可提升生物体对金黄色葡萄球菌感染的抵御能力的母乳低聚糖的制作方法

1.本发明涉及食品和药品领域，特别涉及母乳低聚糖及其用途。


背景技术：

2.在上个千年，已有医学文献记载，未经母乳喂养的婴儿相对于母乳喂养的婴儿，有较高的疾病率和死亡率。母乳不仅为婴儿提供所需营养，母乳中的活性成分更为婴儿的肠道发育和免疫力完善提供保障。母乳喂养的婴儿与配方奶喂养的婴儿相比，肠道菌群中有益菌的相对丰度更高，特别是双歧杆菌和乳酸菌。
3.母乳通过菌群的传递，加上母乳低聚糖和母乳中的细胞因子等活性成分，为新生儿建立起健康的肠道菌群。婴儿每天通过母乳摄入107‑
108个细菌，包括乳酸菌和双歧杆菌。这些菌通过母乳直接传递给婴儿，部分可在婴儿肠道定植，促进生命早期肠道菌群的建立。婴儿肠道菌群的建立，对其肠道的发育，以及对健康和免疫系统有着短期，甚至终生的影响。
4.母乳低聚糖(human milk oligosaccharides，简称hmos)属于母乳中除乳糖和脂肪外，含量第三丰富的物质。其总含量在泌乳期的各个阶段有变化，在成熟乳中大约是12
‑
14g/l，而初乳中大约是20
‑
24g/l。每一种母乳低聚糖的结构在还原端都有一个乳糖，大部分以聚乳糖胺作为结构主链，并在链端含有岩藻糖、唾液酸或二者均有。母乳低聚糖主要由三大类组成：(1)岩藻糖基类低聚糖，以2
’‑
岩藻糖基低聚糖和3
‑
岩藻糖基低聚糖为代表性物质；(2)唾液酸基类低聚糖，以3
’‑
唾液酸基乳糖和6
’‑
唾液酸基乳糖为代表性物质；(3)不含岩藻糖基或唾液酸基的核心糖链结构形成的低聚糖，以乳糖
‑
n
‑
四糖和乳糖
‑
n
‑
新四糖为代表性物质。
5.hmos的存在与含量存在个体差异，并与哺乳母亲的路易斯分泌型组成有关。由于婴幼儿配方粉的原料通常是牛乳，而牛乳中通常不含或含有很少这类低聚糖物质，hmos便成为了婴幼儿配方粉想要更加接近母乳成分所必须跨越的一道鸿沟。
6.上世纪90年代，作为在大部分母乳中均含有的hmo，2
‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)被发现可有效地减轻大肠杆菌中稳定毒素的毒性；到了2003年，该低聚糖被报道可抑制弯曲空肠杆菌的附着和感染。随后，母乳低聚糖的三大主要功能被逐步报道和发现：(1)抑制特定病菌的附着和感染；(2)作为益生元，促进肠道共生系统里面细菌的生长；(3)直接减缓粘膜在有毒刺激下的炎症反应。使用了2
’‑
fl的首个临床干预试验证实了，在低卡路里配方中加入这个特定成分不仅安全，还可以让配方奶喂养的婴儿生长速率与母乳喂养的婴儿具有可比性。2
’‑
fl也被用作成年人的营养补充剂，缓解肠道应激性综合症或炎症性肠病，或被用作益生元维持肠道菌群平衡。
7.肠道菌群是人体肠道微生态系统的重要组成物质，对人类健康有重要作用，如可提供必需营养素，生成维生素k，辅助消化过程与促进血管生成和肠道神经作用。益生元被视为改善机体健康的微生态管理工具，可改变、调节和重组已经存在的肠道菌群。
8.目前在婴幼儿配方粉、辅食及营养补充剂领域，需要有缓解婴幼儿肠道不适及提升自身抵御致病菌(如金黄色葡萄球菌)感染能力的解决方案。同时，在3岁以上儿童、青少年及成人领域，也需要缓解肠道不适及提升自身抵御致病菌(如金黄色葡萄球菌)感染能力的解决方案。
9.秀丽隐杆线虫(c.elegans)作为一种模型生物，在临床前研究与评估中有较好的应用前景。它具有较短的生命周期(21天)，可复制和再生性较强，操作简便、透明且易于培养。它的基因组已全部被测序，并且有四分之一的基因与人类基因组是同源的。对线虫的基因进行编辑从而产生的基因突变的线虫生物体，可用作基因分析的实验手段。目前线虫在欧洲的立法中并不被认为是一种动物。它被广泛用作活体外的测定，比如转录组学、蛋白组学、代谢组学等。作为模式生物，它也常常被作为原料评估的第一个步骤，在功效原料的设计、体外酶或细胞实验、小鼠模型和临床实验前，往往用线虫作为高通量的手段来筛选测试原料的一些特性。
