一种可提高大豆油脂含量的促生菌剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于微生物促生技术领域，具体涉及一种可提高大豆产量和油脂含量和溶磷、溶钾的大豆用促生菌剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.大豆是我国重要的粮食和油料作物，为农业和工业提供大量的原材料。磷素和钾素对大豆产量和品质具有重要意义。磷素参与大豆光合作用、呼吸作用等重要生命活动，缺磷会导致大豆生长缓慢，叶片黄化，花期和成熟期延迟；钾素可激活细胞内多种酶活性，参与维持植物细胞渗透压平衡，增强植物抗寒、抗盐、抗倒伏等抗逆能力，提高co2同化率，促进植物光合作用。为了提高大豆产量，人们在大豆种植中使用大量磷肥和钾肥，但大量的磷钾肥进入农田会与锌等金属离子发生反应生成难溶性化合物，导致土壤板结，降低了土壤品质。
3.大豆油脂富含人体必需的脂肪酸，可以降低人体中胆固醇含量，具有良好的保健功能。同时大豆油脂也是一种可再生生物能源，是仅次于酒精的重要生物燃料来源，因此无论从食品健康还是工业原料来讲，提高大豆油脂含量都具有很高的经济价值。
4.土壤作为一个巨大的磷钾库，磷钾总含量很高，但大部分以植物难以吸收利用的难溶态化合物形式存在，难以满足作物高产需求。土壤中存在一类植物根际促生菌，可溶解难溶性磷素和钾素，提高土壤中速效磷和速效钾含量，供给植物利用，促进植物生长发育，因此利用这些植物根际促生菌开发微生物肥料菌剂是促进大豆养分吸收、提高大豆产量、降低化肥施用量的有效途径。普通微生物肥料菌剂只能提供大豆生长所需营养元素，不能同时提高大豆油脂含量这一重要品质指标，且无法保证菌株能长期存活在植物根际发挥稳定的有益功能。因此，开发与大豆特异性亲和且能稳定定殖的大豆用促生菌剂以促进大豆养分吸收及油脂积累，提高大豆产量和质量，改变传统施肥模式，提高农业收益，不仅符合现代农业的健康发展理念，且对绿色农业可持续发展具有深远意义。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种大豆用促生菌剂。
6.该促生菌剂由dw1菌株发酵而成，所述dw1菌株的分类命名为芽孢杆菌属(bacillus sp.)，2021年07月16日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为cctcc no:m 2021889。
7.优选的，所述促生菌剂为液态菌剂。
8.优选的，所述液态菌剂每公顷大豆田施用量为10
‑
50l，所述液态菌剂中活菌数在1
×
108‑9×
108cfu
·
ml
‑1范围内。
9.本发明的目的之二在于提供一种上述大豆用促生菌剂的制备方法，该制备方法如下：
10.s1.菌种活化，将dw1菌株接入lb斜面培养基，25
‑
30℃培养18
‑
30h；
11.s2.液体培养基培养，使用生理盐水洗涤lb斜面培养基上的菌种，以体积比2
‑
5％接种量接种于80
‑
120ml的lb液体培养基中，置于摇床25
‑
30℃， 120
‑
180r
·
min
‑1振荡培养24
‑
28h，即制得所述液态促生菌剂。
12.本发明的目的之三在于提供上述大豆用促生菌剂的应用，所述促生菌剂用于大豆的浸种和/或包衣和/或浇根。
13.本发明的有益效果在于：
14.1、本发明的促生菌剂对大豆生长有明显地促进作用，可显著增加大豆叶片含磷量和含钾量，可以提高大豆产量。大豆根部可产生大豆凝集素，凝集素是非免疫来源的蛋白质或糖蛋白，可与细菌细胞壁上的多糖结合。本发明的促生菌株具有大豆凝集素亲和性，可与大豆凝集素发生凝集反应。dw1菌株在凝集素介导下长期定殖在大豆根部，稳定地发挥促生效果。
