一种茯苓多肽及其抗病毒作用的制作方法

1.本发明属于天然产物提取领域，提出了一种具有抗病毒作用的茯苓多肽制备方法。


背景技术：

2.生物活性肽是指少于100个氨基酸通过脱水缩合而成，且相对分子质量低于6 kda的具有生物活性的多肽
[1
‑
2]
。生物活性肽因其具有抗氧化、抗高血压、抗癌、抗菌等特性受到广泛关注
[3]
。近年来，在天然动、植物及微生物体内相继发现了大量的抗病毒肽，这类肽可通过抑制病毒入侵、病毒蛋白合成及提高免疫力等方面发挥抗病毒功效，是诸多抗病毒策略中的研究热点
[4]
。
[0003]
茯苓俗称去苓、松苓，为寄生在松树根上的一种真菌，茯苓与茯苓皮均可入药。据《中华人民共和国药典》(2020版)记载，茯苓为多孔菌科真菌茯苓poria cocos(schw.)wolf的干燥菌核；茯苓皮为多孔菌科真菌茯苓poria cocos(schw.)wolf菌核的干燥外皮。
[0004]
茯苓是传统药食同源产品，在我国有悠久的应用历史。早在1700多年前的《神农本草经》就将其列为上品，主要功效包括利水渗湿，健脾，宁心等。据统计，我国常见中药处方中有70%使用到茯苓。现代药理学研究表明，茯苓提取物中的三萜类化合物和多糖具有多种生理活性，如提高机体免疫力、抗菌、降糖、抗肿瘤等作用。本文采用以复酶水解茯苓蛋白，通过离子交换净化、反相液相色谱分离、四极杆
‑
静电场轨道阱高分辨质谱鉴定，获得了的多肽经体外细胞毒性测定及体外抗单纯疱疹病毒（hsv
‑
1）病毒活性实验验证，具有抗病毒作用。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供一种茯苓多肽及应用，为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种茯苓多肽，所述多肽序列包括：wqlglayvl、mtaanigvsrii或lalpalalp。
[0006]
进一步地，将上述多肽应用于制备抗病毒制剂中。
[0007]
上述多肽的制备方法包括以下步骤：（1）提取：在研细过筛的茯苓粉中加入tris
‑
hcl缓冲液，37 ℃水浴60 min，取出冷冻离心，取上清液用盐酸溶液调节至有絮状沉淀，再冷冻离心后弃上清液取沉淀，
‑
70℃预冻24 h后，
‑ꢀ
50℃真空冷冻干燥48 h，得茯苓冻干蛋白；（2）酶解：取茯苓冻干蛋白溶于hcl溶液中，加入胃蛋白酶于37 ℃水浴酶解12 h，冷冻离心后取上清液以 naoh溶液调节ph 至8.0，加入 nh4hco3缓冲溶液，加入胰蛋白酶于于37 ℃水浴酶解12 h后，沸水浴灭活后冷冻离心，取上清液备用；（3）净化：max spe柱先后以5ml甲醇、5ml水活化，将上述酶解液上样，依次用3 ml5%氨水、1ml甲醇淋洗，抽干淋洗液，以10ml 5%甲醇溶液洗脱，洗脱液于45℃氮吹干，以1 ml 1 %甲酸溶液溶解，过0.22
ꢀµ
m滤膜，进行色谱分离、质谱检测、电喷雾离子源检测。
[0008]
所述色谱条件为：hypersil gold c18色谱柱，100m
ꢀ×ꢀ
2.1 mm，1.9
ꢀµ
m；柱温：30℃；流动相：a：0.1%甲酸水，b：乙腈，洗脱梯度：0~50 min，乙腈10%~90%；50~55 min，乙腈90%；55~56 min，乙腈90%~10%；56~60 min，乙腈10%；流速：0.3 ml/min；进样量：10
ꢀµ
l。
[0009]
所述质谱条件为：扫描模式：full ms/dd
‑
ms2，分析时长60 min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：100
‑
1500 m/z，一级质谱分辨率：70000 at m/z，agg target: le6，一级maximum it: 100 ms，number of scan ranges: 1，动态排除: 40.0 s一次，ms2 activation type: hcd，isolation window: 0.4 m/z，二级质谱分辨率：17500 at m/z 200，microscans: 1，二级maximum it: 50 ms，碰撞能量: 30 ev，underfill ratio: 0.1%。
[0010]
电喷雾离子源检测方法包括：载气为高纯氮气，纯度>99.5%，鞘气流速40个单位arb，辅气流速15个单位arb；喷雾电压3.2 kv；碰撞池采用梯度碰撞能量：25%、35%、55%；毛细管温度320℃，离子透镜电压频率为60，辅气热源温度350℃。
[0011]
本发明的优点在于：茯苓是传统药食同源产品，在我国有悠久的应用历史。本发明采用以复酶水解茯苓蛋白，通过离子交换净化、反相液相色谱分离、四极杆
‑
静电场轨道阱高分辨质谱鉴定，获得了的多肽经体外细胞毒性测定及体外抗单纯疱疹病毒（hsv
