一种中药组合物在制备减轻抗癌药所致心脏毒性的药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及医药技术领域，更具体地，涉及一种中药组合物在制备减轻抗癌药所致心脏毒性的药物中的应用。


背景技术：

2.癌症(恶性肿瘤)严重危害人类健康。抗癌药(小分子化学药物和抗体药物)抑制肿瘤细胞生长的治疗方法是治疗癌症的基础手段。但抗癌药治疗中引起的毒副反应如消化道不良反应、骨髓抑制、重要脏器(心、肝、肾、肺)损害等，同时对肿瘤患者身心造成额外损害。其中心脏毒性是抗癌药毒副作用的一个共性问题。一些常用肿瘤化疗药物都有心脏毒性，可引起心肌细胞死亡和纤维化、心肌病、心力衰竭，诱发心律失常。引起心肌毒性的可能机制包括诱导心肌细胞凋亡、线粒体功能障碍、氧化应激失衡等。严重限制了肿瘤化疗药物的疗效和使用时间。其中，环磷酰胺引起心脏毒性的总体发生率为7％
‑
28％，大部分为左室功能障碍；阿霉素引起心脏损伤的总体发生率可达8％
‑
26；紫杉醇引起心脏损伤的总体发生率为5％
‑
30％；赫赛汀(曲妥珠单抗)有发生左心室功能障碍的危险，其引发心脏损伤的总体发生率为7％
‑
28％；贝伐单抗有促使血栓形成引起心绞痛、心肌梗死及心力衰竭的报道(zamorano jl,et al.2016esc position paper on cancer treatments and cardiovascular toxicity developed under the auspices of the esccommittee for practice guidelines:the task force for cancer treatments and cardiovascular toxicity of the european society of cardiology(esc).europeanheart journal 2016；37(36):2768
‑
2801)。
3.右丙亚胺具有清除自由基和抗氧化的作用，是被批准的用于预防蒽环类药物所致心脏毒性的药物，但有加重化疗药物引起的骨髓抑制的风险。相比于化学药物，中药具有副作用小、多环节整体性治疗等优势，因此，开发新型天然的中药方用于消除抗癌药的心脏毒性副作用具有重要的应用价值。如专利cn201510761657.4提供了一种中药组合物，该组合物的提取液与阿霉素联合用药能够显著减轻阿霉素诱导的心脏毒性，提高小鼠心肌收缩功能。但目前整体上用于减缓肿瘤化疗药物毒副作用的药物较为缺乏。


技术实现要素：

4.本发明针对现有技术的不足，旨在开发一种中药组方用于减轻或消除肿瘤化疗药物导致的毒性尤其是心脏毒性损伤，维护心脏的正常结构和功能，以及增强抗癌药物化疗效果，老药新用，也为临床上减缓肿瘤化疗药物毒副作用的药物提供了一种新选择。
5.本发明的首要目的是提供一种中药组合物在制备减缓抗癌药物毒性的药物中的应用。
6.本发明的另一目的是提供一种中药组合物在制备抗癌药物增效剂中的应用。
7.为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
8.本发明首先提供了一种中药组合物在制备减缓抗癌药物毒性的药物中的应用，所述中药组合物由以下重量份的各组分组成：
9.制附子20～30份、淫羊藿10～15份、干姜10～15份、甘草10～15份、人参6～12份、丹参6～12份、虎杖6～12份、茯苓6～12份、黄柏3～5份、黄芩2～4。
10.上述中药组合物为本发明发明人前期研制的一种用于治疗治疗艾滋病的药物组合物，发明人在药理学实验中，意外地发现该组合物能够改善抗癌药引起的白细胞、血小板及淋巴细胞数目显著减少，改善抗癌药引起的心肌细胞体积明显肥大、心肌纤维紊乱、断裂、心肌细胞核增大、核染色质固缩或消失、心肌细胞内空泡形成、肌质溶解为表现形式的心脏毒性，改善抗癌药引起的心脏指数异常增大、心肌激酶ck及ckmb的异常升高和过氧化指标mda水平的异常升高、抗氧化指标gsh、sod水平异常降低，改善抗癌药引起的凋亡蛋白bax过度表达、抗凋亡蛋白bcl
‑
2表达的异常降低、心肌细胞pi3k/akt通路蛋白表达的异常降低为表现的心肌细胞过度凋亡，改善抗癌药引起的倦怠，恶寒，食少，体重减轻、脾肾阳虚证，可显著减少抗癌药及肿瘤化疗药物毒性作用，由此，开发了老药方的新用途，也为消除或减少肿瘤化疗药物毒副作用提供了一种新的药物选择。
11.因此，优选地，所述毒性为心脏毒性。所述心脏毒性包括心肌细胞死亡和/或纤维化、心肌病、心力衰竭、心律失常。
12.优选地，所述中药组合物由以下重量份的各组分组成：
13.制附子20份、淫羊藿10份、干姜10份、甘草10份、人参6份、丹参6份、虎杖6份、茯苓6份、黄柏3份、黄芩3份。
14.作为一种优选地可实施方式，所述中药组合物是将原料药先经水提，后经醇提得到。
15.优选地，所述中药组合物的制备方法包括如下步骤：
16.s1.取原料药，加水煎煮3～4次，每次加入15～25倍量的水，煎煮2～3h，放冷，滤过，合并滤液；
17.s2.将滤液离心，取上清液并浓缩至原料药重，得水提浓液；
