一种IgA肾病的外周血TCR标志物及其检测试剂盒和应用的制作方法

一种iga肾病的外周血tcr标志物及其检测试剂盒和应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种iga肾病的外周血中的t细胞受体(tcr)标志物及其检测试剂盒和应用。


背景技术：

2.一)iga肾病简介
3.iga肾病又称berger病，是临床上最常见的原发性肾小球疾病，其特征是肾小球系膜区出现iga抗体或以iga为主的免疫复合物沉积。iga肾病的发病有明显的地域差别，在欧洲和亚洲占原发性肾小球疾病的15％～40％，而在我国，iga肾病的发病率占原发性肾小球疾病的26％—34％，且近年呈现逐渐上升的趋势。
4.各年龄段均可能发生iga肾病，其中以20～30岁男性青壮年最为多见。iga肾病多为慢性病程，患者的早期症状较轻，但如不及时治疗，据统计多达50％的受累患者会缓慢进展为不同程度的肾衰竭，因此需要尽早诊断及时治疗。
5.二)病因和发病机理
6.iga肾病的病因和发病机理尚在研究中，诸多证据表明它是一个多基因、多因素复杂性状疾病。病因可能源于家族遗传或自身免疫调节异常，也可能由其它疾病特别是感染性疾病和自身免疫性疾病引起，如hiv感染、病毒性肝炎、麻风病、过敏性紫癜、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、银屑病、血清阴性脊柱关节炎、肿瘤等等。
7.iga肾病多由免疫性损伤所致，通过刺激机体产生过多的糖基化异常的iga并诱发自身抗体形成免疫复合物、沉积于肾小球的系膜区，使系膜细胞增生、系膜基质增多、局灶性节段性增生或硬化，少数患者可有较多新月体的形成等，从而导致iga肾病。
8.三)现有诊断方法
9.1、常见临床表现
10.多在上呼吸道感染1～3天后出现易反复发作的肉眼血尿，持续数小时至数天后可转为镜下血尿，可伴有腹痛，腰痛，肌肉痛或低热，部分患者在体检时发现尿异常，为无症状性蛋白尿和(或)镜下血尿，少数患者有持续性肉眼血尿和不同程度蛋白尿，可伴有水肿和高血压。然而，iga肾病的临床表现，有可能与泌尿系统感染、急性肾小球肾炎、遗传性肾小球疾病等发生混淆，需要依赖医生经验加以区分，无法作为确诊依据。
11.2、实验室检查
12.1)血清免疫学检查
13.50％的病人血清iga水平升高。37％～75％病人测到含有iga的特异性循环免疫复合物。然而，也有很大比例的病人常规免疫学检查中血清iga处于正常范围。
14.2)尿液检查
15.蛋白尿定量和分型对iga肾病病情判断、估计预后很重要。蛋白尿<1g/24h者常为轻微及病灶性系膜增生为主。中～重度蛋白尿多为弥漫性系膜增生，常伴新月体及肾小球硬化。血尿：尿rbc形态呈多形性，提示血尿来源是肾小球源性。然而，肾病患者多伴有尿液
指标异常，尿液检查可以作为判断iga肾病确诊患者病情的依据，却无法作为诊断依据。
16.3)肾功能检查
17.血肌酐上升到1.5mg/dl(132.6umol/l)多为病情进展。gfr<20ml/min时，病理改变属ⅲ级以上。与尿液检查类似，肾功能检查可以作为判断iga肾病确诊患者病情的依据，却无法作为诊断依据。
18.3、活检病理诊断
19.iga肾病的确诊必须要有肾活检病理，需要免疫荧光或免疫组化的结果支持。其诊断特点是：光镜下常见弥漫性系膜增生或局灶节段增生性肾小球肾炎；免疫荧光可见系膜区iga或以iga为主的免疫复合物沉积，这是iga肾病的诊断标志。然而，肾脏穿刺活检对病人痛苦大，且存在相当大漏诊、误诊几率。
20.综上所述，目前临床上亟需一种方便、准确且便利的针对iga肾病的检验诊断方法。