15.2、本发明使用的促生菌株dw1具有溶解难溶态磷和难溶态钾的能力，可增加土壤中速效磷、速效钾含量。
16.dw1菌株溶磷机理主要是：1)菌株在代谢过程中分泌乙酸、苹果酸、柠檬酸等有机酸，降低土壤ph值，并且与fe
3
、al
3
、ca
2
等离子螯合，从而溶解难溶性无机磷酸盐；2)菌株呼吸作用释放的co2，可降低环境ph值，从而溶解难溶性无机磷酸盐。
17.dw1菌株溶钾机理主要是：1)分泌有机酸如草酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸，溶解难溶态钾；2)dw1菌株与矿物接触产生特殊的酶，这些酶破坏土壤中矿石结晶结构，并发生离子交换反应，使其中的钾释放出来；3)dw1菌株分泌的胞外多糖能紧紧地包绕矿物，使菌体与矿石能紧密接触，并且提高矿物表面有机酸的浓度，在有机酸酸溶作用和络合作用的共同作用下，矿物中的钾被释放出来；4)dw1菌株通过分泌的胞外多糖与钾长石形成细菌矿物复合体，菌株对矿物颗粒表面较脆弱的部位产生溶蚀作用，以及菌株产生的代谢产物对矿物进行化学降解作用，导致钾离子等的释放，从而将难溶性钾转换为可溶性的速效钾供大豆吸收。
18.3、本发明的促生菌株dw1还具有产吲哚乙酸(iaa)的能力。吲哚乙酸是一种重要的植物生长素，能够调节、促进植物芽、茎、根的生长，影响植物器官建成。
19.4、本发明的dw1促生菌剂可显著提高大豆叶片含氮量、含磷量和含钾量，显著提高大豆单株粒数、单株豆重和百粒重，显著提高大豆油脂含量，对大豆生长具有明显促进作用，进而提高大豆产量和品质，增加收益。
20.5、本发明的dw1菌剂施入土壤中用量为10
‑
50l/hm2。目前种植大豆磷肥的施用量约为90kg/hm2，钾肥施用量约为120kg/hm2。相比之下，施用本发明提供的促生菌剂可以减少磷肥和钾肥使用量，缓解土壤板结并节约能源消耗，具有广阔的应用前景。
附图说明
21.图1为田间试验中本发明提供的dw1菌剂对大豆产量的影响；
22.图2为田间试验中本发明提供的dw1菌剂对大豆油脂含量和蛋白含量的影响。
具体实施方式
23.下面通过实施例对本发明做进一步描述。
24.实施例1
25.菌株的筛选
26.选取生长健壮的大豆植株，将大豆根部连土整体挖出，除去较大土块及其它无用残渣，分别取各个样品的根际土壤1g于含有制霉菌素的无菌生理盐水中，置于摇床160r
·
min
‑1振荡0.5h，即得根际土壤菌悬液。取1ml上述菌悬液至9ml含有制霉菌素的无菌生理盐水中，梯度稀释至10
‑7浓度。在含有制霉菌素的解磷和解钾固体培养基上涂布上述菌悬液，每个浓度重复3次，28℃恒温培养3d以上，直至出现透明圈。
27.上述解磷培养基的配方是：葡萄糖10g、k2hpo42.0g、硫酸铵0.5g、nacl0.3g、kcl0.3g、mgso4·
7h2o0.3g、feso4·
7h2o0.03g、mnso4·
4h2o0.03g、ca3(po4)210g、琼脂15g、蒸馏水1000ml，ph7.2。
28.解钾培养基的配方是：na2hpo42.0g、mgso4·
7h2o0.5g、fecl30.005g、caco30.1g、钾长石1.0g、蔗糖5.0g、琼脂15g、蒸馏水1000ml，ph7.0
‑
7.5。
29.观察并测量透明圈直径h和菌落直径c，计算二者比值(h/c)，h/c值越大的菌株，其溶磷或溶钾能力也越强。
30.挑取有透明圈的菌落至含有50mg
·
l
‑1制霉菌素的lb培养基上，多次划线纯化，以获得纯系促生菌株。lb培养基配方为：蛋白胨10g、酵母粉5g、nacl10g、琼脂15g、蒸馏水1000ml。