18.s3.在水提浓液加入两倍体积浓度为85～95％(v/v)的乙醇，搅拌均匀，静置6～10小时，离心，取上清液，去除乙醇，浓缩干燥，即得到所述中药组合物。
19.此外，本发明在研究中也研究表明，环磷酰胺联用本发明中药组合物治疗后，pi3k及akt两种蛋白的表达明显增强，环磷酰胺化疗联合中药组合物治疗组比环磷酰胺单独化疗组的瘤重显著减小，表明该中药组合物还具有显著增强抗癌药抑制肿瘤效果的作用。
20.因此，本发明还提供了一种中药组合物在制备抗癌药物增效剂中的应用，所述中药组合物由以下重量份的各组分组成：
21.制附子20～30份、淫羊藿10～15份、干姜10～15份、甘草10～15份、人参6～12份、丹参6～12份、虎杖6～12份、茯苓6～12份、黄柏3～5份、黄芩2～4份。
22.最优选地，所述中药组合物由以下重量份的各组分组成：
23.制附子20份、淫羊藿10份、干姜10份、甘草10份、人参6份、丹参6份、虎杖6份、茯苓6份、黄柏3份、黄芩3份。
24.优选地，所述抗癌药物包括能引起前述心脏毒性的蒽环类药物、环磷酰胺、异环磷酰胺、曲妥珠单抗、贝伐单抗类靶向药物、紫杉烷类药物。如环磷酰胺(ctx)、阿霉素、紫杉醇
等等。
25.优选地，当应用对象为动物(例如小鼠)时，所述中药组合物的有效剂量为0.65～2.6g/kg/d。当应用对象为人时，可按照药学领域的相关给药标准，相应折算成人体的给药量。
26.本发明的中药组合物可制备成药学上可接受的剂型，包括片剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、微囊、微球、注射液、脂质体或气雾剂等，用于减缓抗癌药及肿瘤化疗药物毒性，以及增强抗癌药抑制肿瘤的效果。
27.本发明所述中药组合物的质量控制方法包括如下步骤：
28.(1)按照中国药典薄层色谱法项下规定的方法，组合物中乌头碱限量，不得多于规定限度；组合物中应检出淫羊藿、甘草、虎杖、干姜、人参和黄芩；
29.(2)按照中国药典高效液相色谱法项下规定的方法，组合物中双酯型生物碱乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的总量不得超过规定限度；组合物中淫羊藿苷、甘草酸、虎杖苷和黄芩苷的含量不得低于规定限度。
30.在专利cn102641489b中，也充分显示了该中药组合物具有的安全性。本发明为消除肿瘤化疗药物导致的毒副作用以及抗癌药增效提供了一种安全、有效的方案。
31.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
32.本发明的中药组合物可有效减轻肿瘤化疗药物造成的毒副反应，尤其是心脏毒性，缓解ctx引起的心肌酶异常升高、缓解氧化应激失衡和心肌细胞凋亡，上调了pi3k和akt通路蛋白表达水平，通过激活pi3k/akt信号通路抑制下游促凋亡蛋白的表达，从而抑制acr诱导的h9c2细胞凋亡，减轻心肌细胞肿胀或空泡化，肌纤维紊乱或断裂，细胞核聚集、固缩等病变，维护心脏的正常结构和功能，降低死亡率，对消除肿瘤化疗药物导致的毒副作用特别是心脏毒性的药物具有重要的应用价值。此外，该组合物还能显著增强抗癌药抑制肿瘤效果的作用，为抗癌药物提供了一种新的增效剂。
附图说明
33.图1各组动物给药期间体重变化对比。
34.图2肿瘤化疗药组与(肿瘤化疗药 中药组合物)组小鼠的生存曲线。
35.图3中药组合物对肿瘤化药ctx所致心肌病理损害的改善作用(he，
×
200)。
36.图4各组动物肝、脾、肺、肾(由上至下)组织形态学(he，
×
200)。
37.图5中药组合物显著减少肿瘤化疗药ctx致心脏毒小鼠心脏肿大(与正常对照组相比，
*
p<0.05；与肿瘤化疗药组相比，
▲▲
p<0.01)。
38.图6的a图为中药组合物对ctx致心脏毒小鼠心肌损伤指标ck、ck
‑
mb的改善作用(mean
±
se)。与正常对照组相比，
***
p<0.001；与肿瘤化疗药组相比，
▲
p<0.05；
▲▲▲
p<0.001。图6的b图为中药组合物对ctx致心脏毒小鼠心肌损伤指标gsh、mda、sod的改善作用(mean
±
se)。与正常对照组相比，
*
p<0.05，
***
p<0.001；与肿瘤化疗药组相比，
▲▲
p<0.01；
▲▲▲
p<0.001。
39.图7中药组合物减轻肿瘤化疗药ctx致小鼠心脏组织病变的作用(he，
×
200)。
40.图8中药组合物对ctx致心脏毒小鼠心肌凋亡指标bax及bcl
‑
2表达的影响。
41.图9中药组合物对荷瘤小鼠ck及ck
‑
mb的影响。与肿瘤模型对照组相比，
***
p<
0.001；与ctx单独化疗组相比，
▲▲
p<0.01，
▲▲▲
p<0.001。
42.图10中药组合物对各组荷瘤小鼠sod及mda的影响。与肿瘤模型对照组相比，
***
p<0.001；与ctx单独化疗组相比，
▲▲▲
p<0.001。
43.图11中药组合物对荷瘤小鼠心脏组织形态学的影响(he，
×
400)。
44.图12中药组合物对荷瘤小鼠ctx化疗后心肌bax及bcl
‑
2表达的影响。
45.图13各组小鼠治疗后心肌pi3k及akt表达的影响(免疫印迹法)。
46.图14各组小鼠治疗后心肌pi3k及akt表达的影响(免疫组化法；
×
200)。
