用于纯化藻蓝蛋白的方法与流程

1.本发明涉及一种用于纯化通过发酵微藻类产生的特别是由嗜硫原始红藻(galdieria sulphuraria)产生的藻蓝蛋白的新方法，所述方法包括糖原的酶降解。


背景技术：

2.文献中已经描述了通过硫酸铵沉淀从嗜硫原始红藻和螺旋藻属(spirulina)中提取的藻胆蛋白的纯化(moon等人,2015；cruz de jes
ú
s等人,2006)，但是很难在工业规模上应用，因为它需要大量的硫酸铵，这带来了再处理硫酸铵和上清液方面的重大问题。
3.为了获得纯度水平而描述的其他纯化方法(诸如色谱方法)实施起来非常昂贵。
4.藻蓝蛋白提取方法通常在于沉淀存在于来自微藻类发酵的水性粗提取物中的除藻蓝蛋白以外的有机物质以将藻蓝蛋白保存在上清液中，将其进行过滤然后沉淀藻蓝蛋白。然而，一些有机化合物，特别是复合多糖(诸如糖原)对这种沉淀仍不敏感。
5.在工业藻蓝蛋白纯化方法中，可以使用过滤(超滤)步骤去除水，以便浓缩藻蓝蛋白并且去除小于所使用的过滤器的截止阈值的小分子(蛋白质、离子、有机酸等)，以便获得最纯的藻蓝蛋白。然而，过滤器的截止阈值低于糖原的大小，所以后者没有被去除并且增加了渗余物的粘度，限制了过滤的实施及其最佳参数的维持。已经使用来自嗜硫原始红藻的纯化的糖原证明了糖原的浓度依赖性粘度效应(martinez
‑
garcia等人,2017)。
6.此外，获得的纯化的藻蓝蛋白保留了高水平的这些糖，这可能会改变纯化的产物的特性，特别是着色力，从而需要更高量的藻蓝蛋白来获得相同的视觉效果。这些残余的多糖充当了增加藻蓝蛋白制造成本的填充剂，并且可能限制所得的藻蓝蛋白例如在制备具有低糖含量的食料中的商业用途。残余的多糖的存在可能限制产品用于制备具有低糖含量的食品的用途，从而导致去除这些糖的额外成本。
7.糖原是一种如果旨在从通常的糖降解条件中保存藻蓝蛋白，则很难去除的复合糖。糖原是由通过α(1
‑
6)连接来分支的α(1
‑
4)葡萄糖苷链组成的支链多葡萄糖苷。
8.用于细胞裂解的酶的使用在用于从微生物培养物中提取藻蓝蛋白的方法中是已知的(cn 106749633、cn102433015和cn1117973)。此细胞裂解步骤(打破细胞壁以释放藻蓝蛋白，然后提取培养基中释放的藻蓝蛋白)对与藻蓝蛋白一起释放并且与藻蓝蛋白一起提取的糖原无显著作用。
9.可能实现糖原的酶降解。然而，这种多糖是对可以降解它的酶具有部分抗性的聚合物。如通过martinez
‑
garcia等人所示，由于特别大量的α1
‑
6葡萄糖苷分支连接，酶(诸如β
‑
淀粉酶(α1
‑
4葡萄糖苷酶))的使用是不合适的。这些作者示出了胰腺α
‑
淀粉酶(α1
‑
4葡萄糖苷酶)对糖原的相对限制的活性。还原糖测量(代表消解水平)保持较低水平并且迅速饱和。如通过martinez
‑
garcia等人或shimonaga等人的工作所示，使用具有α1
‑
6葡萄糖苷酶活性的酶(异淀粉酶、普鲁兰酶)来将糖原脱支是可能的。但是，长消解时间(24至48小时)后，释放葡萄糖聚合物的消解是不完全的。
10.现有技术中报道的这些糖原消解实验没有考虑藻蓝蛋白保存的问题，即使所使用
的酶可影响藻蓝蛋白的完整性，从而改变其着色和抗氧化特性。
11.目的是通过降低最终产品中残余的糖含量，特别是残余的糖原含量，从定性的角度和从工业和经济的角度来改善用于纯化从生物质中提取的藻蓝蛋白、同时保留藻蓝蛋白特性的方法。


技术实现要素：

12.根据本发明的方法在于对藻蓝蛋白溶液进行酶处理，以用适用于在基本上不降解存在的藻蓝蛋白的温度和ph条件下降解糖原的酶(即在低于6的ph和低于40℃的反应温度下具有活性的酶，诸如葡糖淀粉酶、果胶酶和普鲁兰酶及其混合物)降低糖原含量。
13.根据本发明的方法特别适用于纯化由嗜硫原始红藻产生的耐酸藻胆蛋白，在低于6(有利地为约4)的ph下进行酶反应。
