一种基于Nanopore宏基因组测序检测环境样品中新抗性基因的方法与流程

一种基于nanopore宏基因组测序检测环境样品中新抗性基因的方法
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域和宏基因组测序领域，尤其是涉及一种基于nanopore宏基因组测序检测环境样品中新抗性基因的方法。


背景技术：

2.目前，检测环境样品中抗生素抗性基因的方法包括细菌纯培养法、qpcr法、基因芯片法和宏基因组法。细菌纯培养法是一种相对传统的方法，通过细菌的培养、分离，利用药敏实验和全基因组测序对细菌携带的抗性基因进行检测，但是该法可能会遗漏很多抗性基因，因为大部分细菌不具可培养性。qpcr法对关注的抗性基因设计引物，通过荧光定量实时pcr的方法可以对样品中抗性基因进行定量检测，但是只能针对已知抗性基因进行检测，不能发现新基因。基因芯片的方法则是利用荧光或者同位素标记的方法，通过基因芯片探针杂交的方法检测样品中的抗性基因，其与qpcr相似不能发现新的抗性基因。
3.氯霉素类抗生素是二氯乙酰胺衍生物，又称酰胺醇类抗生素，在化学结构上由二氯乙酰胺、丙二醇与苯基构成，其化学性质稳定，在水中溶解度较低，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂，是广谱抑菌型抗生素，对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑制效果。该类抗生素的抑菌作用主要是通过与细菌的50s核糖体亚基结合来抑制肽酰基转移酶的活性，从而使蛋白质合成受阻。由于其使用量较大，在环境中检出频率很高，包括地表水、地下水、养殖废水、生活污水，甚至在一些饮用水水源地中也能检测到。氯霉素在环境中的富存，会导致耐药菌和耐药基因的产生和传播，最终会给人类的健康造成威胁。因此，对于环境样品中氯霉素新型抗性基因的准确检测具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种能够利用三代nanopore宏基因组测序鉴定环境样品抗生素抗性基因的方法。
5.本发明一个方面提供了一种抗性基因的检测方法，所述方法包括以下步骤：
6.1)从样品中提取总dna，并进行dna纯化；
7.2)对纯化后的dna进行宏基因组测序；
8.3)对宏基因组测序后的数据进行分析；
9.其中步骤2)包括：
[0010]2‑
1)建立文库：首先修复dna缺口，使dna链长度最大化；然后进行dna末端修复和尾部加da；随后连接接头，构建完成的文库；
[0011]2‑
2)进行宏基因组测序：采用测序芯片flow cells r9.4和测序仪minion对文库进行测序；
[0012]
步骤3)包括：
[0013]3‑
1)对测序数据进行质控与组装，其中，所述质控为通过软件pycoqc评估数据质
量，包括序列读长分布和质量分布，使用软件nanofilt对fastq序列进行质控，质量阈值设置为q>10，长度设置大于1000；所述组装为使用软件flye对质控后数据的进行组装，并使用mekada对组装后的序列纠错；
[0014]3‑
2)对抗生素抗性基因进行分析，其中，先对抗生素抗性基因数据库sarg进行扩展，将seq id no.1所示的氯霉素抗性基因gmc补充到抗生素抗性基因数据库sarg中，重新格式化扩展后的数据库；然后使用blastp进行比对和注释。
[0015]
在本发明的技术方案中，在步骤3
‑
2)中，使用blastp比对orf文件，所述orf文件为通过prodigal预测步骤3
‑
1)获得的组装序列的开放阅读框。
[0016]
在本发明的技术方案中，在步骤3
‑
2)中，使用blastp进行比对的参数为e
‑
value为1e
‑
10，相似度80％，序列覆盖度70％。
[0017]
在本发明的技术方案中，在步骤3
‑
1)中，通过软件pycoqc评估数据质量前，还包括将原始测序文件转换成fastq格式的数据文件并去除序列的接头的步骤。
[0018]
在本发明的技术方案中，在步骤1)中，使用试剂盒dneasy powersoil kit提取dna，获得dna片段的平均长度15kb。
[0019]
在本发明的技术方案中，在步骤1)中，还包括通过1％琼脂糖凝胶电泳和切胶回收对dna进行纯化的步骤。
[0020]
在本发明的技术方案中，在步骤2
‑
1)中，使用nebnext ffpe dna repair mix进行dna修复，起始dna量为5
‑
6μg。
[0021]
在本发明的技术方案中，在步骤2
‑
1)中，使用nebnext end repair/da
‑
tailing module进行末端修复。
[0022]
在本发明的技术方案中，在步骤2
‑