47.图15中药组合物增效ctx的体内抗癌作用。与肿瘤模型对照组相比，
***
p<0.001；与ctx单独化疗组相比，
▲
p<0.05。
48.图16与正常h9c2细胞组(左)相比，中药组合物组(右)上调因acr损伤(中)组所降低的磷酸化pi3k、akt蛋白表达。
49.注：图1
‑
16中，ctx、肿瘤化疗药、肿瘤化药均指代环磷酰胺；中药复合物、中药组合物、中药均指的是实施例1中制备的中药组合物1。
具体实施方式
50.下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
51.本发明实施例中的药理实验在广州中医药大学实验动物中心进行，实验动物许可证号：syxk(粤)2018
‑
0034，广州中医药大学实验动物伦理委员会审核并通过动物实验伦理(批准号：20190305019)。
52.实施例1中药组合物及其制备
53.本实施例提供了七种中药组合物：
54.1、原料药组成
55.中药组合物1：
56.制附子20份、淫羊藿10份、干姜10份、甘草10份、人参6份、丹参6份、虎杖6份、茯苓6份、黄柏3份、黄芩3份。
57.中药组合物2：
58.制附子20份、淫羊藿14份、干姜15份、甘草10份、人参10份、茯苓12份、虎杖6份、丹参10份、黄柏5份、黄芩3份。
59.中药组合物3：
60.制附子30份、淫羊藿15份、干姜10份、甘草15份、人参6份、茯苓6份、虎杖10份、丹参12份、黄柏3份、黄芩4份。
61.中药组合物4：
62.制附子27份、淫羊藿10份、干姜12份、甘草13份、人参12份、茯苓9份、虎杖12份、丹参6份、黄柏4份、黄芩2份。
63.中药组合物5：
64.淫羊藿10份、甘草10份、人参6份、丹参6份、虎杖6份、茯苓6份、黄柏3份、黄芩3份。
65.中药组合物6：
66.制附子20份、干姜10份、甘草10份、丹参6份、虎杖6份、茯苓6份、黄柏3份、黄芩3份。
67.中药组合物7：
68.制附子10份、淫羊藿20份、干姜12.5份、甘草20份、人参7.82份、茯苓7.81份、虎杖7.81份、丹参7.81份、黄柏3.75份、黄芩2.5份。
69.2、药物制备
70.s1.照处方比例称取原料药，加纯水煎煮3次，每次加入20倍量的纯水，煎煮2h，放冷，滤过，合并滤液；
71.s2.将滤液以15000rpm的转速离心10分钟，取上清液，将上清液浓缩至药液体积以升计等于药材总质量以千克计(即与原料药等重)，得水提浓液；
72.s3.在水提浓液中加入两倍药液体积的含体积分数为95％的药用乙醇，搅拌均匀，静置6至10小时，以15000rpm的转速离心，取上清液，减压下回收乙醇并减压下浓缩成稠膏，喷雾干燥，或在80℃以下真空干燥、粉碎，即得到组合物1
‑
7。
73.3、参照专利cn102641489b的方法对得到的组合物进行质量控制
74.(1)按照中国药典薄层色谱法项下规定的方法，组合物中乌头碱限量，不得多于规定限度；组合物中应检出淫羊藿、甘草、虎杖、干姜、人参和黄芩；
75.(2)按照中国药典高效液相色谱法项下规定的方法，组合物中双酯型生物碱乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的总量不得超过规定限度；组合物中淫羊藿苷、甘草酸、虎杖苷和黄芩苷的含量不得低于规定限度。
76.实施例2中药组合物对肿瘤化疗药中毒小鼠的减毒作用
77.1.实验方法
78.1.1动物分组及处理
79.昆明种小鼠，8
‑
9周龄，体重25
±
3g。购于广州中医药大学实验动物中心，合格证号：scxk(粤)2018
‑
0001。
80.在spf级动物房适应性饲养一周，随机分组，每组8只(雌雄各半)。每天给药前称量体重，并观察记录一般状况。
81.正常对照组：纯水灌胃，0.3ml/次，自第1天起给药至第7天为止，1天1次，生理盐水(n.s.)第1
‑
4天0.3ml/次腹腔注射，1天1次。
82.肿瘤化疗药组：纯水灌胃，0.3ml/次，自第1天起至第7天为止，1天1次；肿瘤化疗药环磷酰胺(ctx)第1
‑
4天腹腔注射给药(第1、2天100mg/kg/d，第3、4天50mg/kg/d)。
83.(肿瘤化疗药 中药组合物)组：将实施例1制备的中药组合物1
‑
7分别按1.3g/kg/次给小鼠灌胃(相当于人用剂量的9倍)，自第1天起给药至第7天为止，1天1次；ctx第1
‑
4天腹腔注射，给药方案同肿瘤化疗药组。
84.实验周期8天，实验第7天各组小鼠均禁食，第8天使用1％戊巴比妥钠按0.01ml/g的剂量腹腔注射麻醉小鼠，麻醉后进行眼眶静脉丛采血，用含肝素的ep管取0.5ml全血测血常规，清洁ep管接取剩余血液，静置30分钟后4℃5000rpm离心10min，取上层血清150μl做生化检测，然后采用颈椎脱臼法处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾放入4％多聚甲醛溶液固定。此项实验进行了3次重复实验观察小鼠存活情况，观察周期延长至第15天，各组给药方案不变。
85.1.2生存曲线分析
86.记录各组小鼠实验观察期间的死亡数及存活数，将数据输入spss 23.0，对肿瘤化疗药组及(肿瘤化疗药 中药组合物)组小鼠的生存情况做生存曲线。
