一种使用环介导等温扩增技术鉴定幽门螺杆菌的方法及试剂盒与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种使用环介导等温扩增法检测幽门螺杆菌的试剂盒。


背景技术：

2.幽门螺杆菌病是一种革兰氏阴性螺旋形、微厌氧、对生长条件要求十分苛刻的细菌。1983年首次从慢性活动性胃炎患者的胃黏膜活检组织中分离成功，是目前所知能够在人胃中生存的唯一微生物种类。幽门螺杆菌是公认的慢性活动性胃炎、胃十二指肠溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、胃癌等消化系统疾病的主要致病因素。
3.我国是幽门螺杆菌感染的高发国家，所以对幽门螺杆菌的研究至关重要。目前检测幽门螺杆菌有很多种方法，按照检测原理分有以下几种：微生物学方法(细菌分离培养)、形态学方法(组织病理染色)、依赖于尿素酶检测的方法(ubt和rut)、血清学方法(elisa)、分子检测方法；按照有无侵入性分类：非侵入性检测方法(13/14c
‑
尿素呼气试验、血清学方法、唾液或粪便的pcr检测及抗原检测)和侵入性检测方法(内镜检测、快速尿素酶试验、组织学检测)。其中，由于血清学检测幽门螺杆菌存在假阳性的缺陷，医院已经极少使用；呼气检测法灵敏度高，患者无痛苦，是目前最常用的非侵入性试验之一，可以分为碳
‑
13呼气试验和碳
‑
14呼气试验，其中，碳
‑
14呼气试验临床应用更加普遍，但是由于其检测过程中需要患者服用胶囊，且碳
‑
14具有辐射性，半衰期很长，有可能对人体产生危害，因此禁止用于儿童和孕妇，在应用人群中有一定的限制。碳
‑
13无放射性，但价格更为昂贵，耗时更长，且胃中还存在其他能产生尿素酶的细菌，例如海尔曼螺杆菌，由此可能导致假阳性结果。急性出血和应用质子泵抑制剂可导致假阴性结果，在做ubt之前，建议停止服用质子泵抑制剂或者抗生素2周。由于在进行ubt测试之前需要禁食，对部分患者来说，如糖尿病患者可能会带来一定的困难。此外，由于所需的检测设备昂贵，同其他测试方法相比，ubt成本更高。因此，亟需开发一种快速，可靠性高，成本低，应用范围广的方法检测幽门螺杆菌。
4.日本学者notomi于2000年在nucleic acids res杂志上公开了环介导等温扩增技术(loop
‑
mediated isothermal amplification,缩写lamp)，该技术已成功地应用于sars、禽流感、hiv等疾病的检测中，其针对靶基因的6个区域设计4种特异引物和环状引物，在链置换dna聚合酶(bst dna polymerase)的作用下，60
‑‑
65℃恒温扩增，15
‑
60分钟左右即可实现10^9～10^10倍的核酸扩增，相比于普通pcr，具有价格成本低，特异性高，灵敏性高，反应时间短，易于操作等优点。最重要的是，lamp结果的检测也很简单，不需要像pcr那样进行凝胶电泳，仅通过肉眼观察是否变色或者有无绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种特异性检测幽门螺杆菌的可视化检测方法及试剂盒。
6.为了特异性的检测幽门螺杆菌,首先在ncbi网站上查找上述毒力基因的序列，用dnaman 8软件比对出目的基因的保守区，根据保守区，使用在线软件primer explorer v5设计出lamp引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，所用引物如下：
7.urea
‑
f3:5
’‑
ctgtcaaagtctaagcatct
‑3’
8.urea
‑
b3:5
’‑
actcgtaaccgtgcatac
‑3’
9.urea
‑
fip:5
’‑
gccgttagcgtgaaagttaaaaaaagaaatggaagtgtgagc
‑3’
10.urea
‑
bip:5
’‑
gccttcgttgatagtgatgtctcctattgaggccaatggta
‑3’
11.urea
‑
lf：5
’‑
acagaccggttcaaatcg
‑3’
12.urea
‑
lb:5
’‑
aagaacaactcaccaggaac
‑3’
13.具体的，所述lamp引物进行特异性实验，其中,1、肺炎克雷伯菌；2、铜绿假单胞菌；3、沙门氏菌；4、恶臭假单胞菌；5、鲍曼不动杆菌；6、金黄色葡萄球菌；7、表皮葡萄球菌；8、阴性对照；9、atcc 43504结果表明该引物特异性良好，可以特异性识别幽门螺杆菌，结果见附图2。