‑
1）病毒活性实验验证，具有抗病毒作用。
附图说明
[0012]
图1为茯苓酶解肽的抗病毒功效验证。
具体实施方式
[0013]
试验部分1.1仪器与装置dionex 3000高效液相色谱仪，q
‑
exactive四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪（美国thermofisher公司）；酶标仪（美国bio tek公司）；台式冷冻离心机（日立公司）；冷冻干燥机（labconco公司）。
[0014]
1.2 材料与试剂盐酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、尿素为分析纯，购自国药集团；胰蛋白酶、乙腈、甲酸、甲醇购自thermo fisher公司；二甲基亚砜（dmso）、噻唑蓝（mtt）、胃蛋白酶购自sigma
‑
aldrich公司；hek
‑
293细胞购自美国clontech公司；细胞培养液购自美国gibco公司（货号11130077）；oasis max spe柱（150mg/6ml）购自waters公司。
[0015]
1.3 肽的提取、分离与鉴定提取：在研细过筛的茯苓粉中按料液比1:30（g/ml）加入ph=10的tris
‑
hcl缓冲液，37 ℃水浴60 min，取出于4℃ 18000 r/min离心10 min，取上清液用0.5 mol/l盐酸溶液调节至有絮状沉淀，再于4℃ 18000 r/min离心10 min，弃上清液取沉淀，
‑
70℃ 预冻24 h后，
‑ꢀ
50℃真空冷冻干燥48 h，得茯苓冻干蛋白。
[0016]
酶解：取茯苓冻干蛋白溶于10 ml 0.01 mol/l hcl（ph 2.0）中，加入2.0
×
10
4 u胃蛋白酶于37 ℃水浴酶解12 h，4℃ 18000 r/min离心10 min，取上清液以0.1 mol/l naoh溶液调节ph 约8.0，加入10 ml100 mmol/l nh4hco3缓冲溶液（ph=8，含8 mol/l尿素），加入
1.6
×
10
4 u胰蛋白酶于37 ℃水浴酶解12 h后，沸水浴5 min灭酶活，4℃ 18000 r/min离心10 min，取上清液备用。
[0017]
净化：max spe柱先后以5ml甲醇、5ml水活化，将上述酶解液上样，依次用3 ml5%氨水、1ml甲醇淋洗，抽干淋洗液，以10ml 5%甲醇甲醇溶液洗脱，洗脱液于45℃氮吹至近干，以1 ml 1 %甲酸溶液溶解，过0.22
ꢀµ
m滤膜，待测。
[0018]
色谱条件：hypersil gold c18色谱柱，100m
ꢀ×ꢀ
2.1 mm，1.9
ꢀµ
m；柱温：30℃；流动相：a：0.1%甲酸水，b：乙腈，洗脱梯度：0~50 min，乙腈10%~90%；50~55 min，乙腈90%；55~56 min，乙腈90%~10%；56~60 min，乙腈10%；流速：0.3 ml/min；进样量：10
ꢀµ
l。
[0019]
质谱条件：扫描模式：full ms/dd
‑
ms2，分析时长60 min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：100
‑
1500 m/z，一级质谱分辨率：70000 at m/z，agg target: le6，一级maximum it: 100 ms，number of scan ranges: 1，动态排除(dynamic exclusion): 40.0 s一次，ms2 activation type: hcd，isolation window: 0.4 m/z，二级质谱分辨率：17500 at m/z 200，microscans: 1，二级maximum it: 50 ms，碰撞能量: 30 ev，underfill ratio: 0.1%。
[0020]
电喷雾离子源(esi)：载气为高纯氮气(纯度>99.5%)，鞘气流速40个单位(arb)，辅气流速15个单位(arb)；喷雾电压3.2 kv；碰撞池采用梯度碰撞能量：25%、35%、55%；毛细管温度320℃，离子透镜电压频率(s
‑
lens rf level)为60，辅气热源温度350℃。
[0021]
采用maxquant(版1.6.1.0)进行数据分析。搜索针对包含来自uniprot的茯苓(uniprot
‑ꢀ
wolfiporia cocos.fasta)的蛋白质序列（https://www.uniprot.org，2020年12月2日下载）数据库。蛋白fdr设置为0.1；最小氨基酸长度设置为5；可变修饰设为n
‑
acetyl和oxidation(m)；固定化修饰设置为carbamidomethyl(c)；最大裂解丢失设置为2，删除所有常见的污染物和相反的命中。