87.1.3血常规检测
88.使用siemens 2120i全自动血液分析仪对各组小鼠的白细胞(wbc)，红细胞(rbc)，血小板(plt)，血红蛋白(hgb)，淋巴细胞(lym)及单核细胞(mon)进行计数。
89.1.4生化指标检测
90.使用日立7080全自动生化分析仪检测各组小鼠的谷草转氨酶(ast)，谷丙转氨酶(alt)，肌酐(cre)及肌酸激酶(ck)。
91.1.5he染色
92.各组小鼠心、肝、脾、肺、肾组织在4％多聚甲醛固定24h后，参照文献(唐琴，青蒿琥酯改善博来霉素诱导的系统性硬化症肾脏和皮肤损伤的研究)记录的方法进行he染色。
93.1.6统计学分析
94.采用spss 23.0软件对数据进行统计学处理，计量资料进行正态性检验，符合正态分布则两组间比较采用两独立样本t检验，不符合正态分布采用mann
‑
whitney u检验；采用graphpad prism 8.0对统计数据进行作图。正态分布的数据用均数
±
标准误(mean
±
se)表示，非正态分布的数据用中位数联合四分位数表示，p<0.05表示差异具有统计学意义。
95.2.实验结果
96.2.1实验动物的一般状况
97.化药组小鼠给药后可见活动减少，恶寒蜷缩，毛发蓬松、竖立、无光泽，进食减少，体重减轻，部分小鼠可见轻微震颤；(ctx 中药组合物1)组小鼠给药后活动减少不明显，无明显畏寒蜷卧，竖毛等表现；而(ctx 中药组合物5)组动物对畏寒蜷卧症状改善不明显，体重下降趋势明显；(ctx 中药组合6～7)组动物对竖毛、皮毛无光泽、畏寒蜷卧症状改善不明显，体重下降趋势明显(表1)。ctx组和(ctx 中药组合物1)组相比，小鼠体重在给药初期都有下降，但在给药结束后，(ctx 中药组合物1)组体重恢复趋势更加明显(图1)。
98.表1动物给药后毒副作用表现对比
[0099][0100][0101]
此外，发明人也将组合物2
‑
4与肿瘤化疗药环磷酰胺(ctx)联用，结果显示小鼠给药后活动减少不明显，无明显畏寒蜷卧，竖毛等表现。
[0102]
2.2生存曲线分析
[0103]
肿瘤化药组小鼠54只(雌鼠7只，雄鼠47只)，共死亡15只，存活39只(雌鼠7只，雄鼠32只)；(肿瘤化药 中药组合物1)组小鼠52只(雌鼠6只，雄鼠46只)，共死亡2只，存活50只(雌鼠6只，雄鼠44只)，总生存情况显著优于单用肿瘤化疗药组(p＝0.0028)见图2。
[0104]
2.3中药组合物对ctx染毒小鼠血常规的影响
[0105]
与正常对照组比较，肿瘤化疗药组白细胞、血小板及淋巴细胞均出现显著性减少(p<0.001，p<0.001，p<0.01)，提示抗癌药环磷酰胺具有明显减少白细胞、血小板及淋巴细胞的毒副作用；(ctx 中药组合物1)组白细胞、血小板及淋巴细胞也均出现明显减少(p<0.001，p<0.001，p<0.01)，但减少幅度没有肿瘤化疗药组大，说明与ctx联用中药组合物后，环磷酰胺引起的白细胞、血小板及淋巴细胞数目减少情况得到了一定程度的缓解，中药组合物1有一定的减毒作用；中药组合物7的减毒作用与组合物1接近；但(ctx 中药组合5
‑
7)组对环磷酰胺引起的白细胞、血小板及淋巴细胞数目减少，缓解作用弱于组合物1(表2)。
[0106]
表2：各组小鼠血细胞计数比较(mean
±
se)
[0107][0108][0109]
注：与正常对照组相比，
**
p<0.01，
***
p<0.001。
[0110]
此外，发明人也将组合物2
‑
4与肿瘤化疗药环磷酰胺(ctx)联用，结果也表明，环磷酰胺引起的白细胞、血小板及淋巴细胞数目减少情况得到了一定程度的缓解，表明本发明的中药组合物有一定的减毒作用。
[0111]
2.4中药组合物对抗癌化药中毒小鼠主要脏器生化指标的影响
[0112]
生化检测结果如表3所示，各组小鼠肝肾功能主要指标ast、alt及cre无明显差异。肿瘤化疗药物组肌酸激酶ck较正常对照组明显升高(p<0.05)，提示本研究采用的肿瘤化疗药物ctx可能引起心肌损伤，ctx联用中药组合物1或中药组合物7后，ck水平有明显降低(p<0.05)，表明使用中药组合物治疗后能显著降低ctx引起的肌酸激酶异常升高，但以组合物1的作用较好。而ctx联用中药组合物5
‑
6对ctx引起的肌酸激酶异常升高没有明显影响。
[0113]
表3：各组小鼠血清ast、alt、cre、ck的比较(mean
±
se)
[0114][0115]
注：与正常对照组相比，
*
p<0.05；与肿瘤化疗药组相比，
▲
p<0.05。
[0116]
此外，发明人也将组合物2
‑
4与肿瘤化疗药环磷酰胺(ctx)联用，结果显示ck水平有明显降低，表明使用本发明的中药组合物治疗后能显著降低ctx引起的肌酸激酶异常升高。
[0117]
2.5主要脏器he染色
[0118]
心脏he染色结果如图3所示，正常对照组心肌细胞形态正常，肌纤维排列规整；肿瘤化疗药ctx组可见心肌细胞体积明显肥大，心肌纤维紊乱，断裂(单双线箭头)。心肌细胞核也变大，呈核染色质固缩或消失，部分心肌细胞内可见圆形空泡形成(实心黑三角箭头)，肌质溶解。与肿瘤化疗药组相比，ctx联用中药组合物1组的肌纤维紊乱程度减轻，心肌空泡化减少，胞核异常的细胞数目减少；与此同时，各组小鼠肝、脾、肺、肾组织的病理形态改变无明显差异(图4)。