14.本发明还涉及一种藻蓝蛋白提取物，其糖原/藻蓝蛋白比率(以干重计)小于6，有利地小于4，优选小于3，更优选小于2.5，甚至更优选小于1。
附图说明
15.图1表示在不同酶浓度下对于ph＝4消解，藻蓝蛋白随时间的损失曲线(％)。
16.图2表示在不同酶浓度下对于ph＝7消解，藻蓝蛋白随时间的损失曲线(％)。
17.图3表示在不同酶浓度下对于ph＝4消解，在糖原消解后葡萄糖释放随时间的曲线。
18.图4表示在不同酶浓度下对于ph＝7消解，在糖原消解后葡萄糖释放随时间的曲线。
19.图5表示在用和不用酶消解的情况下，渗透物通量随着过滤藻蓝蛋白提取物(c
‑
pc)的时间的变化。
20.图6表示对于不同的酶在ph＝4下糖原消解后的曲线。
21.图7表示对于不同的酶在ph＝7下糖原消解后的曲线。
具体实施方式
22.本发明涉及一种从包含一种或多种藻蓝蛋白和糖原的溶液中纯化藻蓝蛋白的方法，所述方法包括用适用于在基本上不降解存在的藻蓝蛋白的温度和ph条件下降解糖原的酶进行酶降解糖原的步骤和从糖原降解产物中分离藻蓝蛋白的步骤。
23.根据本发明的方法特别适用于纯化从产生藻蓝蛋白的还产生糖原的微生物培养物中提取的藻蓝蛋白溶液，特别是在工业生产藻蓝蛋白的方法的背景下，所述工业生产藻蓝蛋白的方法包括培养微生物，然后回收产生的生物质以提取藻蓝蛋白，以及从此生物质中回收藻蓝蛋白。
24.此方法特别适用于由产生高水平糖原的微生物产生的藻蓝蛋白，特别用于从基于总干物质包含多于10％糖原的生物质中提取和纯化藻蓝蛋白。
25.产生藻蓝蛋白的微生物是熟知的，特别是cyanidiales目的藻类(或微藻类)。cyanidiales目包括cyanidiaceae科或galdieriaceae科，它们本身细分为cyanidioschyzon、cyanidium或galdieria属，除了其他物种外属于这些属的有
cyanidioschyzon merolae 10d、cyanidioschyzon merolae dbv201、cyanidium caldarium、cyanidium daedalumm、cyanidium maximum、cyanidium partitum、cyanidium rumpens、galdieria daedala、galdieria maxima、galdieria partita和嗜硫原始红藻。可以特别提及的是嗜硫原始红藻(也称为cyanidium caldarium)utex 2919株。
26.还可以提及的是已知的藻蓝蛋白生产者，诸如节旋藻属(arthrospira)的丝状蓝细菌，它们以螺旋藻属的通用名称在工业上培养。
27.在上述微生物中特别鉴定了产生具有高糖原含量的藻蓝蛋白的微生物，尤其是节旋藻属、螺旋藻属、聚球藻属(synechococcus)、cyanidioschyzon、cyanidium和galdieria的物种，更特别是嗜硫原始红藻。
28.糖原是广泛存在于自然界的多种生物(细菌、酵母、动物细胞等)中的多糖。如果由α1
‑
6连接来分支的通过α1
‑
4连接的葡萄糖聚合物的结构是共同的，则差异来自分支的百分比和分布。特别地，在本发明的意义上，“糖原”应理解为意指存在于先前提到的产生藻蓝蛋白的生物中的葡萄糖聚合物，所述葡萄糖聚合物独特的特征是其主要分支尺寸小于10个葡萄糖单位，如通过martinez
‑
garcia等人的工作所说明的。
29.用于培养产生藻蓝蛋白的微生物的工业方法是本领域技术人员熟知的。可以特别提及的是申请wo 2017/093345、wo 2017/050917和wo 2018/178334。
