鹰嘴豆多糖在制备治疗和/或预防溃疡性结肠炎的药物中的应用的制作方法

1.本技术属于医药的技术领域，尤其涉及鹰嘴豆多糖在制备治疗和/或预防溃疡性结肠炎的药物中的应用。


背景技术：

2.溃疡性结肠炎(uc)是一种发病机理不清晰的肠道炎症，属于炎症性肠炎(ibd)其中的一种，发病部位位于结肠和直肠的粘膜处，主要症状表现为腹痛、腹泻和便血等症状。目前，治疗uc的传统方案主要为水杨酸类药物、中药灌肠剂等，手术等也作为医治手段，但由于uc的治疗难度大，这些治疗方案中水杨酸药物副作用较大，且易反复，中药灌肠剂给药途径较为复杂。
3.目前尚未发现对uc具有良好治疗或预防效果、以及毒副作用小的药物。因此，研发一种预防或治疗uc且毒副作用小的药物是本领域技术人员亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本技术提供了鹰嘴豆多糖在制备治疗和/或预防溃疡性结肠炎的药物中的应用，提供了一种有效预防或治疗溃疡性结肠炎且毒副作用小的药物。
5.本技术第一方面公开了鹰嘴豆多糖在制备治疗和/或预防溃疡性结肠炎的药物中的应用。
6.另一实施例中，所述鹰嘴豆多糖的用量为100～400mg/ml。
7.具体的，所述鹰嘴豆多糖的用量为200mg/ml。
8.另一实施例中，所述鹰嘴豆多糖为从鹰嘴豆提取分离的多糖。
9.另一实施例中，所述提取分离方法包括：
10.将鹰嘴豆和水混合，加热提取得到浸提液；其中，所述鹰嘴豆和所述水的料液比为：5～25g/ml，加热温度为60～100℃，提取时间为1～5h；重复提取次数为1～4次，离心将每次提取的上层浸提液合并，得到浸提液；
11.将所述浸提液与无水乙醇混合，静止，然后离心取出沉淀物，获得鹰嘴豆多糖粗提物；
12.将所述鹰嘴豆多糖粗提物采用sevage试剂联用木瓜蛋白酶法除去鹰嘴豆多糖粗提物中的蛋白质，干燥后得到鹰嘴豆多糖。
13.具体的，浸提液的制备步骤包括：水提法的料液比为：5～25g/ml。提取温度为60～100℃。提取时间为1～5h。重复提取次数为：1～4次。离心4000rpm、20min，将每次的上层浸提液合并。
14.具体的，鹰嘴豆多糖粗提物的制备步骤包括：将所述浸提液加入无水乙醇使提取液的酒精度为80％，并置于4℃冰箱静止12h以上，离心4000rpm、20min取出沉淀物，获得鹰嘴豆多糖粗提物。
15.具体的，采用sevage试剂联用木瓜蛋白酶法除去鹰嘴豆多糖粗提物中的蛋白质的制备步骤包括：鹰嘴豆多糖粗提物加入水溶解，加入木瓜蛋白酶1mg/ml于提取液中，60℃下酶反应3h，加热期间不断搅拌，结束后继续升温至100℃，搅拌15min除去酶活性。离心4000rpm、20min，取上清液。加入sevage试剂(三氯甲烷:正丁醇＝4:1)，按sevage试剂:提取液体积比1:5混合，涡旋震荡5min，离心4000rpm、20min取上层液体，除去下层白色蛋白层和有机层，上清液按比例加入sevage试剂，重复以上操作5～8次，直至中间无白色蛋白层出现为止。取出上清液，减压浓缩，除去有机试剂，加入蒸馏水，透析24h除去盐和其他小分子杂质。
16.另一实施例中，所述鹰嘴豆多糖的相对分子量为11.687kda；
17.所述鹰嘴豆多糖具有吡喃糖环结构以及存在α糖苷键。
18.具体的，所述鹰嘴豆多糖的糖残基的连接方式包括：
→
4)galp(1
→
、glcp(1
→
、
→
4,6)galp(1
→
、
→
1)
‑
araf。
