一种药物靶标蛋白PMA1及其在农业上的用途的制作方法

一种药物靶标蛋白pma1及其在农业上的用途
技术领域
1.本发明属于农业生物药物技术领域，具体涉及一种药物靶标蛋白pma1及其在农业上的用途。


背景技术：

2.真核细胞内可作为选择性药物靶标的蛋白数量极少，至今只发现了20多种。具有药敏性高、选择性强的杀菌剂分子靶标更是屈指可数。尽管市场上注册登记了400多种杀菌剂，但因为交互抗性，实际可以有效使用的杀菌剂极少，以致许多重大作物病害缺少有效药物防治。因此，发现新的杀菌剂分子靶标，研发具有选择性及高活性的新型杀菌剂对于重大农作物病害防控具有重要的意义。
3.杀菌剂根据作用机制主要分为核酸合成抑制剂、细胞骨架和运动蛋白抑制剂、呼吸作用抑制剂、氨基酸及蛋白质合成抑制剂、信号传导作用抑制剂、脂质及膜合成抑制剂、膜中甾醇生物合成抑制剂、细胞壁生物合成抑制剂、细胞壁中黑色素合成抑制剂、诱导宿主植物防御以及其他作用机制未知的杀菌剂。目前，还没有关于以离子泵为靶标的杀菌剂的报道，因此，研究离子泵抑制剂作为新型作用机制的杀菌剂至关重要。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种属于p
‑
类型的离子泵的pma1蛋白，可以作为药物研发的分子靶标，为真菌病害药物的研发提供基础。
5.本发明的目的还在于以pma1蛋白为受体的化合物在植物真菌病害防治中的应用。
6.本发明提供了一种药物靶标蛋白pma1，所述pma1蛋白的氨基酸序列如seq id no：2所示。
7.本发明提供了一种编码所述药物靶标pma1蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列seq id no：1所示。
8.本发明提供了一种以所述pma1蛋白为受体的化合物或其药学上可接受的盐在防治植物真菌病害中的应用。
9.优选的，所述真菌病害包括由镰刀菌(fusarium)引起的植物病害。
10.优选的，所述由镰刀菌引起的植物病害包括小麦赤霉病和/或水稻恶苗病。
11.本发明提供了一种所述药物靶标pma1蛋白突变体，在如seq id no：2所示氨基酸序列的基础上，将以下结构域片段或者与以下结构域片段相比序列同源性达到80％～99.9％的序列中进行突变：第296～921位氨基酸形成的功能域、第296～395位氨基酸形成的功能域、第621～735位氨基酸形成的功能域和第850～921位氨基酸形成的功能域。
12.优选的，所述突变包括点突变或所述结构域片段的缺失。
13.优选的，所述点突变包括以下至少一种的突变方案：所述点突变包括d380g点突变、h703a点突变、s915d点突变、d380g r697h组合点突变、h703a d732e组合点突变、r627h d732e s915d组合点突变和d380g t854s t916h组合点突变；
14.所述结构域片段的缺失包括第296～921位氨基酸形成的功能域、第296～395位氨基酸形成的功能域、第621～735位氨基酸形成的功能域和第850～921位氨基酸形成的功能域的基因或蛋白序列全部或部分缺失。
15.本发明提供了所述药物靶标pma1蛋白突变体或pma1蛋白的编码基因突变体在筛选防治植物真菌病原特异性药剂中的应用。
16.本发明提供了所述药物靶标pma1蛋白突变体或pma1蛋白的编码基因突变体在降低植物真菌病原致病力方面的应用；所述降低植物真菌病原致病力包括抑制植物真菌病原生长发育和降低毒素产量方面。
17.本发明提供的药物靶标pma1蛋白，氨基酸序列如seq id no：2所示。本发明首先确定所述药物靶标pma1蛋白中起蛋白生物功能的关键结构域，296～921、296～395、621～735和850～921结构域片段，结果表明，突变所述结构域中任意一片段，均能减弱或降低镰刀菌生长能力，同时抑制镰刀菌don毒素合成能力，降低镰刀菌的致病力以及提高对药剂的敏感性，因此，pma1蛋白可以作为药物受体应用到植物真菌病害的防治中。
18.本发明还提供了药物靶标pma1蛋白的突变体，在如seq id no：2所示氨基酸序列的基础上，将以下结构域片段或者与以下结构域片段相比序列同源性达到80％～99.9％的序列中进行突变：第296～921位氨基酸形成的功能域、第296～395位氨基酸形成的功能域、第621～735位氨基酸形成的功能域和第850～921位氨基酸形成的功能域。实验证明，通过对所述功能域中任一氨基酸或者几个氨基酸的点突变体或缺失一个或几个功能域形成的突变体均可减弱禾谷镰刀菌生长能力，抑制禾谷镰刀菌don毒素合成能力，降低禾谷镰刀菌的致病力以及提高对药剂的药敏性。因此，所述突变体可以用来筛选药敏性位点以及构建选择性杀菌剂研发和筛选的生物材料，应用到药物的筛选中。
附图说明
19.图1为本发明实施例中重组载体构建示意图；
20.图2为以粗糙脉孢菌pma1的晶体结构(pdb id:1mhs)为模板，利用swiss
‑
model构建的禾谷镰刀菌pma1的3d模型；
21.图3为本发明中提供的14类化合物的结构式。
具体实施方式
22.本发明提供了一种药物靶标蛋白pma1，所述pma1蛋白的氨基酸序列如seq id no：2(maeekavgapaldtnietggfdekrgqapathnpkapvaedeepdedmdaliedlesedgheidddeeatpgggrvvpedqlqtdsrvglteaeviarrkkwglnamkeeqenmilkflmffvgpiqfvmeaaavlaagledwidfgvicallllnacvgfiqeyqagsiveelkktlalkavvlrdgtlkeieapevvpgdilqveegtiipadgrfvtegcfcqvdqsaitgeslavdkhhgdncyassavkrgeafvivtatgdntfvgraaalvsqsaggtghftevlngigtillvlvvatllivwvssfyrsngivdilrftlaitivgvpvglpavvtttmavgaaylakkqaivqklsaieslagveilcsdktgtltknklslaepfcvagvepddlmltaclaasrkkkgidaidkaflkalkfyprakgvlskykvldfhpfdpvskkvqavvespqgeriicvkgaplfvlktveedhpipeevdsaykncvaefatrgfrslgvarkrgegaweilgimpcsdpprhdtartineakrlglsikmltgdavgiaretsrqlglgtnvynaerlglggggdmpgsevydfveaadgfaevfpqhkynvveilqqrgylvamtgdgvndapslkkadtgiavegasdaarsasdivflapglgaiidalkt
srqifhrmyayvvyrialslhmeiflglwiailnrslnielvvfiaifadiatlaiaydnapfsqtpvkwnlpklwgmsvllgvvlavgtwialttmlansedggivqnfgkidevlfleisltenwlifitrangpfwssipswqlsgailivdilatlfcifgwfvggqtsivavvriwifsfgvfcvmgglyyfmqgstgfdnlmhgkspkqnqkqrsledfvvslqrvstqheksq)所示，编码922个氨基酸序列，来源为禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)。本发明提供了一种编码所述药物靶标pma1蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列seq id no：1