[0119]
实施例3中药组合物对肿瘤化疗药所致小鼠心脏毒的减毒作用
[0120]
1.1动物分组及处理
[0121]
昆明种小鼠，雄性，8
‑
9周龄，每组10只，每天给药前记录体重。采用实施例1制备的中药组合物1
‑
7进行实验。
[0122]
动物分组及处理如下：
[0123]
正常组：纯水灌胃，0.3ml/次/d，自第1天起给药至第13天为止，第8
‑
11天腹腔注射n.s.0.3ml/次/d。
[0124]
肿瘤化疗药组：纯水灌胃，0.3ml/次/d，自第1天起给药至第13天为止，第8
‑
11天腹腔注射ctx(给药方案同实验一)。
[0125]
中药组合物低剂量组：中药组合物0.65g/kg/d(人用剂量4.5倍)灌胃，自第1天起给药至第13天为止，第8
‑
11天腹腔注射ctx。
[0126]
中药组合物中剂量组：中药组合物1.3g/kg/d(人用剂量9倍)灌胃，自第1天起给药至第13天为止，第8
‑
11天腹腔注射ctx。
[0127]
中药组合物高剂量组：中药组合物2.6g/kg/d(人用剂量18倍)灌胃，自第1天起给药至第13天为止，第8
‑
11天腹腔注射ctx。
[0128]
实验周期14天，各组小鼠在第13天均禁食，第14天使用1％戊巴比妥钠按0.01ml/g剂量腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠麻醉后进行眼眶静脉丛采血，采血完毕后采用颈椎脱臼法处死小鼠，取心脏称重后纵切，部分液氮冻存，部分4％多聚甲醛固定。
[0129]
1.2心脏指数计算
[0130]
心脏指数＝小鼠心脏重量(g)/小鼠体重(g)
[0131]
1.3血清心肌酶及氧化指标测定
[0132]
小鼠血液静置半小时，4℃下5000rpm离心10分钟，取上层血清分装到洁净ep管。使用日立7080全自动生化分析仪检测肌酸激酶ck，使用肌酸激酶同工酶ck
‑
mb elisa试剂盒检测血清中ck
‑
mb含量，测定波长为450nm。按照谷胱甘肽gsh、丙二醛mda及超氧化歧化酶sod试剂盒说明书检测血清中gsh、mda及sod含量，测定波长分别为：420nm、532nm及550nm。
[0133]
1.4心脏组织he染色
[0134]
各组小鼠心脏组织在多聚甲醛固定24h后进行he染色，染色步骤同实验一，最后在显微镜下观察小鼠心肌病理形态结构并摄片。
[0135]
1.5心肌凋亡相关蛋白免疫印迹
[0136]
(1)组织蛋白提取
[0137]
小鼠心脏组织置于无菌的1.5ml ep管中剪碎，加1.5ml组织裂解液(含蛋白酶抑制剂15μl)，组织匀浆机匀浆，然后在低温超速离心机4℃，12000g离心30分钟，吸取上清(总蛋白)转移至新ep管，并记录体积。
[0138]
(2)bca蛋白浓度测定
[0139]
按bca蛋白浓度测定试剂盒说明书测得各受测样品浓度，再将所有蛋白样品用5
×
loading buffer配平成等体积等浓度，100℃变性5分钟，分装后保存于
‑
80℃超低温冰箱，用时解冻。
[0140]
(3)蛋白免疫印迹
[0141]
按照参考文献(屈赵，中草药来源黄酮类化合物的神经保护作用及机制研究)记录的方法进行蛋白免疫印迹实验。
[0142]
1.6统计学分析
[0143]
采用spss 23.0软件对数据进行统计学处理，先进行正态性检验，若符合正态分布两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用one
‑
way anova和lsd检验，方差不齐则采用dunnett t3检验；若不符合正态分布采用非参数检验，使用graphpad prism 8.0对统计数据进行作图。数据用均数
±
标准误(mean
±
se)表示，p<0.05表示差异具有统计学意义。
[0144]
2实验结果
[0145]
2.1中药组合物1对ctx致心脏毒小鼠的心脏指数的影响
[0146]
实验结束后，取各组小鼠心脏称重并计算心脏指数。如图5所示，ctx给药致心脏指数较对照组明显增高(p<0.05)，中药组合物干预组，低、中、高剂量中药组心脏指数均较仅用肿瘤化疗药组显著性减小(p<0.05，p<0.01，p<0.01)。表明ctx给药能引起心脏组织肿大，加用中药组合物后可明显减轻ctx中毒小鼠的心脏肿大。
[0147]
2.2中药组合物对ctx致心脏毒小鼠心肌酶及氧化指标的影响
[0148]
如表4所示：ctx致心脏毒小鼠心肌酶ck及ck
‑
mb均出现升高，且ck
‑
mb水平较正常动物组出现显著性升高(p<0.001)，提示ctx造成明显心肌细胞损伤。低、中、高剂量的中药组合物1口服干预后，异常升高的心肌酶显著降低，其中以高剂量中药组降低幅度最为显著(p<0.001)，提示ctx中毒小鼠心肌细胞损伤在中药组合物治疗后可获得明显缓解。而服用低、中、高剂量的中药组合物5
‑
7对ctx致心脏毒小鼠的ck及ck
‑
mb异常升高没有明显影响。
[0149]
与此同时，小鼠在ctx给药后出现氧化应激失衡，表现为抗氧化指标gsh、sod水平下调，而过氧化的mda水平上调；低、中、高剂量的中药组合物1口服干预后氧化失衡均得到