19.另一实施例中，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、粉剂、丸剂、半固体制剂或液体制剂。
20.本技术第二方面提供了一种合生元组合物，包括：
21.鹰嘴豆多糖和罗伊氏乳杆菌。
22.另一实施例中，所述鹰嘴豆多糖的浓度为100～400mg/ml；所述罗伊氏乳杆菌的浓度为1
×
106～1
×
10
12
cfu/ml。
23.具体的，所述鹰嘴豆多糖的浓度为100～200mg/ml；所述罗伊氏乳杆菌的浓度为1
×
109cfu/ml。
24.另一实施例中，所述合生元组合物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、粉剂、丸剂、半固体制剂或液体制剂。
25.本技术第三方面提供了一种乳制品，包括：由所述合生元组合物发酵制得。
26.具体的，所述乳制品以所述合生元组合物为原料，采用现有常规发酵方法制得乳制品，如乳饮料等。
27.本技术针对现有治疗溃疡性结肠炎存在的药物副作用大、易反复，以及给药复杂的缺点。本技术提供了鹰嘴豆多糖在制备治疗和/或预防溃疡性结肠炎的药物中的应用，鹰嘴豆多糖为天然药物，无副作用，给药途径方便，对溃疡性结肠炎的小鼠肠道的保护作用；同时，本技术发现鹰嘴豆多糖和益生菌罗伊氏乳杆菌具有协同作用，从试验数据可知，这两者组成的合生元组合物在治疗和预防溃疡性结肠炎具有毒副作用较低，给药途径方便，对溃疡性结肠炎小鼠的保护作用效果显著。
附图说明
28.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
29.图1为本技术实施例的动物实验分组示意图；
30.图2为本技术实施例的小鼠体重变化；
31.图3为本技术实施例的小鼠每天的dai评分变化趋势；
32.图4为本技术实施例的小鼠的平均饮水量；
33.图5为本技术实施例的小鼠的结肠长度的变化；
34.图6为本技术实施例的小鼠结肠指数的变化，注：*：p<0.01；**：p<0.05；***：p<0.0001；
35.图7为本技术实施例的uc小鼠结肠外观的变化；
36.图8为本技术实施例的uc小鼠结肠组织形态的变化。
具体实施方式
37.本技术提供了鹰嘴豆多糖在制备治疗和/或预防溃疡性结肠炎的药物中的应用，用于解决现有技术中治疗或预防溃疡性结肠炎的药物具有毒副作用大、易反复的技术缺陷。
38.下面将对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
39.其中，以下实施例所用试剂或原料均为市售或自制。
40.以下实施例的鹰嘴豆多糖采用水提法从鹰嘴豆提取，水提法包括：水提法的料液比为：5～25g/ml。提取温度为60～100℃。提取时间为1～5h。重复提取次数为：1～4次。离心4000rpm、20min，将每次的上层浸提液合并。加入无水乙醇使提取液的酒精度为80％，并置于4℃冰箱静止12h以上，离心4000rpm、20min取出沉淀物，获得鹰嘴豆多糖粗提物。
41.采用sevage试剂联用木瓜蛋白酶法除去鹰嘴豆多糖粗提物中的蛋白质：鹰嘴豆多糖粗提物加入适量水溶解，加入木瓜蛋白酶1mg/ml于提取液中，60℃下酶反应3h，加热期间不断搅拌，结束后继续升温至100℃，搅拌15min除去酶活性。离心4000rpm、20min，取上清液。加入sevage试剂(三氯甲烷:正丁醇＝4:1)，按sevage试剂:提取液体积比1:5混合，涡旋震荡5min，离心4000rpm、20min取上层液体，除去下层白色蛋白层和有机层，上清液按比例加入sevage试剂，重复以上操作5～8次，直至中间无白色蛋白层出现为止。取出上清液，减压浓缩，除去有机试剂，加入蒸馏水，透析24h除去盐和其他小分子杂质，冷冻干燥22h后得到鹰嘴豆多糖cpa。