23.(gagtaggggcgcccatgtgcagcagagtgagagacaatcagtcttggagaaatatgcaggccttgggtgtggatccactttatgaccgggtctccatcattttgatcagggccgaagtctgttggcaggggtatgcgagagcgtgggccggcaagctcgccgggaaagaaccaaagctctcgcatctttctctgaattcaaatagaagctctcgcccggcctcaactcactttcttctttcccttcctcttcacccacgaatgcttcatacataagcgtccctaacttcgtgcggtgcttagacactttcttccttttccccctccccccaaaaaccttgttcctctgtttctctcaacaacagaaaacagcagcacccacctcagctattattctctcaatacctgctgcatacctatagccgcgttcttcaatacctaagaatcgacattctcttttaacgtcacctaccatggccgaagagaaggcggtcggcgcacccgcgctcgacaccaacatcgagactggcggcttcgatgagaagcgaggacaagctcccgctacccacaaccccaaggctcccgtcgccgaggatgaggagcccgatgaggacatggatgccctgatcgaggacctcgagtccgaggacggccacgagatcgacgacgacgaggaggccacccccggcggtggacgtgtcgtccccgaggaccagctccagactgactctcgtgttggtttgactgaggctgaggttatcgcacgtcgcaagaaatggggtctcaacgccatgaaagaagagcaagagaacatgattctcaagttcctcatgttcttcgttggccctattcagtttgtcatggttcgttttccccccctgccctttctcttcttttccccgtcgattttcgtcgagttttgaggctacggtgacttacacgatgttcaactgaacacacaatcaccggacccacctttcctcgacattggcccattttttctcaacatcatcatatatcgtgccgtatctcaactaacatctcatataggaagctgccgctgttcttgctgctggtcttgaagactggattgatttcggtgtcatttgcgctcttctccttctcaacgcatgtgttggtttcattcaggagtaccaagctggttccatcgtcgaggagctcaagaaaactcttgctctcaaggctgttgttctccgtgatggcactctcaaggagatcgaggcccctgaagtcgttcccggtgacatcctccaggtcgaagagggaacgatcattcctgctgatggtcgtttcgttaccgagggctgcttctgccaagttgatcagtccgccatcactggagagtctctcgctgtcgacaagcaccatggtgacaactgttacgcttcttccgctgtcaagcgtggtgaggccttcgttatcgttactgccactggtgacaacaccttcgttggtcgtgccgctgctctcgtctctcagtctgctggtggcactggtcacttcactgaggttctgaacggaattggtaaggccccgctttttcttgatacggataagttcatgctaacaacaaaacaggaacaattttgctagttctcgtcgtcgccaccctgctaattgtttgggtcagctctttctacagatccaatggcattgttgacatcctccgtttcacccttgctattactatcgtcggtgtccctgtcggtcttcccgccgtcgtcactaccaccatggccgtcggtgccgcctaccttgccaagaagcaggccatcgtccagaagctttccgccattgagtcccttgctggtgtcgagattctctgctctgacaagactggtactctgaccaagaacaagctctctctcgctgagcctttctgtgttgctggcgttgagcccgatgacctgatgctcactgcttgtttggctgcttcccgcaagaagaagggtattgatgccatcgacaaggctttcctcaaggctctcaagttctacccccgcgccaagggtgttctgtccaagtacaaggttctcgacttccacccctttgaccccgtctccaagaaggtccaggctgttgtcgagtcccctcaaggcgagcgtatcatctgtgtcaagggtgccccactttttgttctcaagaccgtcgaggaggaccaccccatccctgaggaagtcgattcggcgtacaaaaactgtgtggctgagtttgctacccgtggcttccgatctcttggtgttgctcgcaagcgaggtgagggtgcttgggagattctcggaatcatgccctgctctgacccccctcgtcacgacactgcccgaactatcaacgaagccaagcgccttggtctctccatcaagatgcttactggtgacgctgtcggtattgcccgtgagacttctcgtcagctcggcctcggtaccaacgtttacaacgctgagcgccttggtcttggtggtggtggtgacatgcccgg
ttctgaggtttacgatttcgttgaggctgccgatggtttcgctgaggttttcccccagcacaagtacaacgtcgttgagattctccagcagcgtggttaccttgttgccatgactggtgatggtgtcaacgatgctccctctctgaagaaggccgatactggtattgctgtcgagggtgcctccgatgccgcccgatccgcctctgatatcgttttccttgcccccggtctcggagccatcatcgacgccttgaaaacgtcccgtcaaatcttccacagaatgtatgcctacgttgtctaccgtatcgctctttccctgcacatggagatcttccttggtctctggatcgccatcctcaaccgatctctcaacattgagcttgtcgtctttatcgccattttcgccgatattgccacccttgctatcgcctacgacaacgctcccttctcccagactcctgtcaagtggaatcttcccaagctctggggtatgtccgttcttctcggtgttgtcctggctgtcggtacctggatcgctcttacgaccatgctggcgaacagtgaggacggcggaatcgttcagaacttcggtaagatcgatgaggttctcttcctcgagatctctcttactgagaactggctgatcttcatcacccgtgccaacggtcccttctggtcttccatcccctcttggcagctgtctggcgctatcctgatcgtcgatatccttgccaccctcttctgtatcttcggttggttcgttggtggccagactagcattgtcgctgttgtccgtatctggattttctctttcggtgtcttctgtgtcatgggtggtctctactacttcatgcagggcagcaccggcttcgataacctcatgcacggcaagtctcccaagcagaaccagaagcagcgatccctcgaggatttcgttgtctctcttcagcgtgtttcgacccagcacgagaagtctcagtaaacaaagatggtatatacccggagcaccatcgaccggacttttcactttcgctacgtccaaatttgccctttaatactcgcacccgagtactgagactcatggagtggctgaggaatgtttcatacccctagaacgtctattagacacttaataatacaagtaaaataaataatttgcacccatc)所示。