有效缓解，即gsh、sod水平显著上升，中药组合物高剂量组上升水平最为显著(p<0.01，p<0.001)；mda水平显著下降，中药组合物高剂量组下降幅度最为显著(p<0.001)，见表4及图6；加服低、中、高剂量的中药组合物7，对ck、ck
‑
mb、mda和sod指标的影响与组合物1相似，但改善作用较弱，见表4。而服用低、中、高剂量的中药组合物5
‑
6对ctx致心脏毒小鼠的氧化应激失衡指标没有明显影响。
[0150]
表4中药组合物干预对ctx致心脏毒小鼠心肌损伤指标ck、ckmb、gsh、mda、sod的改善作用(mean
±
se)
[0151][0152]
注：与正常对照组相比，
*
p<0.05，
**
p<0.01，
***
p<0.001；与肿瘤化疗药组相比，
▲
p<0.05；
▲▲
p<0.01，
▲▲▲
p<0.001。各组动物数n＝10。
[0153]
此外，发明人采用低、中、高剂量的中药组合物2
‑
4口服干预后，异常升高的心肌酶显著降低，其中以高剂量中药组降低幅度最为显著(p<0.05或p<0.01)，提示ctx中毒小鼠心肌细胞损伤在中药组合物治疗后可获得明显缓解。
[0154]
2.3中药组合物1对ctx致心脏毒小鼠心脏组织病变的影响
[0155]
对小鼠心脏组织病理改变进行了he染色观察，如图7所示：正常对照组小鼠心肌纤维排列规整，无断裂或缺失，心肌细胞体积无明显肥大或萎缩，胞浆染色正常，胞核无明显形态异常。肿瘤化疗药组的心肌细胞体积明显肥大，嗜酸性增强，肌纤维紊乱，断裂(实心黑三角箭头)，部分细胞核染色质固缩或消失，部分心肌细胞内可见圆形空泡形成(单线条箭头)。中药组合物低中高剂量干预组的心肌细胞肿胀，纤维紊乱及胞核病变呈剂量依赖性减轻。
[0156]
2.4中药组合物1对ctx致心脏毒小鼠心肌凋亡相关蛋白的影响
[0157]
结果发现肿瘤化疗药组小鼠心肌组织中凋亡蛋白bax表达水平明显增高，而抗凋亡蛋白bcl
‑
2的水平与其他各组相比最低，而中药组合物低、中、高剂量组bax表达较肿瘤化疗药组依次减弱，bcl
‑
2表达较肿瘤化疗药组依次增强(图8)，提示中药组合物能呈剂量依赖性地减轻肿瘤化疗药引起的心肌细胞凋亡。
[0158]
实施例4中药组合物对肿瘤化疗药体内抗癌作用的增效作用
[0159]
环磷酰胺(ctx)是一种广谱抗癌药物，可用于白血病和多种实体瘤如肉瘤、乳腺癌、肺癌等肿瘤的化疗。发明人构建昆明小鼠s180肉瘤模型，予ctx化疗观察ctx对动物的心脏毒性，同时施以中药组合物联合给药治疗，观察到了中药组合物不仅能减轻ctx化疗引起的心脏毒性反应，还对ctx抑瘤作用的增效作用。
[0160]
1.实验方法
[0161]
1.1 s180肉瘤细胞传代与培养
[0162]
小鼠肉瘤细胞株s180细胞，来源于美国atcc。将含10％小牛血清dmem高糖培养液置37℃水浴复温20分钟。将细胞冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的水浴复温，待冻存管中冰块完全融化后转移至已加入复温的dmem培养基中，800rpm离心3分钟，弃上清，重新加入dmem培养液5ml，轻柔吹打混匀后转移至25cm2培养瓶，置于37℃，5％co2细胞培养箱中进行培养，24小时后更换培养液继续培养，每日换液1次。
[0163]
待s180细胞长满约90％的培养瓶底时，进行细胞传代。吸出培养液，加入3ml pbs洗涤细胞2次，巴氏管将贴壁部分的细胞轻柔吹下后转移至无菌离心管内，800rpm离心3分钟，弃上清，重新加入dmem培养液5ml，使用细胞计数板计数，按4
×
105/ml的细胞密度接种5ml于25cm2培养瓶中，置于37℃，5％co2细胞培养箱中进行培养。培养5天，收集细胞，pbs重悬并调整细胞密度为1
×
107/ml个用于动物接种。
[0164]
1.2 s180荷瘤小鼠模型制作
[0165]
24只雄性昆明小鼠后颈部皮肤用络合碘消毒后，将密度为1
×
107个/ml的s180细胞悬液，以0.2ml/只接种于消毒的后颈部皮下。6天后注射部位可见包块隆起，测量体积约40
‑
100mm3提示造模成功。
[0166]
1.3动物分组及处理
[0167]
将造模后的s180荷瘤小鼠随机组，每组8只：(1)肿瘤模型对照组(纯水0.3ml灌胃，自第1天起给药至第13天为止，8
‑
11天ns 0.3ml/次/d腹腔注射)；(2)ctx化疗组(纯水0.3ml灌胃，自第1天起给药至第13天为止，8
‑
11天腹腔注射ctx，ctx给药方案同前)；(3)ctx化疗联合中药组合物(实施例组合物1
‑
7)治疗组(中药组合物2.6g/kg/d灌胃，自第1天起给药至第13天为止，在8
‑
11天腹腔注射ctx)。第14天戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，眼眶静脉丛采血后分离血清冻存待相关检测。然后采用颈椎脱臼法处死小鼠，取心脏纵切，部分液氮急冻后置于
‑
80℃超低温冰箱冻存，部分多聚甲醛固定，最后剥离瘤体并称重记录。
[0168]
1.4生化指标检测
[0169]