14.具体的，所述lamp引物进行灵敏性实验，其中，1、atcc 43504浓度为10ng/μl；2、atcc 43504浓度为1.0ng/μl；3、atcc 43504浓度为0.1ng/μl；4、atcc 43504浓度为0.01ng/μl；5、atcc 43504浓度为0.001ng/μl；6、atcc 43504浓度为0.0001ng/μl；7、阴性对照(无核酸酶水)，结果表明其检测限为0.001ng/μl，结果见附图3。
15.具体的，q
‑
pcr引物进行灵敏度和特异性检测，其中1～6分别为浓度为10ng/μl、1.0ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl、0.001ng/μl、0.0001ng/μl；7～14分别为肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、恶臭假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、阴性对照。结果显示其检测限为0.01ng/μl。故lamp灵敏度为pcr的10倍，结果见附图4。
16.具体的，进一步应用于基于环介导等温扩增法利用上述引物组检测幽门螺杆菌，确定患者是否感染幽门螺杆菌。
17.所述扩增产物的检测步骤如下：
18.(1)配制lamp体系：100μm的外引物f3和b3各0.15μl；100μm的内引物fip和bip各0.2μl；100μm的环引物lf和lb各0.35μl；反应缓冲液12.5μl；bst dna酶1.5μl；模板dna 2μl；荧光染料1μl，加去离子水补足至25μl。
19.(2)进行扩增反应：lamp反应条件为60～65℃反应60min，然后85℃下灭活5min。
20.(3)判断结果：通过肉眼观察颜色变化或者荧光确定是否感染幽门螺杆菌。
21.具体的，(1)中所述缓冲液包含以下组分：终浓度为40mm tris
‑
hcl(ph 8.8)；终浓度为20mm的kcl；终浓度为20mm的mgso4；终浓度为20mm的(nh4)2so4；0.2％的tween 20；终浓度为1.6m的betaine；终浓度为3.2mm的dntps。
22.具体的，(1)中所述的荧光染料为钙黄绿素—氯化锰混合液。配制的具体方法如下：
23.a)配制1m氢氧化钠溶液(配10ml)
24.称取0.4g氢氧化钠固体，溶于10ml灭菌超纯水中，混匀。
25.b)配制6.5mm钙黄绿素溶液(50ml)
26.称取0.162g钙黄绿素放在2ml离心管中，先加1.2ml1m氢氧化钠助溶，25000rpm离心2分钟后转移至50ml离心管中，再加38.8ml已灭菌的超纯水，混匀，此时得到的溶液ph为
8.0～8.5，并于超净台中用0.22μm滤膜过滤除菌，配制成浓度为6.5mm的钙黄绿素。
27.c)配制1.0ml荧光染料
28.取1个2ml离心管，先加入500μl已经灭菌的超纯水，再加入以上所述200μl钙黄绿素溶液，13μl二氯化锰，最后加287μl超纯水补齐至1.0ml。
29.具体的，(2)中反应条件进一步优选为62℃，反应筛选结果见附图5。
30.具体的，(3)中所述的用肉眼判读颜色结果具体为：若反应产物为橙色透明液体，则表明该样品为阴性，患者未感染幽门螺杆菌；若反应产物为绿色浑浊的液体，则认为该样品为阳性，患者感染幽门螺杆菌。
31.本发明不限制通过其他适宜反应程序来实现本发明检测方法。
32.本发明为生物技术领域提供了一种可靠快速检测幽门螺杆菌的方法。
33.本发明提供了一种可视化检测幽门螺杆菌的试剂盒，该试剂盒包括：以上所述引物组、反应缓冲液、bst dna酶、荧光染料、去离子水。
34.本发明有益效果包括：
35.(1)采用本发明检测方法可以快速的鉴定幽门螺杆菌，降低了假阳性和假阴性的概率。
36.(2)相比于其他的检测体系，此方法是在反应前加入荧光染料，一步到位，无需在反应结束后开盖，避免了因开盖造成的气溶胶污染。
37.(3)本试剂盒反应结果易读，既可以通过目视来观察结果，阳性为绿色液体，阴性为橙色液体，还可以通过紫外照射判读结果，在紫外光的照射下，阳性会发出亮绿色的荧光，而阴性则无荧光产生。
38.(4)扩增时不需要设置温度变化和循环，在水浴锅或者金属浴中即可完成反应，适用于在基层医院推广，具有很广阔的应用前景。
附图说明
39.图1为urea基因lamp引物退火位点以及扩增方向
40.图2为urea引物特异性实验结果
41.图3为urea引物灵敏度实验结果
42.图4为q
‑
pcr探针法的灵敏度和特异性实验结果
43.图5为lamp法检测urea基因的反应温度筛选结果
44.图6为q
‑
pcr探针法反应条件
具体实施方式