30.藻蓝蛋白从生物质的回收也是技术人员已知的。可以特别提及的是申请wo 2018/178334。通常需要机械或酶法裂解细胞步骤，以便释放在微生物的细胞区室中产生的藻蓝蛋白。此细胞裂解通常将产生藻蓝蛋白溶液，所述藻蓝蛋白溶液包含在悬浮液(称为粗悬浮液)中的有机物质，所述有机物质可以通过通常的分离方法分离，特别是通过过滤(尤其是微过滤)，或离心然后过滤，更特别地通过微过滤。然后获得粗藻蓝蛋白溶液，可以通过通常的超滤方法进一步纯化所述粗藻蓝蛋白溶液以去除低分子量有机残余物，以获得精制溶液，可以通过通常的沉淀和干燥方法从所述精制溶液中获得藻蓝蛋白。可以特别提及的是在陶瓷膜或有机膜(诸如聚醚砜或聚砜中空纤维，特别是由repligen公司提出的那些)上进行切向过滤。可以选择这些过滤器的阈值以分离分子量高于或低于目标藻蓝蛋白的分子。
31.然后可以纯化获得的藻蓝蛋白，特别是通过渗滤步骤，以尽可能多地去除低分子量有机残余物。
32.根据本发明的酶处理既可以对粗悬浮液进行，也可以对粗溶液进行。
33.根据本发明的方法特别适用于纯化耐酸藻蓝蛋白(特别是在申请wo 2017/050918中描述的藻蓝蛋白)的溶液。
34.特别地，根据本发明的方法用于纯化由嗜硫原始红藻产生的耐酸藻蓝蛋白，更特别地用于通过嗜硫原始红藻的发酵培养来产生这些藻蓝蛋白的工业方法中。
35.进行酶反应的优选条件是ph低于7，以及反应温度低于60℃，优选低于50℃，甚至更优选低于30℃。
36.有利地，糖原的酶裂解是在小于或等于5，优选约4.5的ph下进行的。
37.优选地，酶反应是在室温下进行的。此室温对应于在温带或在温度对应于温带的房间中使用的定义，即在18℃至28℃范围内，更一般地在20℃至25℃的范围内。
38.这些温度和ph条件特别适用于在酶反应过程中保存藻蓝蛋白。
39.在酸性ph条件下和在室温下具有活性的酶是技术人员已知的。然而，消解糖原以
便保存藻蓝蛋白并且促进藻蓝蛋白产生的条件是未知的。
40.出乎意料地是，发现已知具有α1
‑
4半乳糖醛酸活性的酶在与藻蓝蛋白纯化相容的ph和温度条件下也具有α1
‑
4葡萄糖苷酶(或α
‑
葡萄糖苷酶)活性。
41.特别是对于已知降解果胶的果胶酶和特别是从丝状真菌(诸如曲霉属(aspergillus))中提取的果胶酶，更特别是从棘孢曲霉(aspergillus aculeatus)中提取的果胶酶，诸如由novozymes公司以的名称销售的酶，是这种情况。
42.这些酶的作用减小了糖苷链的大小，然后可以在允许藻蓝蛋白保留的同时让糖原片段通过的条件下通过超滤将所述糖苷链去除。
43.诸位发明人已经发现，这些酶裂解条件释放多糖苷链和少量葡萄糖单体，并且因此特别适用于避免其他微生物(特别是对人或动物致病的生物体)的污染，当获得的藻蓝蛋白用作食物着色剂时，这是至关重要的。
44.根据特定的实施方案，除了α1
‑
4葡萄糖苷酶或聚半乳糖醛酸酶活性之外，还可以用α1
‑
6葡萄糖苷酶活性实现糖原的酶裂解。
45.然后，在所述方法中采用的酶可以是以下酶的混合物：具有α1
‑
4葡萄糖苷酶或聚半乳糖醛酸酶活性的第一酶和具有α1
‑
6葡萄糖苷酶活性的第二酶。
46.在以上所述的ph和温度条件下具有活性的α1
‑
6葡萄糖苷酶也是技术人员已知的。特别地，这些是已知水解普鲁兰多糖的α1
‑
6糖苷键(特别是已知去除淀粉分支)的普鲁兰酶。
47.这些通常是从细菌(特别是从芽孢杆菌属(bacillus))中提取的酶。us 6,074,854、us 5,817,498和wo 2009/075682描述了从bacillus deramificans或嗜酸普鲁兰芽孢杆菌(bacillus acidopullulyticus)提取的此类普鲁兰酶。可商购的普鲁兰酶也是已知的，特别是以“promozyme d2”(novozyme)、“novozym 26062”(novozyme)和“optimax l 1000”(dupont
‑
genencor)的名称。应当注意，现有技术中描述了普鲁兰酶/α
‑