31.在lb液体培养基中接种筛选获得的促生菌株，恒温振荡培养1d，至对数生长期，分装到离心管，3000r
·
min
‑1离心10min，收集菌体。将菌体放入无菌水中用移液枪吹吸数次使其分散悬浮后，离心洗涤，重复3次，得菌悬液。观察若液体较为浑浊，可加少量无菌水稀释。在载玻片中央滴加25μl菌悬液，并与等体积大豆凝集素混匀，室温下静置0.5h，晾干，染色后在显微镜下观察反应现象。
32.挑取出现凝集反应的菌株，获得大豆亲和性促生菌株，本技术使用的dw1即为用此筛选方法获得的一株大豆亲和性促生菌株。
33.实施例2
34.dw1菌株促生能力的测定
35.采用选择性培养基和大豆凝集素双重筛选法从大豆根际筛选出与大豆具有特异亲和性的促生菌，测定这些菌株溶磷、溶钾、产iaa能力。将菌株制成菌悬液，接种到不同的解磷、解钾培养基中，并于28℃，160r
·
min
‑1振荡培养5d。
36.解磷培养基的配方同实施例1，仅去除琼脂；采用钼锑抗法测定各培养液中可溶性磷含量。
37.解钾培养基配方为na2hpo42.0g、mgso4·
7h2o0.5g、fecl30.005g、caco30.1g、钾长石1.0g、葡萄糖5.0g、蒸馏水1000ml，ph7.0
‑
7.5。并于28℃，160r
·
min
‑1振荡培养5d。每瓶菌液接入4mlh2o2，于121℃消解30min后6000r
·
min
‑1离心5min，取上清液定容至100ml，采用火焰光度计法测定上清液中速效钾含量。
38.比较各菌株解磷和解钾能力，其中dw1菌株具有较强的溶磷、溶钾能力，其对难溶性磷、难溶性钾溶解能力较好。
39.测定筛选出的dw1菌株产iaa能力，将dw1菌株以2％接种量接种至有氮液体培养基中，于28℃、160r
·
min
‑1振荡培养5d，离心去沉淀，取上清，按照1:2的比例加入相应的sackowski’s显色液，在暗处25℃混合反应30min，以不接菌的有氮液体培养基作为空白对照，测定530nm处的吸光值，计算dw1 菌株产iaa水平。
40.sackowski’s显色液：1ml 0.5mol
·
l
‑1fecl3溶液加入到50ml 35％hclo4溶液中，混合均匀。有氮液体培养基配方：蔗糖10.0g、k2hpo
4 2.0g、mgso4·
7h2o0.5g、nacl 0.1g、酵母膏0.5g、caco
3 0.5g、琼脂20g、蒸馏水400ml，ph 7.0。
41.dw1菌株对难溶性磷、难溶性钾的溶解能力及产iaa能力见表1。由表1 可见dw1菌株对难溶性磷、难溶性钾溶解能力均较强，并具有较高的产iaa 能力，表明dw1菌株具有促进植物生长的潜力。
42.表1 dw1菌株的溶磷、溶钾、产iaa能力
[0043][0044]
实施例3
[0045]
菌株的鉴定
[0046]
结合形态学观察，生理生化试验和16srrna基因序列比对分析鉴定dw1 菌株种属。
[0047]
根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》，对dw1菌株进行生理生化特性检测。其中形态学试验包括革兰氏染色；生理生化试验包括淀粉水解试验、接触酶试验、vp试验、甲基红(m
‑
r)试验、明胶液化试验、葡萄糖氧化发酵试验、产h2s试验，结果见表2。
[0048]
将dw1菌株16s rrna基因序列提交到ncbi数据库进行blast比对，结合生理生化试验结果，确定dw1菌株属于芽孢杆菌属(bacillus sp.)，dw1 菌株16s rrna基因序列见附录。
[0049]
表2 dw1菌株部分生理生化特性
[0050][0051]
实施例4
[0052]
dw1促生菌剂的制备以及用于大豆田间试验
[0053]
