一种促进表皮干细胞增殖的药物制剂的制作方法

1.本发明属于表皮干细胞技术领域，尤其涉及一种促进表皮干细胞增殖的药物制剂。


背景技术：

2.表皮干细胞（epidermal stem cells）是一类具有无限增殖能力，可增殖分化为表皮中各种功能的细胞群，是制备组织工程皮肤理想的种子细胞。表皮细胞在表皮再生、皮肤稳态维持和创面修复过程中发挥着重要的作用。
3.各种创伤和损伤会造成体表皮肤受损，不仅导致局部渗出，感染和疼痛，严重的患者会出现全身感染、水电解质失衡、休克，甚至部分患者会出现死亡。作为皮肤的种子细胞，表皮干细胞为皮肤修复和重建开辟了新的治疗途径。当损伤发生时，表皮干细胞可以通过增殖和迁移来实现皮肤的修复。因此，通过基因治疗的方式，转染表皮干细胞提高表皮干细胞的增殖和迁移可以使表皮干细胞更好的在皮肤损伤修复中发挥作用。
4.rna干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链rna诱发的同源mrna高效特异性降解的现象。由于使用rnai技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被功能基因组学研究，部分的rna药物已经进入到临床试验阶段。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种促进表皮干细胞增殖的药物制剂。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：本发明提供了一种用于促进表皮干细胞增殖的药物制剂，所述药物制剂含有有效剂量的lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1的sirna或其核酸序列修饰物及药学上可接受的载体。
7.优选地，所述lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1的转录本序列如seq id no.1所示。
8.优选地，所述sirna的序列如seq id no.4和seq id no.5所示。
9.优选地，其特征在于，所述核酸序列修饰物为在seq id no.4或seq id no.5的基础上进行任意核苷酸的核糖修饰或碱基修饰获得的核酸序列修饰物。
10.优选地，其特征在于，所述载体为脂质体、纳米颗粒、胆固醇或病毒。
11.进一步的，本发明提供了lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1的抑制剂在制备用于促进表皮干细胞增殖的药物制剂中的应用，所述lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1的转录本序列如seq id no.1所示。
12.优选地，所述抑制剂为有效剂量的lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1的sirna或其核酸修饰物。
13.优选地，所述sirna的序列如seq id no.4和seq id no.5所示；所述核酸序列修饰物为在seq id no.4或seq id no.5的基础上进行任意核苷酸的核糖修饰或碱基修饰获得的核酸序列修饰物。
14.更进一步的，本发明提供了lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1的抑制剂在制备促细胞周期蛋白cyclin
‑
d1基因表达促进剂或抑细胞周期蛋白p21基因表达抑制剂中的应用，所述lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1的转录本序列如seq id no.1所示。
15.优选地，所述抑制剂为有效剂量的lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1的sirna或其核酸修饰物；所述sirna的序列如seq id no.4和seq id no.5所示；所述核酸序列修饰物为在seq id no.4或seq id no.5的基础上进行任意核苷酸的核糖修饰或碱基修饰获得的核酸序列修饰物。
16.本发明的有益效果是：本发明提供一种能够有效促进表皮干细胞增殖的lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1的sirna，表皮干细胞转染该sirna后，细胞的增殖速率明显加快，且促周期基因cyclin
‑
d1的表达量增加，而抑周期基因p21的表达量降低，因此可将其用于制备促进表皮干细胞增殖的药物制剂，实现表皮干细胞的快速大规模扩增。
附图说明
17.图1 设计合成的sirna对于lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1的抑制效果， ***表示p <0.001 ，表明差异具有统计学意义；图2 mtt实验检测lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1被抑制后，表皮干细胞的增殖变化情况，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p <0.001，表明差异具有统计学意义；图3定量pcr检测lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1被抑制后，细胞周期蛋白p21和cyclin
‑
d1的mrna表达的变化情况，*表示p<0.05，**表示p<0.01，表明差异具有统计学意义；图4细胞划痕实验检测lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1被抑制后，细胞的迁移情况；图5 western blot检测lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1被抑制后，基质细胞衍生因子