淀粉酶混合物，但特别是用以从淀粉产生葡萄糖浆(us 2017/159090)。
48.根据本发明的另一个优选实施方案，所述酶具有α1
‑
4葡萄糖苷酶活性和α1
‑
6葡萄糖苷酶活性二者。
49.特别对于葡糖淀粉酶，是这种情况。这些也是从微生物中提取的酶，特别是从酵母或真菌(诸如糖化酵母(s.diastaticus)或黑曲霉(a.niger))中提取的酶。许多葡糖淀粉酶是根据现有技术已知的，描述于文献中并且特别是描述于专利申请诸如wo 2019/036721中。它们通常用于发酵方法，所述发酵方法用于生产供消费的酒精(啤酒，烈酒)或用于发酵用于生产生物乙醇的生物质。它们也被用作烘焙添加剂或用作食物补充剂。已知葡糖淀粉酶是可商购的，特别是以“amylase ag xxl”(novozymes)或“ag xxl”(eaton)的名称。
50.有利地，在根据本发明的方法中采用的酶是被授权用于食品工业的酶。
51.在此糖原裂解步骤中使用的最佳酶含量可以由本领域技术人员根据在上述温度和ph条件下使用的酶的活性来确定。
52.酶浓度通常在0.0001％与5％，优选0.0025％与1％，更优选0.005％与0.5％，甚至更优选在0.01％与0.25％之间，百分比表示为相对于粗悬浮液或粗悬浮液的总体积的酶溶液体积。
53.酶溶液的酶浓度通常在100至20,000单位/ml的范围内，酶活性通常归因于这些酶，如通过制造商所鉴定的。
54.α1
‑
6葡萄糖苷酶的使用降低了采用的α1
‑
4葡萄糖苷酶或聚半乳糖醛酸酶的量。总的酶浓度(α1
‑
4葡萄糖苷酶 α1
‑
6葡萄糖苷酶)通常在0.0001％与5％，优选0.0025％与1％，更优选0.005％与0.5％，甚至更优选在0.01％与0.25％之间，百分比表示为相对于粗悬浮液或粗悬浮液的总体积的酶溶液体积。
55.在单独的α1
‑
4葡萄糖苷酶或聚半乳糖醛酸酶或与α1
‑
6葡萄糖苷酶混合的情况下，或在具有α1
‑
4葡萄糖苷酶和α1
‑
6葡萄糖苷酶活性的酶的情况下，反应有利地进行少于48h，优选少于24h，更优选从5h至12h。
56.对于根据本发明的方法，并且更具体地，对于通过切向过滤来分离藻蓝蛋白的分离步骤，不需要实现将糖原完全消解为葡萄糖单体。多糖的部分消解及其还原为尺寸低于过滤截止阈值的低聚物足以从悬浮液或藻蓝蛋白溶液中去除糖原。
57.技术人员将知道如何确定适当的时间，以根据初始糖原含量、所用酶的量以及对所产生的藻蓝蛋白寻求的纯度来最佳地减少糖原的量。
58.通过酶消解减少糖原的实施可以通过使用能够降解这种多糖的微生物来关联或替代。技术人员将知道如何利用这些微生物的在粗提取物中产生和分泌能够消解糖原的酶、更特别是先前提及的酶的能力。技术人员将知道如何选择和利用这些微生物的代谢糖原或多糖降解所产生产物的能力。有利地，技术人员将知道如何利用这些微生物的限制不希望的或病原微生物的生长(特别是通过合成具有抗微生物活性的物质)的能力。
59.离体或体内进行糖原降解的优选条件是ph低于7，以及反应温度低于50℃，优选低于40℃，甚至更优选低于37℃。
60.有利地，离体或体内的糖原的降解是在小于或等于5，优选约4.5或4的ph下进行的。
61.由于其独特的生长和多糖降解特征，乳酸菌显现特别合适。其中，可以提及的是属于以下的细菌：乳杆菌属(lactobacillus)、片球菌属(pediococcus)、四联球菌属(tetragenococcus)、肉杆菌属(carnobacterium)、漫游球菌属(vagococcus)、明串珠菌属(leuconostoc)、魏斯氏菌属(weissella)、酒球菌属(oenococcus)、阿托波菌属(atopobium)、链球菌属(streptococcus)、肠球菌属(enterococcus)、乳球菌属(lactococcus)、气球菌属(aerococcus)、差异球菌属(alloiococcus)、蜜蜂球菌属(melissococcus)或双歧杆菌属(bifidobacterium)。
