)和voretigene neparvovec(1，7，8)。
[0123]
采用细胞内作用机制的生物大分子的使用主要受到两个因素的限制，即全身药代动力学和内溶酶体系统引起的细胞内隔离。发生胞吞后，新生内体通过蛋白酶、核酸酶和还原酶的逐渐酸化的环境进行运输。
[0124]
本发明通过使游离细胞表面硫醇与细胞表面的系链生物大分子结合，增强局部药代动力学，并且利用这些跨膜蛋白的自然循环来克服这两个障碍。
[0125]
lna起到降低细胞内mrna转录物水平的作用，其通过以互补序列特异性方式与mrna结合、用作核糖核酸酶h底物诱导靶标降解或通过阻断mrna的核糖体翻译以降低蛋白质水平来实现。
[0126]
本发明使用edc/nhs化学方法将aspa化学缀合至来自硫代磷酸化缺口聚物lna的5
′
氨基己基侧基，并且利用hplc纯化这些分子。在细胞摄取研究中，母体lna含有异硫氰酸荧光素部分，使我们能够通过荧光显微镜定位细胞内的该分子。
[0127]
在细胞摄取研究中，带有异硫氰酸荧光素(fitc)标记的lna在未修饰的情况下使用，或与aspa缀合后使用。将hce
‑
t细胞用一系列稀释的lna储备液按指定的剂量处理，并且按照“细胞摄取方法”进行洗涤。当定量分析这些图像时，发现lna缀合增强了细胞摄取，产生了比未修饰的lna剂量高约10倍的等效细胞内荧光，如图1a所示。将经过aspa修饰的lna绘制为蓝色的左侧曲线，而未经修饰的lna则绘制为红色的右侧曲线。经aspa修饰的lna相
对于未修饰lna的向左偏移表明，aspa靶向增强了这些条件下的细胞摄取和保留。由该实验得到的代表性图像如图1b所示，经aspa修饰的lna的剂量为200nm，而未修饰的lna的剂量为170nm；蓝色代表经dapi染色的细胞核，绿色代表内化的lna。这些结果表明，相对于未修饰的lna，aspa诱导增强了lna的细胞内摄取、积累和保留。
[0128]
为测试aspa lna缀合物的活性，将hce
‑
t细胞用缓冲液或40nm lna(由包含或不含aspa修饰的乱序非靶向序列或包含和不含aspa靶向的靶向malat1转录物的有效lna组成)进行处理，如图4所示。靶向和非靶向对照序列(“scr”)均表现出适度的malat1转录物脱靶效应，结果无统计学意义。经靶向malat1 mrna的未修饰lna处理的细胞显示malat1转录物水平略有增加，而靶向malat1的aspa lna诱导了具有统计学意义的malat1减少。这些结果表明，lna的aspa修饰诱导了靶向malat1转录物的lna分子的生物活性增强。由于qpcr专门测量mrna的相对含量，因此这些结果表明aspa修饰的lna保留了强大的核糖核酸酶h活性，也表明aspa使lna能够从内型
‑
溶酶体捕获并且运输到核糖核酸酶h所在的细胞核。
[0129]
总之，这些数据表明，aspa与lna的结合通过增强lna的细胞内积累增强了lna的生物活性，并且使lna能够递送至细胞核，其中核糖核酸酶h活性以有效的特异性方式降解靶序列(在这种情况下是malat1)。
[0130]
方法：
[0131]
1.靶向配体1，2
‑
二硫环戊烷
‑4‑
甲酸(aspa)的结构
[0132][0133]
2. 1，2
‑
二硫环戊烷
‑4‑
甲酸与己氨基修饰的lna的化学缀合反应方案
[0134][0135]
硫代磷酸化的lna通过标准亚磷酰胺化学方法合成，并以5
′
己氨基连接基封端。将sml 1，2
‑
二硫环戊烷
‑4‑
甲酸(芦笋酸，aspa)通过edc/nhs偶联与lna胺缀合，并且通过2
‑
丙醇沉淀和hplc进行纯化。将lna
‑
aspa缀合物施加于pbs中的arpe
‑
19和hce
‑
t细胞处理30分钟，然后用全血清培养基洗涤，模拟滴眼液滴注和泪液蛋白攻击。
[0136]
hce
‑
t细胞培养
[0137]
根据与范德堡大学的材料转移协议，从罗氏非临床生物库获得hce
‑
t细胞。在以下“扩增培养基”中扩增细胞：含hepes的gibco dmem/f12(目录号31330)，其补充有10％v/v fbs并且不含抗生素。所有细胞操作均使用胶原包覆的培养器皿进行。将purecol胶原i溶液(advanced biomatrix，目录号5005)用pbs稀释至100μg/ml，并且在室温下孵育1
‑
2h，然后用磷酸盐缓冲盐水冲洗一次。然后平板立即使用或在无菌条件下风干后备用。
[0138]
锁核酸
[0139]
完全硫代磷酸化的lna缺口聚物购自qiagen sciences(美国马里兰州)，其带有己氨基连接基。一些lna还具有用于细胞摄取研究的荧光素修饰。小分子靶向配体1，2
‑
二硫环戊烷
‑4‑
甲酸(medchemexpress，目录号：hy
‑
50730)使用1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳
adenine，cytosine，guanine，5
‑
methylcytosine，thymine and uracil bicyclonucleoside monomers，oligomerisation，and unprecedented nucleic acid recognition.tetrahedron 54，3607
‑
3630(1998).
[0150]
6.kumar，r.等人the first analogues of lna(locked nucleic acids)：phosphorothioate
‑
lna and 2
′‑
thio
‑
lna.bioorg.med.chem.lett.8，2219
‑
22(1998).
[0151]
7.stein，c.a.&castanotto，d.fda
‑
approved oligonucleotide therapies in 2017.mol.ther.25，1069
‑
1075(2017).
[0152]
8.akcea therapeutics press release.akcea and ionis receive fda approval of tegseditm(inotersen)for the treatment of the polyneuropathy of hereditary transthyretin
‑
mediated amyloidosis in adults.(2018).可在：https：//ir.akceatx.com/news
‑
releases/news
‑
release
‑
details/akcea
‑
and
‑
ionis
‑
receive
‑
fda
‑
approval
‑
tegseditm
‑
inotersen获得.(accessed：2018年10月25日)
[0153]
9.hermanson，g.t.zero
‑
length crosslinkers.in bioconjugate techniques 259
‑
273(2013).doi：10.1016/b978
‑0‑
12
‑
382239
‑
0.00004
‑
2.