小鼠血液4℃下5000rpm离心10分钟，小心吸取上层血清分装到洁净ep管。使用日立7080全自动生化分析仪检测肌酸激酶ck，使用肌酸激酶同工酶ck
‑
mb elisa试剂盒检测血清中ck
‑
mb含量，测定波长为450nm。按照谷胱甘肽gsh、丙二醛mda及超氧化歧化酶sod试剂盒说明书检测血清中gsh、mda及sod含量，测定波长依次为：420nm、532nm及550nm。
[0170]
1.5心肌组织he染色
[0171]
各组小鼠心脏组织在4％多聚甲醛固定24h后进行he染色，染色步骤同实验一，最后在显微镜下观察小鼠心肌形态学变化并摄片。
[0172]
1.6 western blot检测心肌bax/bcl
‑
2、pi3k/akt表达
[0173]
将冻存的小鼠心脏组织置于灭菌的1.5ml ep管中剪碎，加1.5ml组织裂解液(含蛋
白酶抑制剂15μl)，组织匀浆机匀浆，然后在低温超速离心机4℃，12000g离心30分钟，吸取上清(总蛋白)转移至新ep管，并记录体积。后续bca蛋白浓度测定及bax、bcl
‑
2、pi3k、akt的免疫蛋白印迹实验同第二章2.2.5实验方法。
[0174]
1.7免疫组化检测心肌组织pi3k、akt表达
[0175]
参照文献(唐琴，青蒿琥酯改善博来霉素诱导的系统性硬化症肾脏和皮肤损伤的研究)记录的方法对小鼠心肌组织进行pi3k、akt表达的免疫组化检测。
[0176]
1.8统计学分析
[0177]
采用spss 23.0软件对数据进行统计学处理，计量资料先进行正态性检验，若符合正态分布两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用one
‑
way anova和lsd检验，方差不齐则采用dunnett t3检验；若不符合正态分布采用非参数检验，数据用均数
±
标准误(mean
±
se)表示，p<0.05表示差异具有统计学意义。
[0178]
2.实验结果
[0179]
2.1中药组合物对s180荷瘤小鼠ctx化疗后心肌酶及氧化指标的影响
[0180]
表5中药组合物对荷瘤小鼠ck、ck
‑
mb、mda及sod的影响(mean
±
se)
[0181][0182]
注：与肿瘤模型对照组相比，
***
p<0.001，与ctx化疗组相比，
▲▲
p<0.01；
▲▲▲
p<0.001。
[0183]
如表5及图9、图10所示：s180荷瘤小鼠经ctx化疗后，其血清ck
‑
mb均较肿瘤模型对照组明显升高、过氧化指标mda显著升高、抗氧化指标sod较肿瘤模型对照组显著降低(均p<0.001)，提示本研究中的ctx化疗方案(100mg/kg/d
×
2d，50mg/kg/d
×
2d)可引起心肌细胞损伤。ctx化疗联合中药组合物1治疗后，ctx引起的ck及ck
‑
mb数据偏高均显著下调(p<0.01，p<0.001)，过氧化指标mda和抗氧化指标sod均显著改善(p<0.001)，提示中药组合物1可显著减轻ctx诱导的心肌细胞损伤；与之相比，组合物7也具有明显的心肌细胞损伤的改善作用，但作用较组合物1弱。而ctx化疗联合中药组合物5
‑
6治疗后，ctx诱导致异常升高的ck及ck
‑
mb没有明显改善。
[0184]
此外，发明人采用ctx化疗联合中药组合物2
‑
4处理，结果也显示ck及ck
‑
mb均显著下调(p<0.01，p<0.001)，sod水平明显升高(p<0.001)、mda水平明显降低(p<0.001)。表明本发明的中药组合物可显著减轻ctx诱导的心肌细胞损伤，且能纠正荷瘤化疗鼠体内的氧化应激失衡。
[0185]
2.2中药组合物1对ctx化疗引起的心脏组织病理改变的改善作用
[0186]
如图11所示：肿瘤模型对照组心肌纤维排列规则整齐，无断裂或缺失，心肌细胞体积无明显肥大或萎缩，胞浆染色正常，胞核无明显形态异常。ctx单独化疗组心肌细胞肿胀明显，可见心肌纤维严重紊乱及断裂(实心三角箭头)；细胞核增大，核染色质皱缩或消失，心肌细胞含较多空泡，肌质溶解(单双线箭头)。ctx化疗联合中药组合物治疗组与ctx单独化疗组相比，细胞肿胀及纤维断裂减轻，胞核病变数目减少，提示中药组合物能改善ctx化疗引起的心肌病理改变。
[0187]
2.3中药组合物1对荷瘤小鼠ctx化疗后心肌相关凋亡蛋白表达的影响
[0188]
蛋白印迹结果显示，与肿瘤模型对照组比较，ctx单独化疗组凋亡蛋白bax表达增强，抗凋亡蛋白bcl
‑
2表达减弱；ctx化疗联合中药组合物治疗组与ctx单独化疗组相比，bax表达减弱，bcl
‑
2表达增强，提示ctx化疗引起了明显的心肌细胞凋亡，而联用中药组合物治疗，能缓解ctx化疗导致的心肌细胞凋亡(图12)。
[0189]
2.4中药组合物1对荷瘤小鼠ctx化疗后pi3k/akt表达的影响
[0190]
结果如图13所示，ctx单独化疗组pi3k、akt的表达水平较肿瘤模型对照组降低，ctx联合中药组合物治疗组上述蛋白表达较ctx单独化疗组显著增强。小鼠心脏组织中的pi3k与akt的免疫组化显示出相一致的趋势(图14)，ctx单独化疗组pi3k及akt阳性表达减弱，而ctx联用中药组合物治疗后两种蛋白表达有明显增强(红色箭头)。
[0191]
2.5 ctx单独及联合中药组合物1对荷瘤小鼠抑瘤作用试验