24.在本发明中，为了验证pma1蛋白的生物学功能，通过基因敲除的方法构建载体，将所述载体导入镰刀菌(fusarium)中，观察镰刀菌的生物性状的变化，结果表明，与野生菌株(ph
‑
1)相比，pma1基因缺失菌株δfgpma1在生长能力方面显著减弱，可见pma1的缺失会导致真菌生长发育停滞，因此，可用于抑制病原菌的生长发育。同时，pma1的缺失抑制don毒素合成，降低病原菌的致病力。由此可见，可以通过抑制pma1蛋白的表达达到防治植物真菌病害的目的。
25.鉴于pma1蛋白是与真菌生长发育有关的功能蛋白，通过阻止或减弱pma1蛋白的表达可有效防控植物真菌病害的蔓延。因此，本发明提供了一种以所述pma1蛋白为受体的化合物或其药学上可接受的盐在防治植物真菌病害中的应用。所述化合物的种类见图3所示结构的14类化合物。
26.在本发明中，pma1蛋白的序列在生物进化中较为保守，本发明对所述真菌的种类不做具体限定，适用于所有种类的真菌病害。所述真菌病害优选包括丝状真菌病害，更优选为包括由镰刀菌属引起的植物病害。本发明对所述由镰刀菌属引起的植物病害的种类不做特殊限制，选择本领域所熟知的由镰刀菌属引起的植物病害的种类即可，例如小麦赤霉病(病原菌为禾谷镰刀菌)和/或水稻恶苗病(病原菌为串珠镰刀菌)等。
27.为了进一步明确pma1蛋白中药物作用位点，本发明提供了一种所述药物靶标pma1蛋白突变体，在如seq id no：2所示氨基酸序列的基础上，将以下结构域片段或者与以下结构域片段相比序列同源性达到80％～99.9％的序列中至少一种序列进行突变：第296～921位氨基酸形成的功能域、第296～395位氨基酸形成的功能域、第621～735位氨基酸形成的功能域和第850～921位氨基酸形成的功能域。
28.在本发明中，所述突变优选包括点突变或所述结构域片段的缺失。所述点突变优选包括以下至少一种的突变方案：所述点突变包括d380g点突变、h703a点突变、s915d点突变、d380g r697h组合点突变、h703a d732e组合点突变、r627h d732e s915d组合点突变和
d380g t854s t916h组合点突变。所述结构域片段的缺失优选包括第296～921位氨基酸形成的功能域、第296～395位氨基酸形成的功能域、第621～735位氨基酸形成的功能域和第850～921位氨基酸形成的功能域的基因或蛋白序列全部或部分缺失。所述突变优选还包括结构域片段相比序列同源性达到85％～90％的序列。
29.在本发明中，无论是对所述结构域片段的一个或几个氨基酸采用点突变方式还是将功能域整体缺失，得到的突变体均会造成镰刀菌的生长发育停滞或减慢，降低真菌(镰刀菌)的生长发育能力，抑制病原真菌的次级代谢产物(don毒素)的合成，抑制真菌病原的致病力，提高药剂的敏感性，因此所述功能域可以作为受体位点，合成高活性化合物，用来防治病害。
30.在本发明中，所述药物靶标pma1蛋白突变体制成真菌突变株，可以作为筛选选择性杀菌剂的生物材料。所述真菌突变株的制备方法，优选构建重组载体，将所述重组载体导入真菌中，经验证筛选，得到真菌突变株。所述重组载体为含药物靶标pma1蛋白突变体。所述重组载体优选采用同源重组方式构建。
31.本发明提供了所述药物靶标pma1蛋白突变体、pma1蛋白的编码基因突变体或真菌突变株在筛选防治植物真菌病原特异性药剂中的应用。所述真菌突变株为包含药物靶标pma1蛋白突变体的真菌。
32.在本发明中，所述防治植物真菌病原特异性药剂优选以pma1蛋白为受体的药剂。
33.本发明提供了所述药物靶标pma1蛋白突变体、pma1蛋白的编码基因突变体或重组载体在降低植物真菌病原致病力方面的应用；所述降低植物真菌病原致病力包括抑制植物真菌病原生长发育和降低毒素产量方面。所述重组载体包括含pma1蛋白的编码基因突变体的表达载体。
34.在本发明中，禾谷镰刀菌pma1蛋白的功能域296～395、621～735以及850～921片段在降低生长发育、毒素合成、致病力以及增加药剂药敏性方面均有作用，这些突变体可以作为选择性化合物的研发以及筛选的生物材料，可以作为受体位点设计选择性药物进行生命活动的反向干扰从而防治病害。
35.下面结合实施例对本发明提供的一种药物靶标蛋白pma1及其在农业上的用途进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
36.本发明中如无特殊说明，用于表示浓度的“％”均为重量百分比，“份”均为重量份。
37.本发明涉及以下培养基，其组成分别为：
38.pda培养基：马铃薯200g煮沸过滤去渣，葡萄糖20g，琼脂15g，纯水定容至1l，高温高压灭菌。
39.yepd培养基：酵母提取物3g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，纯水定容至1l，高温高压灭菌。
40.绿豆汤培养基：绿豆30g，煮沸过滤去渣，纯水定容至1l，高温高压灭菌。
41.rm培养基：酵母提取物1g，酸水解酪蛋白1g，琼脂16g，蔗糖342g，纯水定容至1l，高温高压灭菌。
42.srm培养基：酵母提取物1g，酸水解酪蛋白1g，琼脂糖10g，蔗糖342g，纯水定容至1l，高温高压灭菌。
43.cm培养基：20
×
硝酸盐50ml(nano3，120g；kcl，10.4g；mgso4·
7h2o，10.4g
(5.2ifanhydrous)；kh2po4，30.4g；纯水定容至1l，4℃保存)，微量元素1ml(ddh2o，80ml；znso4·
7h2o，2.2g；h3bo3，1.1g；mncl2·
4h2o，0.5g；feso4·
7h2o，0.5g；cocl2·
6h2o，0.17g；cuso4·
5h2o，0.16g；na2mno4·
2h2o，0.15g；na4edta，5g；纯水定容至100ml，4℃保存)，葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母提取物1g，酸水解酪素1g，维生素溶液1ml(生物素0.01g，维生素b60.01g，硫胺0.01g，核黄素0.01g，对氨基苯(甲)酸0.01g，烟酸0.01g，纯水定容至100ml，4℃保存)，琼脂15g，ph调至6.5，纯水定容至1l，高温高压灭菌后常温保存。
44.mm培养基：蔗糖30g；kh2po4，1g；mgso4·
7h2o，0.5g；kcl，0.5g；feso4·
7h2o，0.01g；nano3，2g；微量元素0.2ml(柠檬酸5g；znso4·
7h2o，5g；fe(nh4)2(so4)2
·
6h2o，1g；cuso4·
5h2o，0.25g；mnso4·
h2o，0.05g；h3bo4·
0.05g；namoo4·
2h2o，0.05g；h2o，95ml)；琼脂20g，纯水定容至1l。
45.胡萝卜培养基：胡萝卜400g，琼脂20g，用榨汁机打碎加纯水定容至1l，高温高压灭菌。
46.tbi培养基：蔗糖30g，nano3，2g；kh2po4，1g；mgso4·
7h2o，0.5g；kcl，0.5g；feso4·
7h2o，0.01g；植物凝胶0.03％；精氨酸0.871g；微量元素0.2ml(znso4·
7h2o，5g；cuso4·
5h2o，0.25g；mnso4·