1.菌剂的制备
[0054]
使用5ml生理盐水洗涤lb斜面培养基上的菌种，以体积比2％接种量将 dw1菌株接种至lb液体培养基中，28℃，160r
·
min
‑1振荡培养24h，制得dw1 液态菌剂。使用时用水将菌剂稀释至od
680
＝0.8。
[0055]
2.菌剂的田间试验
[0056]
试验分成两组，一组为施dw1菌剂的实验组，另一组为未施菌剂的对照组。每组设10个重复。将大豆种子播种到田间，待大豆出苗后于根部接入20ml稀释后的菌剂。大豆成熟
后测定实验组和对照组的株高、节数、有效分支数、单株粒数、单株豆重、百粒重、叶片含氮量、叶片含磷量、叶片含钾量以及土壤铵态氮含量、土壤有效磷含量、土壤速效钾含量。结果见图1及表3、表4、表 5。
[0057]
表3田间试验中dw1菌剂对大豆生长的影响
[0058][0059]
注：*表示处理间差异显著(p<0.05)。
[0060]
由表3可见，施加dw1菌剂的实验组，其有效分支数较未施菌剂的对照组提高了25.31％，达显著水平(p<0.05)。
[0061]
dw1菌剂对大豆产量的影响见图1，由图1可见施加dw1菌剂的实验组，其单株粒数、单株豆重、百粒重分别较未施菌剂的对照组提高了50.82％、57.83％和4.62％，达极显著水平(p<0.01)。
[0062]
表4田间试验中dw1菌剂对大豆叶片养分含量的影响
[0063][0064]
注：*表示处理间差异显著(p<0.05)。
[0065]
由表4可知，施加dw1菌剂的实验组，大豆植株其叶片含氮量、含磷量和含钾量较未施菌的对照组分别提高61.15％、64.67％和13.07％，均达显著水平 (p<0.05)。
[0066]
表5田间试验中dw1菌剂对大豆根际土壤养分含量的影响
[0067][0068]
注：*表示处理间差异显著(p<0.05)，**表示处理间差异极显著(p<0.01)
[0069]
由表5可见，施加dw1菌剂的处理组其根际土壤铵态氮含量、有效磷含量和速效钾含量较未施菌剂的对照组分别提高58.49％、31.69％和25.45％，土壤铵态氮提高量达极显著水平(p<0.01)，土壤有效磷和速效钾提高量达显著水平 (p<0.05)。dw1菌剂可提高大豆根际土壤铵态氮、有效磷和速效钾含量。
[0070]
以施dw1菌剂为试验组1，施fk19菌剂为试验组2，未施菌剂为对照组，每组设10个重复。将大豆种子播种到田间，待大豆出苗后于根部分别接入20ml 稀释后的dw1菌剂和fk19菌剂。大豆成熟后测定实验组和对照组的油脂含量、蛋白质含量，结果如图2所示。
[0071]
fk19菌剂是由芽孢杆菌fk19制备的同样对大豆具有促生作用的菌剂，中国发明专
利cn 109652340 b记载了该fk19菌剂对大豆的促生功能。由图2可见，施加dw1菌剂的大豆其油脂含量较未施菌剂的对照提高5.23％，达极显著水平(p<0.01)，且并未降低大豆蛋白质含量。而同样具有大豆促生作用的fk19 菌剂与对照组相比，并未显示提高大豆油脂含量的能力。表明本发明中dw1菌剂可提高大豆油脂含量。
[0072]
由表3、4、5和图1、2可知，dw1菌株可将土壤中难溶态磷和钾释放出来，增加土壤可溶性养分含量，以促进大豆对养分的吸收，提高大豆叶片养分含量，进而促进大豆的生长，提高大豆产量和油脂含量。
[0073]
需要强调的是，本发明提供的促生菌剂还可以与其他菌剂或具有促生效果的产品复配使用；尽管本发明的促生菌剂以大豆为实验对象，但将含有dw1菌株的促生菌剂使用在其他植物体上的实施均应视为本发明的一种实施方式。
[0074]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。