[0192]
给药结束后，剥离瘤体拍照(图15a)、称重(图15b)。与肿瘤对照组相比，ctx单独化疗组及ctx联合中药组合物治疗组的瘤体重量均明显变小；更有意义的是ctx化疗联合中药组合物治疗组比ctx单独化疗组的瘤重减小更加显著(p<0.05)。
[0193]
实施例5中药组合物减轻丙烯醛所致心肌细胞毒性的通路靶点分析
[0194]
1、实验方法
[0195]
将h9c2细胞接种于9cm无菌培养皿，每2天换液1次，待细胞生长状态良好，生长融合至80％左右时，更换培养基，进行分组给药。实验分3组，包括：对照组(常规培养基)、丙烯醛(acr；环磷酰胺体内代谢产物)组acr组(常规培养基加20μmol/l acr培养)、中药组合物1(常规培养基加20μmol/l的acr培养12小时，加80μg/ml的中药组合物1培养)组。各组细胞加或不加药物共孵育24h，进行后续实验。
[0196]
1.1 rt
‑
qpcr检测通路靶点mrna表达
[0197]
(1)h9c2细胞总rna抽提
[0198]
吸出3组培养皿中的培养液，加入1ml trizol，室温静置10分钟后将含细胞的trizol收集到1.5ml无酶ep管中，加入200μl氯仿，充分混匀15秒，室温孵育3分钟。高速冷冻离心机提前预冷，将ep管放入，12000g 4℃，离心15分钟。取新1.5ml无酶ep管，加入异丙醇500ul，待离心完毕后吸取同体积上层水相500ul加入其中，上下颠倒，室温孵育10分钟，再放入高速冷冻离心机，12000g，4℃，离心15分钟，弃上清，加入75％depc酒精1ml，充分震荡，让rna团块飘起，再次放入高速冷冻离心机，7500g，4℃，离心5分钟，弃上清，生物安全柜中倒置5分钟，待沉淀变透明，加入depc水12μl，吹打均匀后置冰上，使用nanodrop分光光度计测定rna样品260nm及280nm的od值，260/280od比值在1.8
‑
2.0之间提示rna纯度可。
[0199]
(2)逆转录
[0200]
使用takara反转录试剂盒继续逆转录操作。在逆转录仪上按如下程序反应：37℃15min，85℃5sec，4℃∞，逆转录完成后将样本置
‑
80℃保存或直接继续进行下一步pcr反应。
[0201]
(3)pcr
[0202]
对kegg富集到的排名靠前的3条通路pi3k
‑
akt信号通路、tnf信号通路及mapk信号通路关键靶点进行引物合成：登陆genbank(https://www.ncbi.nlm.nih.
[0203]
gov/genbank/)数据库，查找大鼠的18s cds序列，然后使用primer3web进行引物设计，引物合成由北京擎科公司完成。
[0204][0205]
按照takara pcr试剂盒进行聚合酶链反应，使用7500real time pcr仪进行反应。扩增程序如下：95℃30秒预变性；95℃5秒，60℃34秒，共40个循环；95℃15秒，60℃60秒，95℃15秒。
[0206]
根据溶解曲线ct值，采用2
‑
δδct法对pcr产出数据进行分析，计算各基因的mrna表达量。
[0207]
1.2 western blot验证rt
‑
qpcr筛选基因
[0208]
细胞总蛋白提取：吸出3组培养皿中的培养液，加入含pmsf的冰冷pbs(pbs：pmsf＝100:1)1ml洗涤2次，用细胞刮刀收集细胞，转移至2ml离心管，4℃下4000rpm离心5分钟，吸去上层pbs，将ep管倒置在滤纸上2秒，使液体控干，再加入150μl细胞裂解液(含1mmol/l蛋白酶抑制剂与1mmol/l磷酸酶抑制剂)，置冰上反复吹打10次后放至装冰的烧杯中，再用细胞破碎仪超声粉碎，程序为超声7秒，间隔10秒，重复3次，超声完毕后置冰上继续裂解20分钟。裂解完毕后4℃12000g离心30分钟，小心吸取上清(总蛋白)转移至干净的离心管，并记录体积。
[0209]
1.3统计学分析
[0210]
采用spss 23.0软件对数据进行统计学处理，计量资料先进行正态性检验，若符合正态分布两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用one
‑
way anova和lsd检验，方差不齐则采用dunnett t3检验；若不符合正态分布采用非参数检验，使用graphpad prism 8.0对统计数据进行作图。数据用均数
±
标准误(mean
±
se)表示，p<0.05表示差异具有统计学意义。
[0211]
2、实验结果
[0212]
结果见图16。acr组h9c2细胞pi3k、akt mrna水平及磷酸化pi3k、akt蛋白水平较对照组明显降低。h9c2细胞加中药组合物醇提取物预处理后，pi3k、akt mrna水平较acr组显著上调(p<0.01，p<0.001)，pi3k、akt磷酸化蛋白表达也较acr组显著增强。说明本发明中药组合物能够通过激活pi3k/akt通路，下调下游bax、caspase3、caspase9且上调的bcl
‑
2的表达减少心肌细胞凋亡，从而发挥减轻环磷酰胺引起的心脏毒性。
[0213]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。