一种单细胞悬液制备试剂盒的制作方法

1.本发明涉及一种生物试剂技术领域，具体是一种单细胞悬液制备试剂盒。


背景技术：

2.在单细胞测序的进程中，单细胞悬液的制备是目前面临的最大难题，在无数实战经验中，制备高质量的单细胞悬液以得到可靠的数据被公认为重中之重。在实验过程中，如单细胞死亡率过高会导致细胞中的rna释放出来，这种cell
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free rna使数据结果中背景噪声升高。此外，细胞数过低，成团严重，细胞碎片过多等问题，都会影响到有效单细胞数的产出、单细胞核酸的质量等，最终得到的单细胞数据分析及统计结果出现偏差。虽然，针对乳腺组织而生产的解离试剂盒琳琅满目，但由于每个乳腺癌组织成分存在差异性(尤其是在患者使用化疗后，乳腺肿瘤组织胞外基质增多，细胞之间粘附性增强)，使得解离的效果往往不符合预期，即使去除死细胞后，也难达到上机的最低标准。更重要的是，若想观察不同阶段乳腺肿瘤细胞基因型，分群或微环境的变化，那么对于单细胞悬液制备的成功率要求更高。因此，寻找一种针对各种乳腺癌组织均适用的解离方法是解决这些问题的有效途径。
3.目前，实验室所使用的方法多为酶解方式，使用胶原酶iii 4℃过夜解离，该方法相当耗时并且对细胞的损伤大，易产生大量的死细胞，并且长时间的解离会导致细胞生理代谢发生变化，不能反映样本的真实情况。美天旎人肿瘤解离试剂盒在此基础上虽然提高了解离效率，但适用性比较局限，对于机械韧性较强的组织，得到的细胞数量较低，若延长解离时间同样会导致细胞内的转录水平发生变化，细胞碎片过多，影响后续实验结果。因此解离出高质量的单细胞悬液并普遍适用韧性不同组织的解离方法目前尚有较大难度。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种单细胞悬液制备试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.一种单细胞悬液制备试剂盒，包括混合酶i、混合酶ii和混合酶iii，混合酶i由0.1％胶原酶、0.1％胶原酶i、0.01％透明质酸酶以及0.2％bsa溶于hbss液中制成，混合酶ii由0.25％胰蛋白酶溶于hbss液中制成，混合酶iii由0.1％中性蛋白酶、0.02％dnasei酶以及0.2％bsa溶于hbss液中制成。
7.作为本发明的进一步方案：所述hbss选用不含ca与mg离子型。
8.上述试剂盒检测步骤如下；准备预冷的dpbs、hbss、混合酶i、混合酶ii与混合酶iii；
9.s1：将手术或者穿刺获取的新鲜乳腺癌组织置于10cm圆皿中，将组织块切成约50mm3小碎块后剔除脂肪组织和血块，再将肿瘤组织碎块使用干净预冷的dpbs清洗2次，移入无核酶圆底的4ml的ep管中，使用剪刀将组织剪碎至<1mm3的糜状；
10.s2：将预热的混合酶i加入剪碎的组织中，起始组织块直径在5mm内加入1ml混合酶
i，组织体积较大时，增加混合酶i的量，于37℃消化30min，每隔10min使用巴氏管小心吹打10次，将消化完成的组织加入2
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4ml预冷的dpbs终止消化，取量400g，4℃环境离心5min，将离心过后的上清转移至新的ep管，置于冰上待用；
11.s3：将离心得到的沉淀物加入1ml预热的混合酶ii，于37℃消化2min后立即加入步骤2中离心的上清液，取量500g，4℃离心7min，弃上清液；
12.s4：将s3中得到的沉淀物加入1ml的混合酶iii，于37℃消化5min后，加入预冷的dpbs终止消化，使用70μm过滤筛过滤，再使用40μm过滤筛过滤，取量500g，4℃离心5min，弃上清液；
13.s5：将s4中离心得到的细胞沉淀使用2
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3ml红细胞裂解液裂解3min，最后加入3倍红细胞裂解液体积的dpbs终止裂解，取量400g，4℃离心5min，弃上清液；
14.s6：将s5中得到的细胞沉淀加入8ml预冷的dpbs清洗1次，取量350g，4℃离心5min，弃上清液；
15.s7：加入适量的dpbs重悬，测量细胞数目和活率，活率<80％时，则进行去除死细胞步骤，去除死细胞过程按照美天旎清除死细胞磁珠分选试剂盒步骤执行。
16.作为本发明的再进一步方案：所述dpbs中含有0.04％的bsa与0.1mm的edta。
17.作为本发明的再进一步方案：所述s1中乳腺癌组织取出置于圆皿中同时加入预冷的dpbs避免组织表面干燥。
18.作为本发明的再进一步方案：所述s1中，除使用剪刀剪碎组织过程外，其他步骤均置于冰上操作。
19.作为本发明的再进一步方案：所述s2中组织消化时，若在30min内发现无明显组织块，即可终止消化，若仍有较大组织块，则延长消化时间，消化的时间控制在40min内。