技术实现要素：

21.针对目前对于iga肾病临床诊断的迫切需要，以及现有技术中的上述不足，本发明提供一种利用iga肾病人的外周血中特征性的tcr标志物来快速准确的判断待测人员是否已经发生iga肾病特有的t细胞反应的检测标志物及其检测试剂盒和应用，能无创且准确快速的判断待测样本中是否有较高iga肾病风险患者。
22.为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
23.一种iga肾病的外周血tcr标志物，该标志物包括序列为seq id no.1～100所示的蛋白中的至少一种，具体序列见表1。
24.表1标志物序列
25.26.[0027][0028]
进一步地，标志物的蛋白序列为seq id no.1～100所示的序列经取代、缺失和/或替换一个或多个氨基酸后，能实现相同功能的蛋白。
[0029]
进一步地，标志物为外周血tcr抗原决定簇3(cdr3)的蛋白序列。
[0030]
上述标志物在制备治疗iga肾病的制剂中的应用。
[0031]
进一步地，制剂中包括含有该标志物的t细胞受体基因序列，或能表达产生该标志物的t细胞受体的质粒、病毒载体或核酸片段。
[0032]
一种用于iga肾病检测的试剂盒，包括能与上述标志物发生特异性结合的抗体。
[0033]
一种制剂，包括能与上述标志物发生特异性结合的抗体；所述制剂可用于对iga肾病进行诊断、预测、检测或筛查。
[0034]
一种检测iga肾病的蛋白质芯片，该蛋白质芯片包括基片和点样在基片上特异性抗体，该特异性抗体为能与上述标志物发生特异性结合的抗体。
[0035]
本发明的原理为：人体内的b淋巴细胞和t淋巴细胞是获得性免疫系统中重要的两类细胞。b细胞通过细胞表面的b细胞受体(bcr)识别抗原，后期bcr在b细胞分化成浆细胞时，表达成抗体，分泌到细胞外。t细胞通过细胞表面的t细胞受体(tcr)识别抗原。bcr和tcr的多样性是建立获得性免疫系统的基础。bcr多样性的理论值是10
18
，tcr多样性的理论值是10
14
。bcr与tcr序列中，抗原决定簇3(cdr3)是决定其抗原特异性最重要的部分，因此cdr3的序列被认为可以代表bcr、tcr序列的特性。
[0036]
在各种疾病中，随着不同的抗原刺激，bcr和tcr的多样性或者表达水平都会发生改变。因此，利用bcr或者tcr高通量测序结果可以追踪疾病的发生、发展。人体内细胞中，衰老蛋白质降解后，其片段会被运输到细胞表面，通过组织相容性抗原ii(mchii)呈递给免疫系统中的t细胞。正常细胞呈递的抗原片段，由于免疫耐受的关系，不会引起免疫反应。一旦当正常细胞出现病变后，突变的基因表达的异常蛋白，其片段被呈递到细胞表面后，就会引起人体免疫系统产生针对性的免疫反应。因此，分析bcr或tcr的变化，能够检测出肿瘤或其它疾病的发生和发展。
[0037]
针对iga肾病，病人体内产生了疾病特有的t细胞免疫反应。我们就可以利用这些iga肾病病人特有免疫反应特征来判断疾病。
[0038]
本发明的有益效果为：
[0039]
1、本发明中，首先利用1627个非iga肾病的对照组样本、和47个iga肾病病人的tcr高通量测序数据建立大数据分析模型，通过和这些iga肾病特异性tcr序列对比，可以清楚的判断待测样本中是否有较高iga肾病风险者；
[0040]
2、通过高通量测序分析tcr变化可以发现很早期的iga肾病，利用iga肾病特有的tcr cdr3序列分析人的免疫系统中的t细胞对iga肾病的反应，是一种新型的检测方法；
[0041]
3、本发明通过采用高通量测序技术同时比较数量巨大的特异性tcr序列，比起单独检测一种或几种标记物，具有更高的特异性和准确性；
[0042]
4、本发明中使用的高通量测序仪器成本低于大型影像学设备，且可向第三方外包，此外，采样、处理的人力成本低于同时检测多种标记物，也低于大量细胞学检测，因此，本发明大大降低了检测成本；
[0043]
5、本发明只需要采取少量外周血，采样简便、安全，是一种无创检验方法；
[0044]
6、本发明中所述tcr cdr3序列，可用于iga肾病的免疫治疗。
附图说明
[0045]
图1为本发明中，利用基于免疫大数据分析系统发现iga肾病特征性tcr序列。横坐标代表某一特定氨基酸组合的cdr3序列被加入iga肾病特征序列集合的先后顺序，纵坐标代表该序列在某一样本中重复出现次数c
x
的对数值；iga肾病患者的免疫大数据具有多个种类且重复次数较高的iga肾病特征序列，健康人极少iga肾病特征序列，而未知受试者的iga肾病特征比较明显，说明罹患iga肾病风险较高。
[0046]
图2为本发明中，利用iga肾病特征特征性指数对比分析iga肾病和其他疾病。健康人、其它非肿瘤疾病病人的iga肾病特征性指数均与iga肾病患者具有显著差异，证明了iga肾病特征序列集的特异性。据此可以判断未知受试者是否罹患iga肾病。