[0022]
1.4体外实验验证1.4.1 细胞毒性测定参考文献（hong
‑
hui pan, xiong
‑
tao yu,,ting li, et al. aqueous extract from phaeoporus obliquus(pers.:fr.) j. schroet prevents herpes simplex virus entry through inhibit viral
‑
induced membrane fusion{j}. journal of ethnopharmacology, 2013,15(1):29
‑
38）方法，hek
‑
293细胞经胰酶消化，制成细胞悬浮液，以100
ꢀµ
l 10
5 cells/ml接种于96孔板中，37℃、5% co2培养箱中培养，使其成长为单层细胞，弃去培养液。用细胞培养液（美国gibco公司，货号11130077）配制从10
‑1~10
‑
10 共10个浓度梯度的hsv
‑
1病毒溶液，每孔100 ul、每个浓度设3个复孔依次接种于已长好的hek
‑
293细胞中，同时设置正常细胞对照和空白对照孔（以细胞培养液代替细胞），置于37℃、5% co2病毒培养箱中培养5日，弃去培养液，每孔加 10 ul mtt染色后置于37
°
c 、5% co2病毒培养箱中培养3 h，取出后弃去孔内液体，每孔加100 ul dmso，用酶标仪在540 nm处测定吸光度od值，根据reed
‑
muench公式计算病毒的半数感染浓度tc
50
：细胞存活率=各组od值/正常细胞od值
×
100%；比距（cpe）=（高于50%病变率
‑
50%)/(高于50%病变率
‑
低于50%病变率)
×
100%；tc
50
=antilg（ig高于50% cpe百分率病毒稀释度 比距）
×
稀释因子对数。
[0023]
1.4.2 抗病毒作用验证
参考文献（hong
‑
hui pan, xiong
‑
tao yu,,ting li, et al. aqueous extract from phaeoporus obliquus(pers.:fr.) j. schroet prevents herpes simplex virus entry through inhibit viral
‑
induced membrane fusion{j}. journal of ethnopharmacology, 2013,15(1):29
‑
38）方法，hek
‑
293细胞经胰酶消化，制成细胞悬浮液，以100
ꢀµ
l 10
5 cells/ml接种于96孔板中，37℃、5% co2培养箱中培养，使其成长为单层细胞，弃去培养液。用细胞培养液配制5个浓度的利巴韦林和多肽溶液，每孔100 ul、每个浓度设3个复孔依次接种于已长好的hek
‑
293细胞中，然后接种100tcid
50
的不同病毒溶液50
µ
l，同时同时设置正常细胞对照、病毒对照、空白对照孔（以细胞培养液代替细胞）。置于37℃、5% co2病毒培养箱中培养5日，弃去培养液，每孔加 10 ul mtt染色后置于37
°
c 、5% co2病毒培养箱中培养3 h，取出后弃去孔内液体，每孔加100 ul dmso，用酶标仪在540nm处测定吸光度od值，根据reed
‑
muench公式计算药物的半数有效浓度ec
50
与治疗指数（ti）：ec
50
=antilg（ig高于50% cpe百分率病毒稀释度 比距）
×
c（药物浓度）；ti=tc
50
/ ec
50
。
[0024]
结果与功效验证2.1 茯苓中的酶解肽按以上述实验方法经3次重复测定后有27条相同肽段，其中16条有明确生物来源，结果如下：2.2 抗病毒功效验证单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，hsv）为dna病毒，入侵人体主要通过直接与细胞质膜表面的受体识别，相互融合并进入宿主细胞。具有抗病毒作用的肽类可作用于
病毒与宿主细胞膜融合过程并抑制及阻断，从而起到抗病毒作用。
[0025]
本文从重复鉴定得到的肽段中根据肽的构效选取并合成了3条肽段，分别为lalpalalp 、wqlglayvl 与mtaanigvsrii进行抗hsv
‑
1病毒实验。结果发现，3条肽段均有不同程度的抗病毒作用且显示出浓度
‑
效价相关性。按活性大小依次为wqlglayvl 、mtaanigvsrii与 lalpalalp。其中25 mg/ml的wqlglayvl的tl为20.1，与同浓度的利巴韦林（21.4）相近，显示出良好的抗病毒作用。
[0026]
所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。