10.金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus,s.aureus)是一种革兰氏阳性菌，属于葡萄球菌属，是常见的食源性致病微生物。它广泛存在于自然环境中，在适当条件下，能产生肠毒素并能引起食物中毒，引发过多起由金黄色葡萄球菌导致的食源性微生物食物中毒事件。人体在受到金黄色葡萄球菌感染后，可能会出现恶心、呕吐、头晕等常见的食物中毒症状，并可能出现肠炎、肺炎、皮肤感染、伤口感染溃烂、脑膜炎等症状。


技术实现要素：

11.本案发明人创造性地发现，一些母乳低聚糖可提升生物体抵抗金黄色葡萄球菌感染的能力，从而提供了下述发明：
12.在一个方面，本发明提供了母乳低聚糖在制备营养组合物或药物中的用途，所述营养组合物或药物用于预防和/或治疗个体的与金黄色葡萄球菌感染相关的疾病，或用于缓解个体的与金黄色葡萄球菌感染相关的不适，或用于提升个体对金黄色葡萄球菌感染的抵御能力，或用于提升个体先天免疫和/或抗衰老；所述母乳低聚糖选自：2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
‑
岩藻糖基乳糖、乳糖
‑
n
‑
四糖、6
’‑
唾液酸基乳糖及其任意组合，以及2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
‑
岩藻糖基乳糖、乳糖
‑
n
‑
四糖、6
’‑
唾液酸基乳糖中的一种或多种与3
’‑
唾液酸基乳糖形成的组合。
13.在一个方面，本发明提供了一种包含母乳低聚糖的营养组合物或药物，所述母乳低聚糖选自：2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
‑
岩藻糖基乳糖、乳糖
‑
n
‑
四糖、6
’‑
唾液酸基乳糖及其任意组合，以及2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
‑
岩藻糖基乳糖、乳糖
‑
n
‑
四糖、6
’‑
唾液酸基乳糖中的一种或多种与3
’‑
唾液酸基乳糖形成的组合；当所述营养组合物或药物为液体时，所述母乳低聚糖在所述营养组合物或药物中的含量为0.03
‑
12g/l，优选为0.03
‑
6g/l；当所述营养组合物或药物为固体(例如粉剂)时，所述母乳低聚糖在所述营养组合物或药物中的含量为0.02
‑
9.09g/100g，优选为0.02
‑
4.55g/100g。
14.在某些实施方案中，所述营养组合物或药物是固体(例如粉剂)，则可以遵照其常规使用剂量(例如所述营养组合物或药物的说明书或包装上推荐的剂量)，将所述营养组合物或药物分散或溶解于介质中，得到一定浓度的液体。示例性的介质包括但不限于水。
15.在某些实施方案中，所述营养组合物为乳粉，例如配方乳粉，在某些实施方案中，
可按照所述营养组合物的包装上推荐的水/乳粉比例进行冲泡。冲泡后得到的配方乳中，母乳低聚糖(例如2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
‑
岩藻糖基乳糖、乳糖
‑
n
‑
四糖、6
’‑
唾液酸基乳糖或3
’‑
唾液酸基乳糖)的含量接近于所述母乳低聚糖在母乳中的含量。
16.在某些实施方案中，所述营养组合物或药物为液体，所述母乳低聚糖在所述营养组合物或药物中的含量为0.03
‑
0.05g/l、0.05
‑
0.1g/l、0.1
‑
0.5g/l、0.5
‑
1g/l、1
‑
2g/l、2
‑
3g/l、3
‑
4g/l、4
‑
5g/l、5
‑
6g/l、6
‑
7g/l、7
‑
8g/l、8
‑
9g/l、9
‑
10g/l、10
‑
11g/l或11
‑
12g/l。
17.在某些实施方案中，所述营养组合物或药物为固体(例如粉剂)，所述母乳低聚糖在所述营养组合物或药物中的含量为0.02
