一种利用5SrRNA鉴定鱼类早期发育阶段生理性别的方法与流程

一种利用5srrna鉴定鱼类早期发育阶段生理性别的方法
技术领域
1.本发明属于鱼类生理性别分子鉴定技术领域，更具体涉及一种利用5s rrna鉴定鱼类早期发育阶段生理性别的方法。


背景技术：

2.鱼类早期发育阶段生理性别鉴定对于性腺发育相关研究领域、鱼类资源调查、水产养殖等方面都具有重要价值。同时对于大中型鱼类(比如鲟、鳇、鲑鳟鱼类)来说，早期阶段生理性别的鉴定，可以避免后续对于不需要性别(比如鲟类雄鱼)的持续投入，从而开展有针对性地养殖以减少成本，对于提高养殖经济效益具有重要意义。
3.但是，迄今为止，鱼类早期发育阶段生理性别的鉴定完全依赖于性腺组织学，通过性腺组织样品保存、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、烤片、染色等20多个步骤，制成组织切片，在显微镜下观察才能判断其生理性别，步骤不仅繁琐、耗时长，样品批量处理起来难度非常大；或者采取压片法，利用醋酸洋红染料进行直接、简单染色，在显微镜下观察，此方法在鱼类早期发育阶段卵母细胞较小时，准确率较低。此外，这两种方法都需要将鱼处死，才能获取足够的组织样品，从而进行后续处理和观察。这对于大型或经济价值较高的鱼类来说是无法接受的。更重要的是，养殖过多雄性个体，对于鲟等产业来说是巨大的资源浪费，不仅增加了成本，还阻碍了产业的规模增长。此外，鱼类性别容易受到环境应激条件如应激温度、高密度、低溶氧等的影响，从而出现遗传型性别与表型性别不一致的情况，即存在例如xx雄鱼或xy雌鱼的个体，而性别特异性分子标记只能判断个体的遗传型性别，并不能判断生理型性别。
4.因此，亟需开发一种简单、快捷、可进行大批量样品处理，并且可以实现非处死采取样品的鉴定鱼类早期发育阶段生理性别的方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的是在于提供了一种利用5s rrna鉴定鱼类早期发育阶段生理性别的方法，方法易行，操作简便，可在12小时以内实现了100尾以上鱼类个体的生理型性别鉴定，即表型性别鉴定，确定了鱼类生理性别。在必要情况下，可进行非致死的微量取样来鉴定性别。
6.为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
7.一种利用5s rrna鉴定鱼类早期发育阶段生理性别的方法，包括以下步骤：
8.(1)利用总rna提取试剂盒(康为世纪或thermofisher ambion等)或trizol试剂等常规提取动物细胞总rna的方法，提取鱼类性腺组织总rna，利用核酸分析仪(nanodrop 1000等)测定od260/280值，用来初步判断rna纯度；利用琼脂糖凝胶电泳法分离总rna，观察5s rrna,18s rrna和28s rrna的亮度和分布情况，所述的5s rrna的大小在130～150个核苷酸之间，其在微毛细管电泳的峰值通常在接近140nt的位置，总rna的值指所有覆盖区域所产生的面积大小。
9.(2)将提取的性腺总rna进行微毛细管电泳，根据核酸分析软件(agilent 2100expert或labchip gx等)所得出的各种rna类型覆盖区域(time
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corrected area，或fragment area)面积大小，计算其中5s rrna占总rna的比例。
10.(3)根据5s rrna占总rna比例判断鱼类早期发育阶段的生理型雌雄，其中5srrna比例小于或等于9.0％时判断为精巢组织，5s rrna比例大于或等于12％时判断为卵巢组织。
11.进一步地，所述步骤(1)中的鱼类性腺组织可通过解剖，或用微量性腺取样工具(或挖卵器)进行非致死采样，取1mg～100mg的微量性腺组织，利用步骤中(1)的试剂盒进行总rna快速提取。
12.进一步地，所述的步骤(1)中所提及的鱼类性腺组织是指性别分化完成，卵巢中包含有初级卵母细胞的鱼类性腺组织，不包括性腺未分化、已发育成熟或临近产卵期的鱼类性腺组织。
13.进一步地，所述步的骤(1)中性腺组织总rna提取过程中，应当使用任何一种除性腺外的同种鱼类组织作为提取性腺组织rna的对照。用同样的方法提取该组织总rna，该组织总rna通过od260/280值测定，琼脂糖凝胶电泳或微毛细管电泳检测判断总rna质量合格，才能进行后续性腺组织总rna样品分析。
14.所述步骤(2)中总rna微毛细管电泳及后续分析依赖于相关微量核酸分析软件，特别是能鉴定5s rrna占总rna比例的软件。
15.所述步骤(3)中如果鱼类性腺因遭受激素、环境应激条件而发生性腺组织全部或部分逆转，比如精巢全部或部分转变成卵巢，或卵巢全部或部分转变成精巢，5s rrna占总rna比例也会发生相应变化，从而不能准确判断鱼类生理型性别。
16.通过上述三个步骤的技术措施：最关键的是第二和第三步，主要解决了现阶段鱼类生理型性别鉴定步骤繁琐、大批量样品处理难度大、耗时长、取样致死等问题，建立了一种快速、成本低、可批量处理、非致死的鉴定鱼类早期发育阶段生理型性别的分子生物学方法。
17.技术方案与现有技术的主要区别是：现阶段鱼类早期发育阶段生理性别的鉴定完全依赖于性腺组织学，通过性腺组织样品保存、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、烤片、染色等20多个步骤，制成组织切片，在显微镜下观察才能判断其生理性别，步骤不仅繁琐、耗时长，样品批量处理起来难度非常大；或者采取压片法，利用醋酸洋红染料进行直接、简单染色，在显微镜下观察，此方法在鱼类早期发育阶段卵母细胞较小时，准确率较低。此外，这两种方法都需要将鱼处死，才能获取足够的组织样品，从而进行后续处理和观察。这对于大型或经济价值较高的鱼类来说是无法接受的。本发明的方法仅需要三个主要步骤：(1)总rna提取；(2)总rna微毛细管电泳；(3)5s rrna比例计算及生理性别确定。通过上述技术措施，本发明利用卵巢中初级卵母细胞5s rrna大量累积，从而明显区别于精巢细胞，进行鱼类生理性别鉴定。