1)中，使用neb blunt/ta ligase master mix试剂盒连接接头。
[0023]
在本发明的技术方案中，所述检测方法用于环境样品的检测，所述的环境样品选自污水处理厂活性污泥。
[0024]
有益效果
[0025]
本发明采用宏基因组法则针对样品中全部dna进行测序，通过后续的组装和比对等数据处理方法来鉴定样品中的新型抗性基因，通过nanopore宏基因组测序，可以得到更长的读长，克服二代测序短读长带来的组装时无法跨越重复序列的等问题，使得组装更加准确。
[0026]
本发明对抗性基因的数据库进行扩容，补充了新的抗性基因，使得比对准确性更高、更全面。
[0027]
本发明分析过程中，针对数据进行了质控和纠错，从而获得高质量的长序列。
附图说明
[0028]
图1是本发明的实施例1的nanopore测序文库构建流程图。
具体实施方式
[0029]
为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
[0030]
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
[0031]
实施例1
[0032]
1、dna提取和纯化
[0033]
使用试剂盒dneasy powersoil kit(qiagen，usa)提取的dna，其提取的dna长度和纯度较高(dna片段平均长度约15kb,a 260/280≈1.8，a 260/230≈2.0)，dna质量能够满足nanopore三代测序建库的要求。
[0034]
通过1％琼脂糖凝胶电泳和切胶回收对dna进行纯化可以提高dna样品平均长度(即去掉短片段和一些杂质)，从而提高建库质量。
[0035]
使用monarch dna gel extraction kit(neb,usa)进行胶回收，并使用nanodrop(nd
‑
one，thermo fisher scientific，usa)测定纯化后的dna浓度，胶回收方法参考该试剂盒说明书。
[0036]
2、oxford nanopore technologies(ont)三代宏基因组测序
[0037]
使用ligation sequencing kit 1d(sqk
‑
lsk108)(oxford nanopore，uk)试剂盒进行建库，参考nanopore测序平台推荐的两种建库方法1d genomic dna by ligation(sqk
‑
lsk108)和1d gdna selecting for long reads(sqk
‑
lsk108)，并进行了优化，提高了建库效率和文库质量。使用测序芯片flow cells r9.4和测序仪minion(oxford nanopore，uk)对文库进行测序，每块芯片测序需要用时大约48h，可获得数据量达到10gb.
[0038]
2.1文库构建
[0039]
a.dna修复(修复dna缺口，使dna链长度最大化)
[0040]
经过尝试，发现针对于平均长度约15kb的dna样品，5
‑
6μg是最佳起始dna量。使用nebnext ffpe dna repair mix(#m6630)(neb，usa)进行dna修复，按照下表加入各种试剂至1.5ml ep管中，轻弹管壁使液体混匀并短暂离心，在20℃下培育15min；然后加入155μlampure xp beads(beckman，usa)悬液，置于hula mixer混匀仪(或者轻柔慢速手动颠倒离心管，不需要液体在管内移动)上培育5min；随后短暂离心，将离心管置于dynamag
‑
2磁力架(thermo fisher scientific，usa)上，约2min后用移液器吸去上清液保留磁珠，加入200μl乙醇，再次用移液器吸去上清液，重复该步骤一次；去除残留的乙醇，晾干30s后，迅速将离心管从磁力架上取下，加入101μl10 mm tris
‑
hcl缓冲液(ph 8.5)，室温下培育10min，每2min要摇动离心管，使dna能够充分溶解到tris
‑
hcl缓冲液中；再将离心管放到磁力架中，约3min后用移液器吸取上清液至新的离心管中。
[0041][0042]
b.dna末端修复和尾部加da
[0043]
使用nebnext end repair/da
‑
tailing module(#e7546)(neb，usa)进行末端修复，按照下表加入各种试剂至0.2ml pcr管中，轻弹管壁使液体混匀并短暂离心，在pcr仪中20℃下培育20min，65℃下培育20min，；然后加入120μlampure xp beads(beckman，usa)悬液，置于hula mixer混匀仪(或者轻柔慢速手动颠倒离心管，不需要液体在管内移动)上培育5min；随后短暂离心，将离心管置于dynamag
‑