‑
0.05g/100g、0.05
‑
0.07g/100g、0.07
‑
0.1g/100g、0.1
‑
0.5g/100g、0.5
‑
1g/100g、1
‑
2g/100g、2
‑
3g/100g、3
‑
4g/100g、4
‑
5g/100g、5
‑
6g/100g、6
‑
7g/100g、7
‑
8g/100g、8
‑
9g/100g或9
‑
9.09g/100g。
18.在某些实施方案中，所述营养组合物或药物用于预防和/或治疗个体的与金黄色葡萄球菌感染相关的疾病，或用于缓解个体的与金黄色葡萄球菌感染相关的不适；或用于提升个体对金黄色葡萄球菌感染的抵御能力，或用于提升个体先天免疫和/或抗衰老。
19.在一个方面，本发明提供了一种预防和/或治疗个体的与金黄色葡萄球菌感染相关的疾病、或缓解个体的与金黄色葡萄球菌感染相关的不适、或提升个体对金黄色葡萄球菌感染的抵御能力、或提升个体先天免疫和/或抗衰老的方法，所述方法包括将母乳低聚糖或本发明的营养组合物或药物施予有此需要的个体，所述母乳低聚糖选自：2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
‑
岩藻糖基乳糖、乳糖
‑
n
‑
四糖、6
’‑
唾液酸基乳糖及其任意组合，以及2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
‑
岩藻糖基乳糖、乳糖
‑
n
‑
四糖、6
’‑
唾液酸基乳糖中的一种或多种与3
’‑
唾液酸基乳糖形成的组合。
20.本发明中，2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fucosyllactose，2
’‑
fl或2
‑
fl)，为岩藻糖与乳糖形成的三糖结构，是岩藻糖基类低聚糖的代表性物质。市售该物质通常为经微生物发酵法制备，与人乳中发现的2
’‑
岩藻糖基乳糖具有相同结构。
[0021]3‑
岩藻糖基乳糖(3
‑
fucosyllactose，3
‑
fl)，为岩藻糖与乳糖形成的三糖结构，与2
’‑
岩藻糖基乳糖互为同分异构体，是岩藻糖基类低聚糖的代表性物质。该物质可经微生物发酵法制备，与人乳中发现的3
‑
岩藻糖基乳糖具有相同结构。
[0022]
乳糖
‑
n
‑
四糖(lacto
‑
n
‑
tetraose，lnt)，为乳糖与四糖形成的六糖结构，是以核心糖链为基础结构，且不含岩藻糖基或唾液酸基的低聚糖的代表性物质。该物质可经微生物发酵法制备，且与人乳中发现的乳糖
‑
n
‑
四糖具有相同结构。
[0023]3’‑
唾液酸基乳糖(3
’‑
sialyllactose，3
’‑
sl)，为唾液酸与乳糖形成的三糖结构，与6
’‑
唾液酸基乳糖互为同分异构体，是唾液酸基类低聚糖的代表性物质。该物质经微生物发酵法制备，与人乳中发现的3
’‑
唾液酸基乳糖具有相同结构。
[0024]6’‑
唾液酸基乳糖(6
’‑
sialyllactose，6
’‑
sl)，为唾液酸与乳糖形成的三糖结构，与3
’‑
唾液酸基乳糖互为同分异构体，是唾液酸基类低聚糖的代表性物质。该物质可经微生物发酵法制备，与人乳中发现的6
’‑
唾液酸基乳糖具有相同结构。
[0025]
在本发明提供的用途、或疾病的预防和/或治疗方法、或缓解不适、或提升抵御能力的方法中，母乳低聚糖可以0.012
‑
12g/天的剂量被施用。
[0026]
在某些实施方案中，所述母乳低聚糖以0.012
‑
0.03g/天、0.03
‑
0.04g/天、0.04
‑
0.1g/天、0.1
‑
0.2g/天、0.2
‑
0.225g/天、0.225
‑
0.3g/天、0.3
‑
1g/天、1
‑
2g/天、2
‑
2.4g/天、
2.4
‑
3g/天、3
‑
4g/天、4
‑
4.5g/天、4.5
‑
4.8g/天、4.8
‑
5g/天、5
‑
6g/天、6
‑
9g/天或9