‑
1(sdf
‑
1)和趋化因子受体4（cxcr4）的变化情况。
具体实施方式
18.为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。需要说明的是，本发明的实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
19.实施例1 人皮肤表皮干细胞制备（1）取去除皮下脂肪组织的皮肤组织与培养皿中，使用含有双抗的pbs清洗3次，每次5min；（2）将皮肤组织切成皮肤碎片，加入3ml 0.25%的蛋白酶，将皮肤的表皮面向上，真皮面向下放置于培养皿中，放于4℃冰箱中消化过夜；（3）过夜后取出，使用镊子将表皮和真皮分开，使用手术刀将表皮切碎，置于6cm培养皿中，加入2ml胰蛋白酶，放入细胞培养箱中消化15min；（4）加入2ml含有10% fbs的dmem培养基终止消化；（5）使用移液枪反复的吹打，使表皮细胞充分的释放；（6）将细胞悬液使用200目的滤网进行过滤，将过滤好的细胞滤液使用离心机290g离心5min；（7）将上清去除，加入表皮干细胞培养基kgm2将细胞重悬并进行细胞计数；（8）按照每cm2含有2万个细胞的密度将细胞接种于iv型胶原蛋白包被的细胞培养皿中；（9）10min更换培养基，去除未贴壁的细胞，培养2
‑
3天后进行换液；（10）待细胞生长达到80%左右时，使用0.25%胰蛋白酶消化，得到人皮肤表皮干细
胞，用于后续的实验。
20.实施例2 sirna合成和细胞转染1.设计合成sirna分子根据lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1的序列（seq id no.1），设计合成靶向lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1基因的3条sirna序列，具体序列如下：sirna
‑
1正义链：5
′→3′
:auuaacuuccuuaggauuc（seq id no.2）;反义链：5
′→3′
:gaauccuaaggaaguuaau（seq id no.3）;sirna
‑
2正义链：5
′→3′
:uaauuuggcauuacaauag（seq id no.4）反义链：5
′→3′
:cuauuguaaugccaaauua（seq id no.5）sirna
‑
3正义链：5
′→3′
:ugaaucuguuuuaauucac（seq id no.6）反义链：5
′→3′
:gugaauuaaaacagauuca（seq id no.7）其次，设计合成与人基因不同源的sinc作为阴性对照，具体序列如下：sinc正义链：5
′→3′
:uaacacauggcugaauuuc（seq id no.8）反义链：5
′→3′
:gaaauucagccauguguua（seq id no.9）2.转染sirna（1）将实施例1得到的表皮干细胞铺于6孔板中，置于细胞培养箱中过夜培养；（2）过夜后，去除培养基，按照lipofecatamine2000说明书，将sirna
‑
1，sirna
‑
2，sirna
‑
3和sinc转染至表皮干细胞中，并且设置正常培养未进行转染的细胞作为对照组。
21.实施例3 rna提取实验（1）细胞转染48h后，去除培养基，加入1ml trizol，反复吹打裂解细胞后，室温静置5min；（2）加入200ul氯仿，轻轻混匀15s，室温下静置10min，12000rpm、4℃、离心15min；（3）小心的将上清转移至新的ep管中，加入等体积的异丙醇，冰浴下静置10min，12000rpm、4℃、离心5min；（4）去除上清，加入1ml 75%乙醇洗涤2次，轻轻震荡后，1200rpm、4℃、离心5min；（5）去除上清，晾干后加入depc水，置于
‑
80℃中备用。
22.实施例4 使用反转录试剂盒进行反转录1.去除基因组dna（1）冰上配置如下反应液：组分体积5
×
gdnaeraserbuffer2.0μlgdnaeraser1.0μltotalrna1.0μgrnasefreedh2oupto10μl（2）将反应液置于pcr仪器中42℃反应2min，之后置于冰上。
23.2.反转录（1）冰上配置反应液组分体积（μl）去除基因组dna的反应液10primescriptrtenzymemix11.0rtprimermix1.05
×
primescriptbuffer2(forrealtime)4.0rnasefreedh2o4.0total20（2）将反应液置于pcr仪器中37℃反应15min，85℃ 5秒。
24.实施例5 荧光定量pcr反应（1）在冰上配置如下反应体系：组分体积（μl）hieff
® qpcr sybrgreen mastermix (lowroxplus)10forwardprimer (10μm)0.4reverseprimer (10μm)0.4模板dna1无菌超纯水to20（2）按照下表程序进行pcr反应：循环步骤温度时间循环数预变性95℃5min1变性95℃10s40退火/延伸62℃30s （3）引物序列（2）结果采用2
‑△△
ct
法进行分析。
25.实验结果如图1所示，sirna
‑
1的lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1的相对表达量是0.298
±
0.029，与control的差异具有统计学意义；
sirna
‑
2的lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1的相对表达量是0.197
±
0.046，与control的差异具有统计学意义；sirna
‑
3的lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1的相对表达量是0.312
±
0.053，与control的差异具有统计学意义；si