42.以下实施例所用罗伊氏乳杆菌菌株为lactobacillus reuteri，购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，cgmcc no 1.12733。
43.实施例1
44.本技术实施例提供了鹰嘴豆多糖，具体制备方法包括：
45.采用热水醇沉法提取鹰嘴豆多糖：
46.1、取干燥的鹰嘴豆种子用高速打粉机粉碎3min，过60目筛网，加入95％乙醇，按料液比1:5浸泡12h，此步骤用于除去鹰嘴豆粉中脂肪和色素等杂质。真空泵抽去浸泡液，重复浸泡两次后放入干燥箱中烘干，除去乙醇，获得预处理的鹰嘴豆粉。
47.2、取预处理的鹰嘴豆粉，加入蒸馏水提取鹰嘴豆多糖。按如下提取条件：料液比为：15g/ml。提取温度为80℃。提取时间为3h。重复提取次数为：3次。离心条件为4000rpm、20min，将每次的上层浸提液合并。加入无水乙醇使提取液的酒精度为80％，并置于4℃冰箱静止12h，离心4000rpm、20min取出沉淀物，获得鹰嘴豆多糖粗提物。
48.3、采用sevage试剂联用木瓜蛋白酶法除去步骤2的鹰嘴豆多糖粗提物中的蛋白质：鹰嘴豆多糖粗提物加入水溶解，加入木瓜蛋白酶1mg/ml于提取液中，60℃下酶反应3h，加热期间不断搅拌，结束后继续升温至100℃，搅拌15min除去酶活性。离心4000rpm、20min，取上清液。加入sevage试剂(三氯甲烷:正丁醇＝4:1)，按sevage试剂：提取液体积比1:5混合，涡旋震荡5min，离心4000rpm、20min取上层液体，除去下层白色蛋白层和有机层，上清液按比例加入sevage试剂，重复以上操作6次，直至中间无白色蛋白层出现为止。取出上清液，减压浓缩，除去有机试剂，加入蒸馏水，透析24h除去盐和其他小分子杂质，冷冻干燥22h后得到鹰嘴豆多糖cpa。
49.4、对鹰嘴豆多糖进行结构分析：
50.用0～0.5m的nacl溶液从低浓度到高浓度依次经deae
‑
阴离子交换层析柱洗脱，在0～0.5m浓度下收洗脱收集对应浓度的组分，再经过丙烯葡聚糖凝胶柱层析纯化。鹰嘴豆多糖的相对分子量为11.687kda。ft
‑
ir测得鹰嘴豆多糖具有吡喃糖环结构以及存在α糖苷键。采用hplc色谱法测定多糖的单糖组成为man:glc:gal:ara＝0.62:86.77:6.37:6.25。用甲基化及气质联用仪分析测定多糖的糖残基的连接方式有：
→
4)galp(1
→
、glcp(1
→
、
→
4,6)galp(1
→
、
→
1)
‑
araf，其中glcp(1
→
比例较高。
51.实施例2
52.本技术实施例提供了罗伊氏乳杆菌，具体方法包括：
53.从
‑
80℃冰箱取出保藏的罗伊氏乳杆菌菌株冻存管，取少量冻存管菌液在mrs固体培养基上划线，放置于37℃培养箱内，培养48h。挑取平板上的单个菌落接种于mrs液体培养基，放置于37℃培养箱内，培养48h。再从液体培养基中取2％(v/v)的接种量继续扩增培养48h，离心1000rpm，3min收集菌体沉淀，用灭菌的pbs缓冲液清洗菌体3次，调整菌体浓度至1
×
109cfu/ml，制得罗伊氏乳杆菌菌液。
54.实施例3
55.本技术实施例提供了采用不同药物处理小鼠的动物试验，具体方法包括：