20.与现有技术相比，本发明具有以下几个方面的有益效果：
21.1、本发明极大缩短了组织在酶液中的解离时间，有效避免了由于过度解离造成的细胞活率低，细胞碎片多等问题。解离时间的缩短，也阻止了细胞生理代谢的改变。在本实验室所进行的40例单细胞测序的工作中均使用该方法进行解离，其上机率为100％。其测序结果没有由于单细胞悬液质量的问题出现偏差；
22.2、本发明使用“三步酶解法”解离，对于机械韧性程度不同的乳腺癌组织均适用，这也是目前市场的解离试剂盒尚未达到的一项技术，使用该方法可明显提高细胞活率，降低细胞成团率，减少杂质的产生；
23.3、使用该发明解离出的细胞悬液通过流式细胞仪能很好的展示不同表型乳腺癌细胞分群的情况；
24.4、在进行原代培养时，细胞存活率较高，并在不同培养方式中均维持良好的表型特征。
附图说明
25.图1为乳腺肿瘤组织在混合酶i的最适状态图。
26.图2为不同韧性的乳腺肿瘤组织在使用本发明的乳腺癌解离试剂盒和某品牌解离试剂盒最终解离效果的对比图。
27.图3为经本发明处理获得的单细胞悬液进行流式分群的实验效果图。
28.图4为经本发明处理获得的单细胞悬液采用2d和3d原代培养方法的细胞形态图，并对原代细胞进行流式分析的结果图，a图为2d培养，b图为3d培养。
具体实施方式
29.下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
30.请参阅图1
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4，一种单细胞悬液制备试剂盒，包括混合酶i、混合酶ii和混合酶iii，混合酶i由0.1％胶原酶、0.1％胶原酶i、0.01％透明质酸酶以及0.2％bsa溶于hbss液中制成，混合酶ii由0.25％胰蛋白酶溶于hbss液中制成，混合酶iii由0.1％中性蛋白酶、0.02％dnasei酶以及0.2％bsa溶于hbss液中制成；
31.试剂准备：预冷的dpbs(含0.04％bsa，0.1mm edta)；hbss(无ca，mg离子)；混合酶i；混合酶ii；混合酶iii，
32.该试剂检测步骤如下；
33.(1)将手术或者穿刺获取的新鲜乳腺癌组织置于10cm圆皿中，同时加入预冷的dpbs避免组织表面干燥，将组织块切成约50mm3小碎块后剔除脂肪组织和血块，接下来，将肿瘤组织碎块使用干净预冷的dpbs清洗2次，移入无核酶圆底的4ml的ep管中，使用剪刀将组织剪碎至<1mm3的糜状，需要注意的是，除使用剪刀剪碎组织过程外，其他步骤均置于冰上操作；
34.(2)将预热的混合酶i加入剪碎的组织中，起始组织块直径在5mm内加入1ml混合酶i，若组织体积较大，适当增加混合酶i量，于37℃消化30min，在此期间，每隔10min使用巴氏管小心吹打10次，该步骤根据组织的解离程度灵活选择消化时间，若在30min内发现无明显组织块，即可终止消化，若仍有较大组织块，则适当延长消化时间，消化的时间控制在40min内，将消化的组织加入2
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4ml预冷的dpbs终止消化，取量400g，4℃环境离心5min，将离心过后的上清转移至新的ep管，置于冰上待用；
35.(3)将离心得到的沉淀物加入1ml预热的0.25％胰蛋白酶，于37℃消化2min后立即加入步骤2中离心的上清液，取量500g，4℃离心7min，弃上清液；
36.(4)将步骤3中得到的沉淀物加入1ml的混合酶ii，于37℃消化5min后，加入预冷的dpbs终止消化，使用70μm过滤筛过滤，再使用40μm过滤筛过滤，取量500g，4℃离心5min，弃上清液；
37.(5)将步骤4中离心得到的细胞沉淀使用2
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3ml红细胞裂解液裂解3min，再加入3倍红细胞裂解液体积的dpbs终止裂解，取量400g，4℃离心5min，弃上清液；
38.(6)将步骤5中得到的细胞沉淀加入8ml预冷的dpbs清洗1次，取量350g，4℃离心5min，弃上清液；
39.(7)加入适量的dpbs重悬，测量细胞数目和活率，若活率<80％，则进行去除死细胞步骤，去除死细胞过程按照美天旎清除死细胞磁珠分选试剂盒步骤执行。
40.本发明先通过混合酶i，主要降解细胞间质中的天然胶原和网状纤维，使细胞与胶原成分分离而自身的成分不受损害；然后使用混合酶ii，主要是水解细胞间相连接的蛋白质比如纤维蛋白和黏蛋白等，从而使细胞离散，最后使用混合酶iii，通过降解游离的dna，从而阻止细胞聚集成团，通过三步酶解法将获得可用于后续单细胞检测的细胞悬液。
41.上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方
式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。