62.本发明还涉及一种藻蓝蛋白提取物，其糖原/藻蓝蛋白比率(以干重计)小于6，有利地小于4，优选小于3，更优选小于2.5，甚至更优选小于1。
63.根据第一实施方案，此藻蓝蛋白提取物是酶裂解后获得的粗藻蓝蛋白悬浮液。
64.这种经处理的粗悬浮液，也称为“酶处理的粗悬浮液”，在悬浮液中特别包含细胞裂解后释放的藻蓝蛋白、作为糖原的酶裂解产物的葡萄糖低聚物、和残余糖原以及由细胞裂解产生的不溶物。
65.根据本发明的第二实施方案，藻蓝蛋白提取物是在分离粗悬液和糖原的酶裂解之后获得的粗藻蓝蛋白溶液，此裂解已经在分离粗悬液之前或之后，或在分离(经酶处理的粗悬浮液的分离和/或对粗溶液进行酶反应)之前和之后进行。
66.此粗溶液特别包含细胞裂解后释放的藻蓝蛋白、作为糖原的酶裂解产物的葡萄糖低聚物、和残余糖原。这种经处理的粗溶液，也称为“酶处理的藻蓝蛋白粗溶液”，通常包含0.1至10g/l，更优选1至5g/l的藻蓝蛋白。
67.有利地，糖原与藻蓝蛋白的干重比率小于3，优选小于2.5。
68.根据本发明的经酶处理的粗溶液可以任选地根据在基本上考虑藻蓝蛋白的完整性的条件下进行的本领域常用方法通过去除一部分水来浓缩。在这种情况下，浓缩的经酶处理的粗溶液中的藻蓝蛋白含量将有利地为从10至50g/l。
69.根据另一个实施方案，藻蓝蛋白提取物是根据上述方法从酶处理的粗溶液中提取后分离的藻蓝蛋白。
70.对于分离的藻蓝蛋白，有利地，糖原与藻蓝蛋白的干重比率小于2，优选小于1。
71.根据另一个实施方案，藻蓝蛋白提取物是在根据上述方法纯化(特别地通过渗滤)分离的提取物之后获得的经纯化的藻蓝蛋白。
72.对于纯化的藻蓝蛋白，有利地，糖原与藻蓝蛋白的干重比率小于1，优选小于0.1。
73.分离的藻蓝蛋白和纯化的藻蓝蛋白二者均可能仍含有痕量的作为糖原酶裂解产物的葡萄糖低聚物。
74.获得的藻蓝蛋白具有90至400、优选至少120、更优选至少150的e10着色力。
75.对于酶处理的粗溶液，e10着色力有利地是从90至110。
76.对于分离的藻蓝蛋白，e10着色力有利地是从150至210。
77.对于纯化的藻蓝蛋白，着色力有利地是从210至400。
78.本发明还涉及一种生产微生物来源的藻蓝蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
79.(a)如上所述，在培养条件下培养产生藻蓝蛋白的微生物以产生包含多于30g/l干物质和基于干物质的至少4％藻蓝蛋白的发酵汁，
80.(b)细胞裂解以释放产生的藻蓝蛋白和糖原以获得如上所定义的粗悬浮液，
81.(c)分离所述粗悬浮液以回收包含藻蓝蛋白和糖原的粗溶液，并且然后任选地
82.(d)将藻蓝蛋白从所述粗溶液中分离，然后任选地
83.(e)对分离的藻蓝蛋白进行纯化，
84.其特征在于，糖原的酶裂解步骤是用上文定义的酶和条件下进行的，或通过微生物的降解进行的，所述酶裂解是对粗悬浮液和/或对粗溶液进行的。
85.有利地，获得的藻蓝蛋白是包含少于50％糖原的藻蓝蛋白。
86.培养方法是技术人员已知的，特别描述于专利申请wo 2017/050917、wo 2017/093345和wo 2018/178334中。
87.它们使获得具有超过30g/l干物质(可以达到超过100g/l干物质)的发酵汁(fermentation must)成为可能。
88.取决于发酵条件和培养的株系，至少4％的藻蓝蛋白含量可以达到高于10％。
89.本领域技术人员将知道如何根据他或她的工业藻蓝蛋白生产目标确定培养条件。
90.分离步骤(c)在现有技术中也是已知并且被描述过的，特别是通过通常的过滤方法，诸如微过滤，或离心然后过滤，特别是通过微过滤。