56.请参阅图1，将c57bl/6雄性小鼠随机分为7只/组，共5组，各实验组小鼠均用普通饲料适应性喂养5天。分组安排为：正常组(ctrl)、模型组(dss)、鹰嘴豆多糖给药组(cpa)、合生元组合物组(lr
‑
cpa)、阳性药5
‑
氨基水杨酸组(5
‑
asa)。
57.除正常组ctrl外，其他组均使用3％的dss喂养。
58.正常组(ctrl)：每天以生理盐水作为饮用水喂养。模型组(dss)：使用3％dss溶液作为饮用水喂养。阳性药组(5
‑
asa)：每天同一时间灌胃150mg/kg/d的5
‑
asa。鹰嘴豆多糖给药组(cpa)：每天同一时间灌胃200mg/kg/d的cpa。合生元组合物组(lr
‑
cpa)每日按同一时间灌胃组合物0.2ml/d，合生元组合物组为将实施例2的罗伊氏乳杆菌菌液与实施例1的200mg/ml的鹰嘴豆多糖溶液以1：1体积比混合组成合生元组合物。
59.如图1所示，图1为本技术实施例的动物实验分组示意图。除正常组外其他组从给药的前一天开始给3％dss自由饮水，给药第一天分别按上述实验安排灌胃给药，正常组及模型组每日给予等量生理盐水，每天定时一次。从造模前一天开始，每天定时观察每组小鼠的形态学改变，如体重、饮食、饮水量以及粪便形状、便血情况等。根据以上每日的体征数据对小鼠的疾病指数(dai score)进行评价。具体评分是小鼠的体重变化、粪便潜血程度以及粪便形态三项之和。评分细则见表1。其中，粪便潜血得分使用粪便隐血检测试剂盒结果测
得。
60.表1小鼠dai评分细则
[0061][0062][0063]
连续灌胃给药7天，第8天禁食12h以上，解剖每组的小鼠，分别取小鼠完整的结肠部位，用滤纸吸干水分后，用直尺测量盲肠末端到结肠末端的长度，记录读数并拍照。同时观察结肠形态，立刻用生理盐水冲洗肠道内容物，取结肠部位，称结肠重量并记录。
[0064]
结肠组织的采集：取整段结肠组织，用滤纸吸干结肠的水分后，测定其长度并拍照记录。立即用生理盐水冲净整个肠道内容物，将其剪为3段。用4％甲醛溶液固定1h浸泡固定24h。he染色，显微镜镜检，进行组织病理学观察。
[0065]
上述试验的结果如图2～图8所示。图2为本技术实施例的小鼠体重变化；图3为本技术实施例的小鼠每天的dai评分变化趋势；图4为本技术实施例的小鼠的平均饮水量；图5为本技术实施例的小鼠的结肠长度的变化；图6为本技术实施例的小鼠结肠指数的变化；图7为本技术实施例的uc小鼠结肠外观的变化；图8为本技术实施例的uc小鼠结肠组织形态的变化。
[0066]
图2可知，模型组(dss)的小鼠体重变化呈现连续下降趋势，鹰嘴豆多糖给药组(cpa)在第6天体重恢复较为显著，合生元组合物组(lr
‑
cpa)从第五天开始体重逐渐恢复。造模最后一天(即图2的第7天)，小鼠的体重平均变化情况为：正常组(ctrl)平均体重下降至98.38％、模型组(dss)平均体重下降至92.84％、鹰嘴豆多糖给药组(cpa)平均体重下降至98.43％、合生元组合物组(lr
‑
cpa)平均体重下降至96.613％、阳性药组(5
‑
asa)平均体重下降至96.89％。以上数据表明，cpa和合生元组合物和可改善dss导致的小鼠体重下降趋势。
[0067]
从图3的小鼠每日疾病评分可知，评价造模期间小鼠每日的疾病情况。第6天时，实验结果发现，模型组(dss)小鼠的粪便较为稀软，模型组(dss)小鼠有明显血便，给药各组小鼠均出现不同程度的粪便潜血。第7天时，除模型组(dss)外，其余给药组小鼠dai评分均下降，观察小鼠体征变化：主要是便血程度减轻，体重恢复。以上数据表明，cpa和合生元组可缓解dss引起的小鼠便血、粪便性状变软、饮水量下降等疾病症状。