2磁力架上，约2min后用移液器吸去上清液保留磁珠，加入200μl乙醇，再次用移液器吸去上清液，重复该步骤一次；去除残留的乙醇，晾干30s后，迅速将离心管从磁力架上取下，加入31μl无核酸酶水，室温下培育10min，每2min要摇动离心管，使dna能够充分溶解到水中；再将离心管放到磁力架中，约3min后用移液器吸取上清液至新的离心管中。
[0044][0045]
c.连接接头
[0046]
使用neb blunt/ta ligase master mix(#m0367)neb，usa)试剂盒连接接头，按照下表加入各种试剂至1.5ml离心管中，轻弹管壁使液体混匀并短暂离心，在室温下培育25min；然后加入60μlampure xp beads(beckman，usa)悬液，置于hula mixer混匀仪(或者轻柔慢速手动颠倒离心管，不需要液体在管内移动)上培育5min；随后短暂离心，将离心管置于dynamag
‑
2磁力架上，约2min后用移液器吸去上清液保留磁珠，加入500μl adapter bead binding缓冲液，轻弹管壁重悬磁珠，短暂离心后置于dynamag
‑
2磁力架上，再次用移液器吸去上清液，晾干30s后，迅速将离心管从磁力架上取下，加入15μlelution缓冲液，室温下培育10min，每2min要摇动离心管，使dna能够充分溶解到缓冲液中；再将离心管放到磁力架中，约3min后用移液器吸取上清液至新的离心管中，即构建完成的文库。
[0047][0048]
2.2上机测序
[0049]
按照测序芯片的操作指南，将构建好的文库加载到flow cells r9.4测序芯片上，将芯片插入minion测序仪中，使用minknow软件进行测序。
[0050]
3、数据分析
[0051]
3.1测序数据质控与组装
[0052]
使用软件guppy(v2.3.1)将ont测序产生的fast5格式的原始测序文件转换成fastq格式的数据文件并去除序列的接头，通过软件pycoqc(v2.2.1)评估数据质量，包括序列读长分布和质量分布。使用nanofilt对fastq序列进行质控，质量阈值设置为q>10，长度设置大于1000；使用nanoplot对质控后的数据进行查看。结果见下表1。
[0053]
表1过滤前后序列质量情况
[0054][0055]
从上表实验结果可知，通过nanofilt过滤了较低质量的序列，能够更有效和准确地实现抗生素抗性基因的检测。
[0056]
使用flye软件对质控后的进行组装，并使用mekada对组装后的序列纠错。使用quast查看组装序列的质量情况。见下表2。
[0057]
表2序列组装质量
[0058]
[0059][0060]
组装后的序列n50值能达到3765345bp，其中最长的序列可以达到6003610bp。
[0061]
3.2arg分析
[0062]
抗生素抗性基因数据库sarg(structured antibiotic resistance genes,sarg)是args
‑
oap分析平台内置的数据库，整合了两大args数据库，ardb和card，并通过对args序列的逐级分类注释，为全面分析args奠定了坚实的基础。将sarg数据库下载至本地，加入氯霉素新型抗性基因gmc的基因序列对sarg数据库进行扩展，并重新格式化扩展后的数据库。新型抗性基因gmc的序列如下seq id no.1所示：
[0063]
gtgcaagatattagaactacggactttatcgtcgttgggggcggttcgagtggcgcggtggtcgcatctcggctaagcgaagagaagcgttttgaggtcgcgttgctcgaagccggcgggtgggacagctcgcctttcattcggattccggcgggctcgatcaaagcgatcatgaatcctgagtacaactggttctatcaagcggaaccggatgcctcacgaaacgatcgagcagacatgtggccggccggcaaagtcctcggcggcggctcgtcgatcaacgggatgatgtatgttcgcggcaatcgcggcgattatgatcaatgggctcagctcggctgcaagggctggtcctatgacgacgtgcttccgttctttaacaaggccgagacgaacgaaaacggcggctcgcgctttcgcggcgacaagggccctctgcgcgtatcgaatgcccgcctatcgaccacgttggccgacgcattcatcgcttctggcgtacgtgcggggattccgcacaatccggataccaacggtgccgagcaagagggtatcggcccctgccaagccacccagaacaagggttggcgacattcaacggcacgcgcctatctggccaaggcgaagcgccgatccaatctgaaggtcgagacgcatttcatggtcagtcgggtactgatcgagaaaggccgcgcgatcggcgtcgaaggcgttcagaacgggcgcacggttcgctacttggcaaacaaggaggtcattctttgcggcggcgcgttgtcgtcgccgaaaatattgatgctctcgggcattggcccggcaaagcatcttggcgagcatggcatccctgttgtcgtcgattccccgggagtggggcaaaatctgcaggaacatcccggagtgttgatgtcgacccatgtcggcatcgatagcctcaatgtcgaagtgcaaagcgtcgccaggatagtcaagcatggcttgaacttcgctttgtttgggcgagggccagccacggcatgcgttgcctccgctctcgcgttcattcgcacgcgagaccatctcgagtggcccaacatccaactgtcgttctcgccgatcgcgtacgacttcacgccggacggcgtacacctgtacaagcgtgcggcaattggcgttgccatcaacatctgccggcccgagacgcgcggtcagttgctgctccgctccaccgatccaagtgagcggccgattatccaacatgagctgctcggcggagatgatgagatcaagcagctcatcgaaggatgccggatcgtgcgcaagattttccgttccaagccattcagtgaatatgacaaaggtgaacgcttacccggaaagcaggtcgaaaccgacgctgattggatcgagtatatccgtcagagcgccttcctgatgtaccacccgactggcacttgcgcgat
gggaattgggccgacagcggttctcgatccggagttgcgcgtcaagggcgtcaccggtcttcgcgttgcggatgcctcgatcatgccgacgctggttagcgcgaatacaaatgcaccgtgcatcatgattggcgaacgggcggccgatctgatccgaagaagccactga
[0064]
使用prodigal预测组装序列的开放阅读框(orf)，得到组装序列的orf文件，接着使用blastp将得到的orf文件与扩展后的sarg数据库进行比对(具体参数：e
‑
value为1e
‑
10，相似度80％，序列覆盖度70％)，得到组装序列上orf的args注释结果。
[0065]
实施例1注释到的抗性基因类型见下表。
[0066]
contig_11_1858>gi|446136270|ref|wp_000214125.1|
[0067]
contig_7_6015>gi|446136270|ref|wp_000214125.1|
[0068]
contig_44_918>gi|730661043|ref|wp_034065992.1|
[0069]
contig_4_113>af261825.2.gene36.p01 chloramphe
[0070]
contig_2_1>gi|27524899|emb|cac87991.1|
[0071]
contig_11_1847>dq464881.1.gene4.p01
[0072]
contig_4_116>nc_010400.5984909.p01
[0073]
contig_9_2098>ay339985.2.gene4.p01
[0074]
contig_8_920>cl5.1_1_106gmc[sphingomonas]
[0075]
contig_7_3*
[0076]
contig_11_1860*
[0077]
contig_11_1842*
[0078]
contig_11_1859*
[0079]
contig_7_6013*
[0080]
contig_15_20*
[0081]
contig_7_4224*
[0082]
contig_11_1843*
[0083]
contig_7_4225*
[0084]
contig_7_6014*
[0085]
contig_10_875*
[0086]
contig_59_21*
[0087]
>cl5.1_1_106gmc[sphingomonas]为注释到的gmc基因
[0088]
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所述技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。