h2o，0.05g；h3bo4·
0.05g；namoo4·
2h2o，0.05g；柠檬酸5g；纯水定容至100ml)，纯水定容至1l。
47.实施例1
48.禾谷镰刀菌pma1基因功能及其应用
49.本发明通过pma1基因缺失探明其生物学功能及其在控制植物病原菌生长发育中的应用前景。
50.(1)禾谷镰刀菌pma1基因缺失载体的构建方法，具体如下：
51.根据ncbi gene数据库登录号fgsg_01425序列，采用同源重组的方法构建pma1基因缺失载体(如图1所示)，利用a1和a2引物扩增基因编码区上游，用a3和a4引物扩增基因编码区的下游。
52.a1：tcctcccaagccaataacac(seq id no:3)；
53.a2：gctccttcaatatcatcttctgt ggtaggtgacgttaaaagag(seq id no:4)；
54.a3：gagacaataccggaaggaac gatggtatatacccggagca(seq id no:5)；
55.a4：tggttgtgtcgcattagcaa(seq id no:6)。
56.以ptrpchpta
‑
pitk质粒(参见现有技术：fgfim,a key protein regulating resistance to the fungicide js399
‑
19,asexual and sexual development,stress responses and virulence in fusarium graminearum，本实验室保存)dna为模板，利用以下引物扩增双重筛选片段hph
‑
hsv
‑
tk：
57.hph
‑
hsv
‑
f：acagaagatgatattgaaggagc(seq id no:7)；
58.hph
‑
hsv
‑
r：gttccttccggtattgtctc(seq id no:8)。
59.pcr反应总体系100μl：ph
‑
1的全基因组dna模板4μl，2
×
lapcrbuffer 50μl，正反向引物各4μl，加水到100μl(pcr反应所用试剂购自诺唯赞生物科技股份有限公司)。pcr反应条件为：95℃20s，56℃30s，72℃3min，35个循环；72℃延伸10min。
60.所得三个片段作为模板，应用double
‑
joint pcr技术构建缺失载体，随后利用引物a1、a4大量扩增缺失载体，载体经琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化后用于原生质体转化。
61.double
‑
joint pcr反应体系(25μl)：2
×
phanta max buffer 12.5μl，dna模板摩尔质量比(1:3:1)，a1和a4引物各1μl，用水补足25μl。
62.double
‑
joint pcr程序：95℃预变性10min；95℃变性30s，68℃退火30s(每个循环减1℃)，72℃延伸5min，11个循环；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸5min，17个循环，72℃充分延伸10min，15℃保持。
63.原生质体转化的方法：
64.将禾谷镰刀菌标准菌株ph
‑
1在pda培养基上培养2天，划取菌落边缘新鲜的菌块于yepd培养基中过夜培养12～14h。用3层灭菌擦镜纸过滤培养基，然后用0.7m nacl溶液冲洗并收集菌丝块。用10ml细胞壁裂解混合液(0.05g裂解酶，0.05g崩溃酶和0.1g蜗牛酶，0.7m nacl溶液配制，3000rpm离心10min，取上清)悬浮所得菌丝块，置于摇床中在30℃、85rpm条件下裂解2h。再用3层擦镜纸过滤裂解液，收集滤液并在1500rpm条件下离心5min。弃上清，然后用10ml 0.7m nacl溶液重悬沉淀，再在1500rpm条件下离心5min；10ml stc溶液重悬沉淀，再在1500rpm条件下离心5min；弃上清，stc溶液重悬沉淀，调原生质体终浓度至1
×
108个/ml，并加入sptc稀释(stc：sptc＝4：1)，冰上放置。将200μl原生质体悬念液、30μg制备的pma1基因缺失载体和10μl肝素钠(5mg/ml)溶液加入到转化管中，轻轻混匀，冰上放置30min；加入1mlsptc溶液，混匀，25℃放置20min；将此混合液加入到100ml冷却至43℃的rm培养基中，摇匀倒平板，25℃培养16
‑
20h；覆盖10ml/皿含筛选药剂的srm培养基，25℃培养3天，得到待验证的转化子。
65.通过pcr验证禾谷镰刀菌pma1基因缺失菌株：
66.将得到的转化子分别转接到含有50μg/ml潮霉素、100μg/mlf2du以及不含药剂的pda平板上。选择能够在含有潮霉素平板上生长而不能在含有f2du平板上生长的转化子，提取其dna。
67.目的基因的验证：
68.设计引物：01425
‑
yzf和01425
‑
yzr引物，以转化子的基因组dna为模板，通过pcr扩增出pma1的目的基因，扩增不出目的基因条带的即为正确的转化子，进行下一步上下臂的验证。
69.01425
‑
yzf：tctcatataggaagctgccg(seq id no:9)；
70.01425
‑
yzr：ggaagtcgagaaccttgtac(seq id no:10)。
71.pcr反应总体系25μl：dna模板0.6μl，2
×
taq pcrbuffer 12.5μl，正反向引物各0.6μl，加水到25μl(pcr反应所用试剂购自诺唯赞生物科技股份有限公司)。pcr反应条件为：95℃20s，56℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。
72.上臂的验证：01425
‑
yzuf和01425
‑
yzur引物，以转化子的基因组dna为模板，通过pcr扩增出pma1的上臂，可以扩增条带的即为正确的转化子，进行下一步下臂的验证。
73.01425
‑
yzuf：tgcatggaaggacctaggct(seq id no:11)；
74.01425
‑
yzur：gctgaactccccaatgtcaa(seq id no:12)。
75.pcr反应总体系25μl：dna模板0.6μl，2
×
taq pcrbuffer 12.5μl，正反向引物各0.6μl，加水到25μl(pcr反应所用试剂购自诺唯赞生物科技股份有限公司)。pcr反应条件为：95℃20s，56℃30s，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min。
76.下臂的验证：01425
‑
yzdf和01425
‑
yzdr引物，以转化子的基因组dna为模板，通过
pcr扩增出pma1的下臂，可以扩增条带的即为正确的转化子，进行下一步southern blot验证。
77.01425
‑
yzdf：taccttatgggcagcatgac(seq id no:13)；
78.01425
‑
yzdr：acacgagaacctgatacgga(seq id no:14)。
79.pcr反应总体系25μl：dna模板0.6μl，2
×
taq pcrbuffer 12.5μl，正反向引物各0.6μl，加水到25μl(pcr反应所用试剂购自诺唯赞生物科技股份有限公司)。pcr反应条件为：95℃20s，56℃30s，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min。
80.southernblot分析：
81.分别提取转化子基因组，用pvuii酶切，用探针杂交，预期ph
‑
1杂交条带为4912bp，δfgpma1杂交条带为7636bp，转化子均为单拷贝，表明已经得到正确的禾谷镰刀菌pma1基因缺失菌株δfgpma1。