45.1、标本收集
46.收集深圳大学总医院和深圳市福田区人民医院2021年3月至5月上旬的胃粘膜标本56例，排除标准：1、近四周内服用过抗菌药物、具有抗菌作用的中药、铋剂、ppi、h2受体阻滞剂的患者；2、曾行胃部手术患者；3、近期发生过上消化道出血患者；4、妊娠、哺乳期妇女；5、严重心脑血管疾病、精神疾病、恶性肿瘤等不能配合试验患者；6、有出血、幽门梗阻及胃癌等并发症者；7、运输不符条件或运输样本损坏。
47.2、样品处理
48.在生物安全柜内进行活检组织样品的处理，使用前打开紫外灯将超净台灭菌30min，灭菌结束之后，打开排风扇，吹散在灭菌过程中产生的臭氧。随后用镊子夹取蘸有75％酒精的棉花，擦拭台面，点燃酒精灯。
49.用小型医用剪刀将运输试管内胃黏膜组织剪碎，然后将组织悬液转移至0.5ml组织研磨器中进行充分研磨，研磨至无颗粒状均匀浑浊悬液为止，医用剪刀和组织研磨器在处理每个样品前需进行灭菌处理。
50.3、dna提取
51.1)将上述处理完成的样品转移至1.5ml的离心管中，12000rpm离心2min，弃掉上清。
52.2)加入180微升的buffer gl、20微升的proteinasek、10微升的rnase a，用枪头充分吹打混匀，在56℃水浴温浴10min。
53.3)加入200微升的buffer gb和200微升的无水乙醇，混匀。将spin column放在collection tube上，溶液转移至spin column中，12000rpm离心2min，弃掉滤液。
54.4)向spin column中加入500微升的buffer wa，12000rpm离心1min，弃掉滤液。
55.5)向spin column中加入700微升的buffer wb，12000rpm离心1min，弃掉滤液。
56.6)又一次向spin column中加入700微升的buffer wb，12000rpm离心1min，弃掉滤液。
57.7)将上述弃掉滤液之后的管再次12000rpm离心2min。
58.8)将spin column放在新的1.5毫升的离心管上，在spin column膜的中央处加入50微升的elution buffer，室温静置5min。
59.9)12000rpm离心2min，洗脱dna。离心下来的溶液即提取的dna。
60.4、使用探针法q
‑
pcr法检测幽门螺杆菌
61.使用premix ex taq
tm
(probe qpcr)试剂盒(takara,code no.rr390a)和以下所示引物、探针完成hp阳性鉴定。
62.f:5
’‑
ggagggtgcaagcgttactc
‑3’
63.r:5
’‑
ccacctacctctcccacact
‑3’
64.16s probe:5
’‑
atcactgggcgtaaagagcgcgtaggc
65.反应体系：premix ex taq
tm 12.5μl、引物10μm各加0.8μl、探针1.25μl、ddh2o补足至25μl。
66.反应条件见附图6。
67.5、lamp法检测幽门螺杆菌
68.所用引物如下：
69.urea
‑
f3:5
’‑
ctgtcaaagtctaagcatct
‑3’
70.urea
‑
b3:5
’‑
actcgtaaccgtgcatac
‑3’
71.urea
‑
fip:5
’‑
gccgttagcgtgaaagttaaaaaaagaaatggaagtgtgagc
‑3’
72.urea
‑
bip:5
’‑
gccttcgttgatagtgatgtctcctattgaggccaatggta
‑3’
73.urea
‑
lf：5
’‑
acagaccggttcaaatcg
‑3’
74.urea
‑
lb:5
’‑
aagaacaactcaccaggaac
‑3’
75.反应体系：100μm的外引物f3和b3各0.15μl；100μm的内引物fip和bip各0.2μl；100
μm的环引物lf和lb各0.35μl；反应缓冲液12.5μl；bst dna酶1.5μl；模板dna 2μl；荧光染料1μl，加去离子水补足至25μl。
76.反应条件：62℃反应60min，然后85℃灭活5min。
77.6、实验结果分析
78.使用spss20软件进行统计学分析，对q
‑
pcr和lamp两种方法鉴定检测幽门螺杆菌进行比较，使用χ2检验进行分析，p<0.05为差异有统计学意义。
[0079][0080]
从上表结果中可得，p<0.05,差异有统计学意义,表明lamp法比q
‑
pcr法特异性更高，故可以应用建立的lamp法检测幽门螺杆菌，达到降低实验成本，缩短反应时间的目的。