[0068]
从造模前一天开始记录小鼠饮水量，每天同一时间测量每组小鼠平均饮水量的变
化。图4可知，模型组(dss)小鼠平均每日饮水量在2.85ml，正常组(ctrl)小鼠平均每日饮水量在4.28ml，鹰嘴豆多糖给药组(cpa)平均每日饮水量在3.89ml，合生元组合物组(lr
‑
cpa)的平均饮水量为4.92ml，阳性药组(5
‑
asa)平均每日饮水量为4.56ml。实验结果反映，模型组(dss)小鼠的饮水量有明显下降的趋势，给药组饮水量显著提高。
[0069]
在探究uc小鼠模型实验中，结肠的长度和形态、重量变化是反应炎症的病变程度的重要指标。uc小鼠的结肠会发生出血、肿胀、溃疡等多种生理反应。
[0070]
在本实施例中，根据图5～图7可知，相比正常组(ctrl)小鼠，模型组(dss)小鼠的结肠长度缩短程度明显(p＜0.05)。鹰嘴豆多糖给药组(cpa)和合生元组合物组(lr
‑
cpa)的小鼠结肠长度相对模型组(dss)小鼠的结肠长度有明显的恢复作用。图6显示：模型组(dss)小鼠结肠指数(结肠重量/体重)明显增加(p＜0.05)，且肉眼可观察到该组小鼠的结肠有明显水肿、出血、肠道壁变厚等疾病症状，结肠和盲肠的内容物均有明显出血现象。而给予cpa和合生元组合物的小鼠的结肠外观均有显著恢复。其中合生元组合物组(lr
‑
cpa)结肠长度和肠道内容物出血等症状改善明显。这表明cpa和合生元组合物可防止uc小鼠的肠道缩短。
[0071]
图8的小鼠结肠组织he染色图片显示，模型组(dss)小鼠的结肠组织的粘膜层中，内部的柱状细胞和杯状细胞明显减少，隐窝结构松散，炎症细胞弥散至粘膜层，肌层增厚，粘膜层总体形态紊乱，表明经过dss诱导后，小鼠模型造模成功。正常组(ctrl)小鼠的结肠中粘膜层清晰结构完整，隐窝结构明显，肌层部位紧密，杯状细胞清晰可见，无炎症细胞浸润现象。给予阳性药5
‑
asa的小鼠结肠中的隐窝恢复程度以及杯状细胞与正常组相比近乎一致，但肌层较厚，有部分炎症细胞浸润。给药组中，cpa对小鼠的结肠组织恢复程度较为明显，隐窝结构和杯状细胞排列整齐清晰，相较模型组小鼠的杯状细胞数量明显增多。合生元组合物组(lr
‑
cpa)的结肠组织中，隐窝排列紧密整齐，杯状细胞较多且结构清晰，无炎症细胞浸润，与正常组结果近乎一致。以上结果说明合生元组合物、cpa对uc小鼠的结肠损伤程度有明显保护作用，能够改善小鼠结肠炎症发生的程度。
[0072]
综上所述，本技术的鹰嘴豆多糖是从药食两用的鹰嘴豆提取分离出的天然成分。从上述试验中成功建立溃疡性结肠炎小鼠模型，给药7天后，相对模型组，鹰嘴豆多糖对溃疡性结肠炎小鼠的肠道有一定的恢复作用，具体表现为结肠长度增加，结肠指数降低，疾病评分dai明显恢复，he染色切片的结果显示鹰嘴豆多糖对结肠组织的隐窝结构形态、杯状细胞数量恢复程度较为明显，粘膜层总体恢复情况与正常组接近，炎症程度减轻。
[0073]
鹰嘴豆多糖与罗伊氏乳杆菌组成的合生元组合物对溃疡性结肠炎小鼠的肠道有一定的恢复作用。具体表现为结肠长度增加，结肠指数降低，疾病评分dai明显恢复，he染色切片的结果显示鹰嘴豆多糖对结肠组织的隐窝结构形态、杯状细胞数量恢复程度较为明显，粘膜层总体恢复情况与正常组接近，炎症程度减轻。
[0074]
以上所述仅是本技术的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本技术的保护范围。