82.(2)禾谷镰刀菌pma1基因缺失菌株δfgpma1生长能力测定试验
83.将构建的pma1基因缺失菌株δfgpma1和标准菌株ph
‑
1在25℃下培养3天，在菌落的边缘用无菌的打孔器打取菌碟，将菌碟接种在pda、cm、mm培养基平板上培养3天。
84.结果如表1所示，pma1基因缺失菌株δfgpma1在pda、cm、mm培养基上的生长能力均显著变弱，本发明证明pma1缺失导致真菌生长发育停滞，可以用于抑制病原菌的生长发育。
85.表1 pma1基因缺失菌株生长情况
[0086][0087][0088]
(3)禾谷镰刀菌pma1基因缺失菌株δfgpma1对don毒素产量的测定试验
[0089]
测定毒素的方法是将禾谷镰刀菌pma1基因缺失菌株δfgpma1和野生菌株ph
‑
1在25℃下培养3天，在菌落的边缘用无菌的打孔器制取菌碟，将菌碟在tbi培养基中培养7天，收集菌丝及滤液，菌丝放至60℃烘箱两天烘干并称重，滤液参照呕吐毒素(don)酶联免疫试剂盒(江苏，维赛科技)的方法测定毒素含量。试剂盒测定毒素含量的方法：将试剂盒中所需试剂及微孔板取出，放置室温(20
‑
25℃)30min以上，液体试剂使用前摇匀。将样品和标准品对应微孔编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。加标准品或者样本50μl到对应的微孔中，加入酶标记物50μl/孔，再加入抗体工作液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后放置室温(25℃)避光反应15min。小心揭开盖板膜，用洗涤工作液充分洗涤，250μl/孔，洗板3次，每次间隔15s，用吸水纸拍干。加入显色液100μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后放置室温(25℃)避光反应5min。加终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设酶标仪于450nm处读取每孔od值。
[0090]
结果如表2所示，pma1基因缺失菌株δfgpma1的don毒素产量显著变低，与标准菌株ph
‑
1差异显著。本发明证明pma1缺失会导致合成次级代谢产物的能力下降，因此可以用于抑制真菌次级代谢物的合成。
[0091]
表2 pma1基因缺失菌株对don毒素产量的影响
[0092][0093]
(4)禾谷镰刀菌pma1基因缺失菌株δfgpma1对致病力的测定试验
[0094]
将禾谷镰刀菌pma1基因缺失菌株δfgpma1和标准菌株ph
‑
1在25℃下培养3天，在菌落的边缘用无菌的打孔器打取菌碟，将菌碟在产孢培养基中培养3天，收集孢子，用无菌水重悬孢子并调孢子浓度到1
×
106个/ml。将预先培养好3天的小麦顶部用剪刀制造伤口，在伤口处接种2μl孢子悬浮液。25℃下培养14天，量取病斑长度。
[0095]
结果如表3所示，pma1基因缺失菌株在胚芽鞘上的病斑长度显著变短，与标准菌株ph
‑
1差异显著。本发明证明pma1缺失会导致胚芽鞘致病力显著降低，可以用于抑制病原真菌的致病力和防治植物病害。
[0096]
表3 pma1基因缺失菌株对致病力的影响
[0097][0098]
(5)禾谷镰刀菌pma1基因缺失菌株δfgpma1对药敏性的测定试验：
[0099]
将构建的pma1基因缺失菌株δfgpma1和标准菌株ph
‑
1在25℃下培养3天，在菌落的边缘用无菌的打孔器打取菌碟，将菌碟接种在pda培养基平板以及含0.2μg/ml氰烯菌酯的pda培养基平板上培养3天。
[0100]
结果如表4所示，pma1基因缺失菌株含0.2μg/ml氰烯菌酯的pda培养基平板上生长的抑制率更大，因此本发明证明pma1缺失可以增加对药剂的敏感性，可以用于提高病原真菌对药剂的药敏性和作为药剂开发的靶标。
[0101]
表4.pma1基因缺失菌株对药剂的敏感性
[0102][0103]
实施例2
[0104]
禾谷镰刀菌pma1基因296～921、296～395、621～735和850～921片段的生物功能及应用
[0105]
本发明通过pma1基因296～921、296～395、621～735和850～921片段缺失，探明其生物学功能及其在作物真菌病害控制中的应用前景。
[0106]
(1)禾谷镰刀菌pma1基因296～921、296～395、621～735和850～921片段缺失突变体的构建
[0107]
设计引物：296～921
‑
1f引物和296～921
‑
1r引物，以禾谷镰刀菌标准菌株ph
‑
1的基因组dna为模板，pcr扩增出296～921片段上游片段。
[0108]
296～921
‑
1f(a1)：tcctcccaagccaataacac(seq id no:3)；
[0109]
296～921
‑
1r：
[0110]
aattccgttcagaacctcagtgctccgggtatataccatctttgt(seq id no:15)。
[0111]
用296～921
‑
2f引物和296～921
‑
2r引物以禾谷镰刀菌标准菌株ph
‑
1的基因组dna为模板，pcr扩增出296～921片段下游片段。
[0112]
296～921
‑
2f:gatggtatatacccggagca(seq id no:16)；
[0113]
296～921
‑
2r(a4)：tggttgtgtcgcattagcaa(seq id no:6)。
[0114]
以获得的296～921片段上游片段和下游片段为模板，pcr将两个片段融合为一个线性片段即为载体。
[0115]
同时，296～395、621～735和850～921片段缺失载体的构建方法与296～921片段缺失载体的构建方法相同，但是所用引物不同，以下为具体的引物序列：
[0116]
设计引物，296～395
‑
1f和296～395
‑
1r引物，以禾谷镰刀菌标准菌株ph
‑
1的基因组dna为模板，pcr扩增出296～395片段上游片段。
[0117]
296～395
‑
1f(a1)：tcctcccaagccaataacac(seq id no:3)；
[0118]
296～395
‑
1r：aattccgttcagaacctcag(seq id no:17)。
[0119]
设计引物，296～395
‑
2f和296～395
‑
2r引物，以禾谷镰刀菌标准菌株ph
‑
1的基因组dna为模板，pcr扩增出296～395片段下游片段。
[0120]
296～395
‑
2f：ctgaggttctgaacggaattttctgtgttgctggcgttga(seq id no:18)；
[0121]
296～395
‑
2r(a4)：tggttgtgtcgcattagcaa(seq id no:6)。
[0122]
设计引物，621～735
‑
1f和621～735
‑
1r引物，以禾谷镰刀菌标准菌株ph
‑
1的基因组dna为模板，pcr扩增出621～735片段上游片段。
[0123]
621～735
‑
1f(a1)：tcctcccaagccaataacac(seq id no:3)；
[0124]
621～735
‑
1r：gacgttgtacttgtgctggg(seq id no:19)。
[0125]
设计引物，621～735
‑
2f和621～735
‑
2r引物，以禾谷镰刀菌标准菌株ph
‑
1的基因组dna为模板，pcr扩增出621～735片段下游片段。
[0126]
621～735
‑
2f：cccagcacaagtacaacgtcgctatcgcctacgacaacgc(seq id no:20)；
[0127]
621～735
‑
2r(a4)：tggttgtgtcgcattagcaa(seq id no:6)。
[0128]
设计引物，850～921
‑
1f和850～921
‑
1r引物，以禾谷镰刀菌标准菌株ph
‑
1的基因组dna为模板，pcr扩增出850～921片段上游片段。
[0129]
850～921
‑
1f(a1)：tcctcccaagccaataacac(seq id no:3)；
[0130]
850～921
‑
1r：tgctccgggtatataccatctttgtttagaaccaaccgaagatacaga(seq id no:21)。
[0131]
设计引物，850～921
‑
2f和850～921
‑
2r引物，以禾谷镰刀菌标准菌株ph
‑
1的基因
组dna为模板，pcr扩增出850～921片段下游片段。
[0132]
850～921
‑
2f：gatggtatatacccggagca(seq id no:22)；
[0133]
850～921
‑
2r(a4)：tggttgtgtcgcattagcaa(seq id no:6)。
[0134]
pcr总体系(25μl)：2
×
phanta max buffer 12.5μl，dna模板摩尔质量比(1:1)，a1和a4引物各1μl，用水补足25μl。
[0135]
pcr程序：95℃预变性10min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，15℃保持。
[0136]
原生质体转化以及转化子的验证如实施例1所示。
[0137]
(2)禾谷镰刀菌pma1基因片段缺失突变体的生长能力测定试验
[0138]
禾谷镰刀菌pma1基因296～921、296～395、621～735和850～921片段缺失突变体的生长能力测定方法如实施例1所示。
[0139]
结果如表5所示，禾谷镰刀菌pma1基因296～921、296～395、621～735和850～921片段缺失突变体在pda、mm、cm培养基上的生长能力明显变弱，说明禾谷镰刀菌pma1基因296～921、296～395、621～735和850～921片段缺失突变体对菌体的生长发育具有重要功能，因此禾谷镰刀菌pma1基因296～921、296～395、621～735和850～921片段可以用于抑制病原的真菌发育。
[0140]
表5 pma1基因片段缺失突变体的生长情况
[0141][0142]
(3)禾谷镰刀菌pma1基因片段缺失突变体的don毒素产量测定试验
[0143]
禾谷镰刀菌pma1基因片段缺失突变体的don毒素产量测定方法如实施例1所示。
[0144]
结果如表6所示，禾谷镰刀菌pma1基因296～921、296～395、621～735和850～921片段缺失突变体的don毒素产量降低，说明禾谷镰刀菌pma1基因296～921、296～395、621～735和850～921片段缺失突变体对次级产物的合成具有重要功能，禾谷镰刀菌pma1基因296～921、296～395、621～735和850～921片段可以用于抑制病原真菌的次级代谢产物的合成。
[0145]
表6 pma1片段缺失突变体的don毒素产量
[0146]
[0147]
(4)禾谷镰刀菌pma1基因片段缺失突变体的致病力测定试验
[0148]
禾谷镰刀菌pma1基因片段缺失突变体的致病力测定方法如实施例1所示。
[0149]
结果如表7所示，禾谷镰刀菌pma1基因296～921、296～395、621～735和850～921片段缺失突变体的胚芽鞘致病力明显下降，说明禾谷镰刀菌pma1基因296～921、296～395、621～735和850～921片段缺失突变体会影响致病力，禾谷镰刀菌pma1基因296～921、296～395、621～735和850～921片段在致病力方面具有重要功能，296～921、296～395、621～735和850～921片段可以用于抑制病原菌的致病力以及防治病害，并且可以作为受体位点，合成高活性化合物，用来防治病害。
[0150]
表7 pma1片段缺失突变体的致病力
[0151][0152][0153]
(5)禾谷镰刀菌pma1基因片段缺失突变体的药敏性测定试验
[0154]
禾谷镰刀菌pma1基因片段缺失突变体的药敏性测定方法如实施例1所示。
[0155]
结果如表8所示，禾谷镰刀菌pma1基因296～921、296～395、621～735和850～921片段缺失突变体对氰烯菌酯的敏感性增加，说明pma1基因296～921、296～395、621～735和850～921片段在药剂的药敏性方面具有重要功能，可以用来提高病原菌对药剂的药敏性以及作为受体位点研发选择性的杀菌剂。
[0156]
表8 pma1片段缺失突变体对药剂的敏感性
[0157][0158]
实施例3
[0159]
禾谷镰刀菌pma1基因d380g、h703a、s915d、d380g r697h、h703a d732e、r627h d732e s915d、d380g t854s t916h点突变体的构建以及应用
[0160]
本发明通过pma1蛋白功能域关键氨基酸突变，探明其药敏性位点或药剂结合位点，揭示在新型杀菌剂研发和应用中的用途。
[0161]
(1)点突变线性载体的构建，以d380g点突变线性载体的构建为例：
[0162]
设计引物：a1和a4引物，以禾谷镰刀菌标准菌株ph
‑
1的基因组dna为模板，pcr扩增
出含有d380g点突变的上游片段；
[0163]
a1：tcctcccaagccaataacac(seq id no:3)；
[0164]
a5：agcttgttcttggtcagagtaccagtcttgccagagcaga(seq id no:23)。
[0165]
设计引物：a4和a6引物，以ph
‑
1的基因组dna为模板，pcr扩增出d380g点突变的下游片段；
[0166]
a4：tggttgtgtcgcattagcaa(seq id no:6)；
[0167]
a6：actctgaccaagaacaagct(seq id no:24)。
[0168]
以获得的d380g点突变的上游片段和下游片段为模板，pcr将两个片段融合为一个线性片段即为载体。
[0169]
h703a、s915d、d380g r697h、h703a d732e、r627h d732e s915d、d380g t854s t916h载体的构建方法与d380g相同，但是引物序列不同，引物序列如下：
[0170]
设计引物，h703a
‑
1f和h703a
‑
1r引物，以禾谷镰刀菌标准菌株ph
‑
1的基因组dna为模板，pcr扩增出h703a点突变载体上游片段。
[0171]
h703a
‑
1f(a1)：tcctcccaagccaataacac(seq id no:3)；
[0172]
h703a
‑
1r：gatccagagaccaaggaagatctccatcgccagggaaaga(seq id no:25)。
[0173]
设计引物，h703a
‑
2f和h703a
‑
2r引物，以禾谷镰刀菌标准菌株ph
‑
1的基因组dna为模板，pcr扩增出h703a点突变载体下游片段。
[0174]
h703a
‑
2f：tcttccttggtctctggatc(seq id no:26)；
[0175]
h703a
‑
2r(a4)：tggttgtgtcgcattagcaa(seq id no:6)。
[0176]
设计引物，s915d
‑
1f和s915d
‑
1r引物，以禾谷镰刀菌标准菌株ph
‑
1的基因组dna为模板，pcr扩增出s915d点突变载体上游片段。
[0177]
s915d
‑
1f(a1)：tcctcccaagccaataacac(seq id no:3)；
[0178]
s915d
‑
1r：tgctccgggtatataccatctttgtttactgagacttctcgtgctgggtcga(seq id no:27)。