91.本发明还涉及获得的藻蓝蛋白作为着色剂，特别是作为食物着色剂的用途。它还涉及包含根据本发明的低糖原含量的藻蓝蛋白的食物，固体的或液体的，特别是饮料。
92.用作着色剂的藻蓝蛋白可以呈如上所定义的经酶处理的粗溶液、分离的藻蓝蛋白或纯化的藻蓝蛋白的形式。
93.实施例
94.实施例1
‑
酶裂解之前和之后c
‑
pc浓度的监测
95.用不同量的酶“pectinex”在ph 4和ph 7下进行对粗提取物的藻蓝蛋白浓度的监测。根据申请wo 2018/178334中所述的方法产生来自嗜硫原始红藻的粗藻蓝蛋白提取物。对于此监测，将酶和粗藻蓝蛋白提取物在0.22μm过滤器上过滤。在室温下进行消解。对于每个动力学点，测量可用于确定藻蓝蛋白浓度的吸光度读数，与在酶变性(95℃，5分钟)后用ysi 2700生化分析仪测量葡萄糖平行。
96.结果示于图1至4中。
97.这些结果显示在ph与酶浓度的不同条件之间，糖原的消解量不同。过量的酶可导致藻蓝蛋白的降解。
98.然而，我们可以看到，在ph＝4和0.05％“pectinex”下消解不到24h后，获得了显著的糖原裂解，同时基本上限制了藻蓝蛋白的降解。
99.实施例2
‑
监测粗藻蓝蛋白溶液中糖原消解的速率
100.用不同的酶：α淀粉酶(来自novozymes的ban 480l)、聚半乳糖醛酸酶(来自novozymes的pectinex ultra sp
‑
l)和葡糖淀粉酶(来自novozymes的淀粉酶ag xxl)，在ph 4和ph 7下进行粗溶液中的糖原消解速率的监测。
101.根据申请wo 2018/178334中所述的方法产生来自嗜硫原始红藻的粗藻蓝蛋白溶液。对于此监测，将酶和粗藻蓝蛋白溶液在0.22μm过滤器上过滤。在室温下进行消解。对于每个动力学点，在酶变性(95℃，5分钟)后用ysi2700生化分析仪进行葡萄糖测量。糖原消解的百分比是葡萄糖浓度与多糖完全水解后的葡萄糖浓度的比率。
102.结果示于图6(ph＝4)和图7(ph＝7)中。
103.实施例3
‑
进行或不进行酶裂解的情况下纯化的产物中的糖原含量
104.将未处理的或用0.25％(v/v)α1
‑
6葡萄糖苷酶消解12h、然后用0.1％(v/v)α1
‑
4聚半乳糖醛酸酶消解2h的粗藻蓝蛋白溶液在孔隙度为70kda的中空纤维膜上过滤，进行最终的渗滤步骤。
105.在每次过滤和/或过滤步骤结束时进行的各种测量显示，与pc相比，渗余物中的糖原浓度显著增加，直到达到不可忽略的浓度。因此，有必要去除所有或部分的这种糖原，以避免稀释最终产品的着色力，以及包含在90与400之间的e10着色力。
106.e10色值(10％e618 nm)指示在将粉末溶解于水溶液中之后在618nm处测量的色密度。
107.方案：
108.测量0.25克的样品并且将其溶解于调节至ph 6.0的100ml柠檬酸缓冲溶液中。然后将溶液用柠檬酸缓冲液稀释10倍，并且使用1cm厚的比色皿在618nm处测量吸光度。e10色值(10％e618 nm)＝吸光度(618nm处)x 100/0.25克。
[0109][0110]
实施例4
‑
进行或不进行酶裂解的情况下的跨膜压力
[0111]
根据专利申请wo 2018/178334中的方法产生的来自嗜硫原始红藻的粗藻蓝蛋白提取物是在0.05μm pes中空纤维膜上澄清的。以下结果呈现了相同体积的250ml粗提取物在有或没有用“pectinex”消解(0.05％，5.5h，在室温和ph＝4下)的情况下的过滤参数监测。
[0112]
结果示于图5中。它们证明了糖原消解对粗提取物的微过滤的影响。可见，由于跨膜流量的增加，对于过滤给定的体积，消解的样品所需的时间仅是未消解的样品的约两倍。
[0113]
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