‑
nc的lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1的相对表达量是0.989
±
0.052，与control的差异无统计学意义；从上述的实验结果可以看出，本发明所提供的3个sirna均可以有效的抑制lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1的表达，其中sirna
‑
2的抑制效果最为显著。
26.实施例6mtt实验检测lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1被抑制后，表皮干细胞的增殖变化情况（1）取100ul 2
×
103个对数生长其的表皮干细胞细胞，将细胞接种在预先包被iv型胶原蛋白的96孔板中；（2） 培养2d后，去除培养基按照lipofecatamine2000说明书将sinc和sirna
‑
2转染至表皮干细胞中；（3）分别在转染后1
‑
4d时，加入mtt细胞培养箱中孵育4h，检测490nm吸光度。
27.实验的结果如图2所示：1d时，sinc的od值为0.185
±
0.013，sirna
‑
1的od值为0.221
±
0.015，p=0.035，差异具有统计学意义；2d时，sinc的od值为0.233
±
0.014，sirna
‑
1的od值为0.381
±
0.024，p=0.0008，差异具有统计学意义；3d时，sinc的od值为0.307
±
0.012，sirna
‑
1的od值为0.490
±
0.045，p=0.0023，差异具有统计学意义；4d时，sinc的od值为0.390
±
0.025，sirna
‑
1的od值为0.547
±
0.025，p=0.0015，差异具有统计学意义；从上述的实验结果可以看出，lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1被抑制后，能够有效的促进表皮干细胞的增殖。
28.实施例7定量pcr检测lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1被抑制后，细胞周期蛋白p21和cyclin
‑
d1的mrna表达的变化情况（1）将实施例1得到的表皮干细胞铺于6孔板中，置于细胞培养箱中过夜培养；（2）过夜后，去除培养基，按照lipofecatamine2000说明书将sinc和sirna
‑
2转染至表皮干细胞中；（3）转染48h后，去除培养基，提取rna，检测细胞周期相关基因cyclin
‑
d1和p21的表达情况；（4）cyclin
‑
d1和p21的引物序列如下表，pcr反应条件同实施例5；
实验结果如3所示，sirna
‑
1的cyclin
‑
d1的相对表达量为1.447
±
0.078，p=0.0013，差异具有统计学意义；sirna
‑
1的p21的相对表达量为0.715
±
0.072，p=0.0122，差异具有统计学意义；从上述实验结果可以看出，lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1被抑制后，促进细胞周期的cyclin
‑
d1的表达量明显升高，而抑制细胞周期的p21的表达量显著降低。
29.实施例8 细胞划痕实验检测lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1被抑制后，细胞的迁移情况（1）将实施例1得到的表皮干细胞铺于6孔板中，置于细胞培养箱中过夜培养；（2）过夜后，去除培养基，按照lipofecatamine2000说明书将sinc和sirna
‑
2转染至表皮干细胞中；（3）待细胞的汇合度达到约90%时，使用200ul的移液枪的枪头在孔的中央位置划一条直线；（4）使用pbs将漂浮的细胞去除，24h之后，在倒置显微镜下进行观察和拍照。
30.实验结果如图4所示，可以看出，lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1被抑制后，表皮干细胞的迁移能力相较于对照组明显加强。
31.实施例9western blot检测lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1被抑制后，基质细胞衍生因子
‑
1(sdf
‑
1)和趋化因子受体4（cxcr4）d的变化情况（1）将实施例1得到的表皮干细胞铺于6孔板中，置于细胞培养箱中过夜培养；（2）过夜后，去除培养基，按照lipofecatamine2000说明书将sinc和sirna
‑
2转染至表皮干细胞中；（3）转染48h后，去除培养基，加入蛋白裂解液，使用细胞刮刀将细胞刮下，转移至1.5ml ep管中；（4）将ep管置于冰盒中，放置于摇床上，充分裂解30min；（5）12000rpm，4℃，离心10min后，将上清转移至新的ep管中；（6）吸取2ul裂解液，使用bca法进行蛋白定量，加入上样缓冲液调整蛋白样品浓度为2μg/μl后，放入沸水中煮5min；（7）配置分离胶和浓缩胶，进行上样，上样后组装电泳槽，80v电泳20min，120v至溴酚蓝至胶底部。
32.（8）按照经典的“三明治”模型组装电转夹，安装电转槽，250ma，转膜90min；（9）电转结束后，将膜取出置于5%的脱脂奶粉中，置于摇床上，室温封闭1h；
（10）使用tbst洗膜后，添加一抗，置于4℃孵育过夜；（11）回收一抗，使用tbst洗膜后，添加二抗，置于摇床上，室温孵育1.5h；（12）进行显影曝光和拍照。
33.实验结果如图5所示，可以看出，lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1被抑制之后，表皮干细胞中sdf
‑
1和cxcr4的蛋白表达量明显升高。说明抑制lnc
‑
xpnpep1
‑
1:1能够有效的促进sdf
‑
1和cxcr4的蛋白表达，从而促进细胞的迁移。