[0179]
设计引物，s915d
‑
2f和s915d
‑
2r引物，以禾谷镰刀菌标准菌株ph
‑
1的基因组dna为模板，pcr扩增出s915d点突变载体下游片段。
[0180]
s915d
‑
2f(296～921
‑
2f)：gatggtatatacccggagca(seq id no:16)；
[0181]
s915d
‑
2r(a4)：tggttgtgtcgcattagcaa(seq id no:6)。
[0182]
设计引物，d380g r697h
‑
1f和d380g r697h
‑
1r引物，以d380g点突变载体dna为模板，pcr扩增出d380g r697h点突变载体上游片段。
[0183]
d380g r697h
‑
1f(a1)：tcctcccaagccaataacac(seq id no:3)；
[0184]
d380g r697h
‑
1r：tctccatgtgcagggaaagagcgatgtggtagacaacgt(seq id no:28)。
[0185]
设计引物，d380g r697h
‑
2f和d380g r697h
‑
2r引物，以d380g点突变载体dna为模板，pcr扩增出d380g r697h点突变载体下游片段。
[0186]
d380g r697h
‑
2f：ctttccctgcacatggaga(seq id no:29)；
[0187]
d380g r697h
‑
2r(a4)：tggttgtgtcgcattagcaa(seq id no:6)。
[0188]
设计引物，h703a d732e
‑
1f和h703a d732e
‑
1r引物，以h703a点突变载体dna为模板，pcr扩增出h703a d732e点突变载体上游片段。
[0189]
h703a d732e
‑
1f(a1)：tcctcccaagccaataacac(seq id no:3)；
[0190]
h703a d732e
‑
1r：gtcgtaggcgatagcaagggtggcaatctcggcgaaaatg(seq id no:30)。
[0191]
设计引物，h703a d732e
‑
2f和h703a d732e
‑
2r引物，以h703a点突变载体dna为模板，pcr扩增出h703a d732e点突变载体下游片段。
[0192]
h703a d732e
‑
2f：cccttgctatcgcctacgac(seq id no:31)；
[0193]
h703a d732e
‑
2r(a4)：tggttgtgtcgcattagcaa(seq id no:6)。
[0194]
设计引物，r627h d732e s915d
‑
1f和r627h d732e s915d
‑
1r引物，以s915d点突变载体dna为模板，pcr扩增出d732e s915d点突变载体上游片段。
[0195]
r627h d732e s915d
‑
1f(a1)：tcctcccaagccaataacac(seq id no:3)；
[0196]
r627h d732e s915d
‑
1r(h703a d732e
‑
1r)：gtcgtaggcgatagcaagggtggcaatctcggcgaaaatg(seq id no:30)。
[0197]
设计引物，r627h d732e s915d
‑
2f和h703a d732e
‑
2r引物，以h703a点突变载体dna为模板，pcr扩增出d732e s915d点突变载体下游片段。
[0198]
r627h d732e s915d
‑
2f(h703a d732e
‑
2f)：cccttgctatcgcctacgac(seq id no:31)；
[0199]
r627h d732e s915d
‑
2r(a4)：tggttgtgtcgcattagcaa(seq id no:6)。
[0200]
设计引物，r627h d732e s915d
‑
3f和r627h d732e s915d
‑
3r引物，以d732e s915d点突变载体dna为模板，pcr扩增出r627h d732e s915d点突变载体上游片段。
[0201]
r627h d732e s915d
‑
3f(a1)：tcctcccaagccaataacac(seq id no:3)；
[0202]
r627h d732e s915d
‑
3r：atcaccagtcatggcaacaaggtaaccgtgctgctggaga(seq id no:32)。
[0203]
设计引物，r627h d732e s915d
‑
4f和r627h d732e s915d
‑
4r引物，以d732e s915d点突变载体dna为模板，pcr扩增出r627h d732e s915d点突变载体下游片段。
[0204]
r627h d732e s915d
‑
4f：ttgttgccatgactggtgat(seq id no:33)；
[0205]
r627h d732e s915d
‑
4r(a4)：tggttgtgtcgcattagcaa(seq id no:6)。
[0206]
设计引物，d380g t854s t916h
‑
1f和d380g t854s t916h
‑
1r引物，以d380g点突变载体dna为模板，pcr扩增出d380g t854s点突变载体上游片段。
[0207]
d380g t854s t916h
‑
1f(a1)：tcctcccaagccaataacac(seq id no:3)；
[0208]
d380g t854s t916h
‑
1r：tccagatacggacaacagcgacaatgctgctctggccacc(seq id no:34)。
[0209]
设计引物，d380g t854s t916h
‑
2f和d380g t854s t916h
‑
2r引物，以d380g点突变载体dna为模板，pcr扩增出d380g t854s点突变载体下游片段。
[0210]
d380g t854s t916h
‑
2f：cgctgttgtccgtatctgga(seq id no:35)；
[0211]
d380g t854s t916h
‑
2r(a4)：tggttgtgtcgcattagcaa(seq id no:6)。
[0212]
设计引物，d380g t854s t916h
‑
3f和d380g t854s t916h
‑
3r引物，以d380g t854s点突变载体dna为模板，pcr扩增出d380g t854s t916h点突变载体上游片段。
[0213]
d380g t854s t916h
‑
3f(a1)：tcctcccaagccaataacac(seq id no:3)；
[0214]
d380g t854s t916h
‑
3r：ttactgagacttctcgtgctggtgcgaaacacgctgaag(seqid no:36)。
[0215]
设计引物，d380g t854s t916h
‑
4f和d380g t854s t916h
‑
4r引物，以d380g t854s点突变载体dna为模板，pcr扩增出d380g t854s t916h点突变载体下游片段。
[0216]
d380g t854s t916h
‑
4f：gcacgagaagtctcagtaa(seq id no:37)；
[0217]
d380g t854s t916h
‑
4r(a4)：tggttgtgtcgcattagcaa(seq id no:6)。
[0218]
pcr总体系(25μl)：2
×
phanta max buffer 12.5μl，dna模板摩尔质量比(1:1)，a1和a4引物各1μl，用水补足25μl。
[0219]
pcr程序：95℃预变性10min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，15℃保持。