18.本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
19.1.较以苏木精
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伊红染色为主的组织学方法来说，操作简单、快捷、成本低，可进行大批量样品处理，4小时内可进行超过100个性腺样品的雌雄鉴定。
20.2.本发明较醋酸洋红压片法准确率高，可达100％。
21.3.对于大中型鱼类来说，采取非致死方式采集微量性腺样品，便可以进行生理性别鉴定。
附图说明
22.图1为一种生理型雄鱼总rna微毛细管电泳示意图。
23.曲线覆盖区域的面积反映各种rna占总rna的比例，该图为表1编号为yc8个体性腺总rna的电泳图，该个体5s rrna占总rna比例为5.6，判断为生理型雄鱼，与组织学吻合。
24.图2为一种生理型雌鱼总rna微毛细管电泳示意图。
25.曲线覆盖区域的面积反映各种rna占总rna的比例，该图为表1编号为yc3个体性腺总rna的电泳图，该个体5s rrna占总rna比例为36.9，判断为生理型雌鱼，与组织学吻合。
具体实施方式
26.下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解发明并予以实施，但所举实验例不作为对本发明的限定。
27.实施例1：
28.下面结合图1和图2对本发明作进一步详细描述：
29.一种利用5s rrna鉴定鱼类早期发育阶段生理性别的方法，其步骤是：
30.(1)性腺组织样品获取。取性别分化刚结束黄颡鱼性腺组织、性腺发育阶段蓝鳃太阳鱼、黄金鲈、大口黑鲈性腺组织，立即保存于rnalater保存液(sigma
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aldrich)，于4℃冰箱放置12小时左右后转入
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80℃冰箱保存。
31.(2)性腺组织总rna提取。取20mg性腺组织进行匀浆后，利用动物组织总rna快速提取试剂盒(康为世纪或thermofisher ambion等)，进行性腺组织总rna提取，将rna浓度调整为50ng/μl。
32.(3)总rna质量鉴定。提取质量合格的精巢或其他组织体细胞总rna在琼脂糖凝胶成像中，会呈现28s rrna与18s rrna亮度比值在1～2之间，而5s rrna带特别弱。而由于发育期间卵巢5s rrna的大量累积，5s rrna在琼脂糖凝胶成像中条带非常明显，明显区别于精巢或其他组织体细胞总rna成像规律，会让提取人员产生rna提取质量不合格的疑惑。为了避免提取质量不合格所产生的混淆，在任一批性腺提取过程中，用同种鱼的一种其他体组织(肝脏、肌肉等)作为提取对照，该对照组织总rna纯度和完整度合格时，再进行后续工作。首先利用核酸分析仪(nanodrop 1000)测定od260/280值，再利用琼脂糖凝胶电泳判断性腺组织和体组织rna完整性，体组织组织rna完整性好时，进行后续微毛细管电泳。
33.(4)总rna分型与定量。同样，由于发育期间卵巢5s rrna的大量累积，agilent 2100bioanalyzer等核酸分析仪检测出的rin值(rna integrity number，rna完整性指数)可以作为精巢或其他体组织细胞总rna完整性的指标，但不能作为判断卵巢组织总rna质量的指标。利用agilent 2100bioanalyzer，用eukaryote total rna nano试剂盒进行总rna微毛细管电泳，微毛细管电泳根据各类型rna核苷酸数量大小进行分型，在凝胶图像上会呈现不同峰值和对应的覆盖区域面积(time corrected area或fragment area)，从而区分5s rrna,18s rrna,28s rrna,trna等各类型rna占总rna的比例。
34.(5)表型性别确定。根据5s rrna占总rna比例判断黄颡鱼、蓝鳃太阳鱼、黄金鲈和
大口黑鲈的生理型雌雄，其中5s rrna比例小于或等于9.0％时判断为精巢组织(图1，为表1中编号为yc8的样品)，5s rrna比例大于或等于12％时判断为卵巢组织(图2，为表1中编号为yc3的样品)。
35.(6)分别对12个黄颡鱼性腺组织、27个黄金鲈性腺组织、26个蓝鳃太阳鱼性腺组织和8个大口黑鲈性腺组织进行了总rna分型与定量检测，并通过以苏木精
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伊红染色的组织学方法进行了所有性腺组织的生理型性别鉴定，发现通过5s rrna定量判断的生理型性别与组织学判断的生理型性别100％吻合(表1)。
36.表1四种鱼类性腺组织5s rrna比例鉴定生理性别与组织学鉴定生理性别吻合度
37.[0038][0039]
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通过上述具体技术措施，本发明建立了一种快速、成本低、可批量处理、非致死的鉴定鱼类早期发育阶段生理型性别的分子生物学方法，解决了现阶段鱼类生理型性别鉴定中，依赖组织学方法中的步骤繁琐、大批量样品处理难度大、耗时长、取样致死等问题。
[0041]
表2进行了目前特定鱼类种类性别鉴定方法与本发明方法中关键技术的比较。
[0042][0043]
以上所述实施例仅是为了充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。