具体实施方式
[0047]
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
[0048]
实施例1通过免疫大数据分析，获得iga肾病tcr标志物cdr3序列集
[0049]
1、采样及免疫大数据分析
[0050]
采集1628名对照组(包括健康人和其它非肿瘤非肾病疾病病人，1627人用于建立模型，1个健康人用于验证)、48名iga肾病患者(47人用于建立模型，1人用于验证)及1名未知健康状况受试者的外周血(每人10ml)，通过高通量测序得到受试者和对照组的tcr的抗原决定簇3(cdr3)氨基酸序列，保证每个样本的功能性tcr的cdr3序列总数综合不低于25000；
[0051]
2、对每个功能性tcr的cdr3序列总数综合高于30000的样本的序列进行随机不放回抽样，使该样本的cdr3序列数量总和为30000。至此所有样本包含的功能性tcr的cdr3序列总数为25000
‑
30000。对任一特定cdr3序列x，在单样本测序结果中重复出现次数计为c
x
；
[0052]
3、通过分析tcr cdr3数据，确定iga肾病tcr标志物cdr3序列：
[0053]
a)将1627名用于建立模型的对照组样本的所有cdr3序列归总去重，设为对照序列集；
[0054]
b)将47名用于建立模型的iga肾病样本的所有cdr3序列归总去重，再去除所有与对照序列集中包含序列重复的序列，设为iga肾病特征序列集。作图如附图1a所示，其中横坐标代表某一特定氨基酸组合的cdr3序列被加入iga肾病特征序列集合的先后顺序，纵坐标代表该序列在某一样本中重复出现次数c
x
的对数值。
[0055]
c)按照同样作图方法，将1名健康人、1名iga肾病患者和1名健康状况未知受试者的免疫大数据，参照iga肾病特征序列集合进行作图，见附图1b
‑
d。从图中可见，iga肾病患者的免疫大数据中，含有较多种类且较高重复出现次数的iga肾病特征序列(图1b)；健康人的免疫大数据中，只有极少量iga肾病特征序列(图1c)；而未知健康状况受试者，有高于健康人的iga肾病特征序列，说明此人有较高风险罹患iga肾病(图1d)。
[0056]
d)将iga肾病特征序列集中，将所有出现在两个及以上参与建模iga肾病样本里的cdr3序列，按“所有参与建模iga肾病样本里该序列单样本中重复出现次数c
x
的总和
×
包含该序列的参与建模iga肾病样本数”从高到低排序，排名前100者即为iga肾病tcr标志物cdr3序列，具体序列如seq id no.1～100所示。
[0057]
实施例2验证iga肾病tcr标志物cdr3序列集的特异性
[0058]
1、采样及免疫大数据分析
[0059]
采集95名健康人、44名其它非肾病非肿瘤疾病患者和3名未知健康状况受试者的外周血(每人10ml)，通过高通量测序得到受试者和对照组的tcr的抗原决定簇3(cdr3)氨基酸序列，保证每个样本的功能性tcr的cdr3序列总数综合不低于25000；对每个功能性tcr的cdr3序列总数综合高于30000的样本的序列进行随机不放回抽样，使该样本的cdr3序列数量总和为30000。至此所有样本包含的功能性tcr的cdr3序列总数为25000
‑
30000。
[0060]
3、根据来自实施例1的47名iga肾病患者，以及实施例2新获取的95名健康人、44名其它非肾病非肿瘤疾病患者、3名未知健康状况受试者的免疫大数据，分析其iga肾病特征性指数。
[0061]
其中iga肾病特征性指数定义为：某个样本中，属于iga肾病特征序列集的所有cdr3序列在该样本内重复出现次数c
x
的总和。分析结果见下表2及附图2。iga肾病组与健康人(p＝6.96e
‑
138)、非肾病非肿瘤疾病(p＝4.89e
‑
82)都有显著差异，这证明了iga肾病特征序列集的特异性。
[0062]
表2不同样本组的iga肾病特征性指数
[0063]
[0064]
[0065][0066]
4、分析各组的iga肾病特征指数(表3)，3位未知健康状况受试者(检测样本)的iga肾病特征指数显著高于“健康人”组的平均值 2
×
sd(45.1 2
×
15.8＝76.6)、“非肾病非肿瘤疾病”组的平均值 2
×
sd(49.8 2
×
32.5＝114.8)，此3人具有较高风险罹患iga肾病。与临床体检结果对照后，这3人确为早期iga肾病患者。此实施例证明了利用iga肾病特征序列集及iga肾病特征性指数，预测受试者罹患iga肾病风险的可行性。
[0067]
表3 iga肾病特征性指数分析
[0068][0069]
综上所述，本发明所述iga肾病tcr标志物cdr3序列，确实具有显著的iga肾病特异性，不仅可以用于iga肾病的早期诊断，还可用于评估治疗iga肾病的药物的疗效，未来还可以根据这些免疫特征设计新的生物免疫治疗方案。