[0220]
peg介导的禾谷镰刀菌原生质体转化以及转化子的验证如实施例1所示。
[0221]
(2)禾谷镰刀菌pma1蛋白点突变体的生长能力测定试验
[0222]
禾谷镰刀菌pma1蛋白d380g、h703a、s915d、d380g r697h、h703a d732e、r627h d732e s915d、d380g t854s t916h点突变体的生长能力测定方法如实施例1所示。
[0223]
结果如表9所示，禾谷镰刀菌pma1蛋白d380g、h703a、s915d、d380g r697h、h703a d732e、r627h d732e s915d、d380g t854s t916h点突变体在pda、mm、cm培养基平板上的生长能力变弱，说明禾谷镰刀菌pma1基因296～921、296～395、621～735和850～921片段任一氨基酸或者几个氨基酸组合突变对菌体的生长具有重要功能，可以用于抑制病原菌的生长发育，并且可以根据这些氨基酸位点设计反向干扰的药物影响菌体的生长，从而达到防治病害的作用。
[0224]
表9 pma1蛋白点突变体的生长能力
[0225][0226]
(3)禾谷镰刀菌pma1蛋白点突变体的don毒素产量测定试验
[0227]
禾谷镰刀菌pma1蛋白d380g、h703a、s915d、d380g r697h、h703a d732e、r627h d732e s915d、d380g t854s t916h点突变体的don毒素产量测定方法如实施例1所示。
[0228]
结果如表10所示，禾谷镰刀菌pma1蛋白d380g、h703a、s915d、d380g r697h、h703a d732e、r627h d732e s915d、d380g t854s t916h点突变体的don毒素产量下降，与对照相比显著，说明禾谷镰刀菌pma1基因296～921、296～395、621～735和850～921片段任一氨基酸或者几个氨基酸组合突变对次级代谢具有重要的功能，可以用于抑制病原真菌的次级代谢产物的合成。
[0229]
表10 pma1蛋白点突变体的don毒素产量
[0230][0231]
(4)禾谷镰刀菌pma1蛋白点突变体的致病力测定试验
[0232]
禾谷镰刀菌pma1蛋白d380g、h703a、s915d、d380g r697h、h703a d732e、r627h d732e s915d、d380g t854s t916h点突变体的致病力测定方法如实施例1所示。
[0233]
结果如表11所示，禾谷镰刀菌pma1蛋白d380g、h703a、s915d、d380g r697h、h703a d732e、r627h d732e s915d、d380g t854s t916h点突变体的致病力下降，与对照相比显著，说明禾谷镰刀菌pma1基因296～921、296～395、621～735和850～921片段任一氨基酸或者几个氨基酸组合突变对致病力具有重要的功能，可以用于抑制病原菌的致病力以及防治病害，并且可以针对这些位点设计高活性的化合物，用于防治病害。
[0234]
表11 pma1蛋白点突变体的致病力
[0235][0236]
(5)禾谷镰刀菌pma1蛋白点突变体的药敏性测定试验
[0237]
禾谷镰刀菌pma1基因δfgpma1d380g、δfgpma1h703a、δfgpma1s915d、δfgpma1d380g r697h、δfgpma1h703a d732e、δfgpma1r627h d732e s915d、δfgpma1d380g t854s t916h点突变体药敏性测定方法如实施例1所示。
[0238]
结果如表12所示，pma1基因δfgpma1d380g、δfgpma1h703a、δfgpma1s915d、δfgpma1d380g r697h、δfgpma1h703a d732e、δfgpma1r627h d732e s915d、δfgpma1d380g t854s t916h点突变体对氰烯菌酯的药敏性增加，与标准菌株ph
‑
1差异显著。本发明证明禾谷镰刀菌pma1基因296～921、296～395、621～735和850～921片段任一氨基酸或者几个氨基酸组合突变可以影响对药剂的敏感性，可以用来提高病原对药剂的药敏性以及用来筛选药敏性位点。
[0239]
表12 pma1基因点突变体的药敏性
[0240][0241]
实施例4
[0242]
禾谷镰刀菌pma1蛋白的同源建模及与14类化合物的结合能
[0243]
以粗糙脉孢菌pma1晶体结构(pdb id:1mhs)为模板，利用swiss
‑
model构建了禾谷镰刀菌pma1的3d模型(如图2所示)，两者有85.82％同源性，证明该模型具有一定的可靠性，根据此3d模型设计高活性的化合物(见图3)，用于防治病害。
[0244]
r基团设计是但不限于如下基团:
[0245]
化合物1：r1、r3＝cl、f、nh2；r2＝h、ch3、c2h5；
[0246]
化合物2：r1＝cl、f、nh2；r2＝h、ch3、c2h5；r3＝c6h5、c6h4cl、c7h7；
[0247]
化合物3：r1＝cl、f、nh2；r2＝c6h5f、c6h4cl、c7h7；
[0248]
化合物4：r1＝h、nh2、cn；r2＝h、ch3；
[0249]
化合物5：r1、r2＝h、ch3、c2h5；
[0250]
化合物6：r1＝cl、cn、nh2；r2＝c2h5、c6h4cl、c6h3、cl；
[0251]
化合物7：r1、r2、r3＝h、cl、cn、nh2、ch3、c2h5；
[0252]
化合物8：r1＝c3snh3；r2＝h、cl、cn、nh2、ch3、c2h5；
[0253]
化合物9：r1、r2、r3＝h、cl、cn、nh2、ch3、c2h5；
[0254]
化合物10：r1＝h、cl、cn、nh2、ch3、c2h5；
[0255]
化合物11：r1、r2、r3＝h、cl、cn、nh2、ch3、c2h5；
[0256]
化合物12：r1、r2、r3＝h、cl、cn、nh2、ch3；
[0257]
化合物13：r1、r2＝h、cl、cn、nh2、ch3；
[0258]
化合物14：r1、r2＝h、cl、ch3、c2h5；r3＝cl。
[0259]
pma1蛋白与各类化合物的对接自由能计算方法：pma1蛋白与各类化合物的分子对接是在mgltools软件的autodock工具上采用半柔性对接(semiflexible docking)完成的，对接的参数采用拉马克遗传算法(lamarck genetic algorithm，lga)。对接区域体积设定为结果如表13所示。
[0260]
表13 pma1蛋白与各类化合物的对接自由能
[0261][0262]
综上所述，本发明提供了禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)pma1蛋白基因缺失突变体以及功能域缺失突变体在降低禾谷镰刀菌致病力中的应用，并验证了其在降低禾谷镰刀菌生长能力、抑制禾谷镰刀菌毒素合成、降低禾谷镰刀菌对小麦胚芽鞘的致病力中的效果。基于本发明的技术方案以及预测的pma1蛋白3d模型，可以针对蛋白pma1开发具有高活性、具有选择性的药物，可以作为靶向位点设计核酸干扰药物用于病害防治，具有安全的应用前景。
[0263]
此外，本发明提供了禾谷镰刀菌pma1功能域的296～395、621～735以及850～921片段中任何一个氨基酸或几个氨基酸组合的点突变体在降低生长发育、毒素合成、致病力以及增加药剂药敏性方面的应用，这些点突变体可以作为选择性化合物的研发以及筛选的生物材料，可以作为受体位点设计选择性药物进行生命活动的反向干扰从而防治病害。
[0264]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。