‑
12g/天的剂量被施用。在某些实施方案中，所述剂量的适用群体为人(例如婴儿或幼儿，例如0
‑
6个月的婴儿)。
[0027]
可选地，所述母乳低聚糖存在于配方乳粉中。可按照配方乳粉包装上推荐的水/乳粉比例冲泡配方乳粉，得到配方乳，并参考个体(例如0
‑
6个月的婴儿)的摄乳量(例如400
‑
1000ml/天，例如400
‑
750ml/天或750
‑
1000ml/天)，将一定量的配方乳施予所述个体。
[0028]
在一个方面，本发明提供了一种降低金黄色葡萄球菌感染能力的方法，所述方法包括以有效量的母乳低聚糖与金黄色葡萄球菌接触，所述母乳低聚糖选自：2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
‑
岩藻糖基乳糖、乳糖
‑
n
‑
四糖、6
’‑
唾液酸基乳糖及其任意组合，以及2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
‑
岩藻糖基乳糖、乳糖
‑
n
‑
四糖、6
’‑
唾液酸基乳糖中的一种或多种与3
’‑
唾液酸基乳糖形成的组合。
[0029]
在某些实施方案中，所述接触在体内进行，以降低个体体内的金黄色葡萄球菌的感染能力。在某些实施方案中，所述接触包括将所述母乳低聚糖施予有此需要的个体。在某些实施方案中，所述个体患有或疑似具有与金黄色葡萄球菌感染相关的疾病，或者处于所述疾病的风险中。在某些实施方案中，所述金黄色葡萄球菌位于所述个体的肠道、肺、皮肤、血液、耳、鼻、脐带和/或脑。
[0030]
在某些实施方案中，所述接触在体外(例如细胞系或者来自个体的细胞)进行，以降低体外细胞中金黄色葡萄球菌的感染能力。
[0031]
在某些实施方案中，所述有效量为0.012
‑
12g/天，例如0.012
‑
0.03g/天、0.03
‑
0.04g/天、0.04
‑
0.1g/天、0.1
‑
0.2g/天、0.2
‑
0.225g/天、0.225
‑
0.3g/天、0.3
‑
1g/天、1
‑
2g/天、2
‑
2.4g/天、2.4
‑
3g/天、3
‑
4g/天、4
‑
4.5g/天、4.5
‑
4.8g/天、4.8
‑
5g/天、5
‑
6g/天、6
‑
9g/天或9
‑
12g/天。在某些实施方案中，所述有效量的适用群体为人(例如婴儿或幼儿，例如0
‑
6个月的婴儿)。
[0032]
可选地，所述母乳低聚糖存在于配方乳粉中。可按照配方乳粉包装上推荐的水/乳粉比例冲泡配方乳粉，得到配方乳，并参考个体(例如0
‑
6个月的婴儿)的摄乳量(例如400
‑
1000ml/天，例如400
‑
750ml/天或750
‑
1000ml/天)，将一定量的配方乳施予所述个体，以达到上述有效量。
[0033]
在某些实施方案中，所述有效量为至少1.5mg/ml(例如1.5mg/ml
‑
10mg/ml、10mg/ml
‑
30mg/ml或至少30mg/ml)。在某些实施方案中，所述有效量的适用群体为线虫(例如秀丽隐杆线虫)。
[0034]
在某些实施方案中，所述方法不用于预防、治疗或诊断疾病的目的(例如用于科学研究)。
[0035]
本发明中，“营养组合物”指的是营养制剂和营养产品，如营养补充剂、功能食品、饮料产品、膳食替代品或食品添加剂。这类营养组合物可以是营养完全的，例如可以包括维生素、矿物质、碳水化合物、蛋白质和脂肪等，从而可以用作唯一的营养来源，提供基本上所有日常必需量的维生素、矿物质、碳水化合物、脂肪、蛋白质等。因此，可以以例如适于口服或管饲的营养组合物形式如完全配方膳食来提供母乳低聚糖。此外，还可以作为膳食的一部分，即营养补充剂来提供母乳低聚糖。本发明中，当所述营养组合物为食品时，其并非用于预防和/或治疗疾病的用途。
[0036]
在某些实施方案中，以上发明所涉及的营养组合物为配方食品，例如婴幼儿配方食品(例如婴儿配方食品、较大婴儿配方食品、幼儿配方食品、特殊医学用途婴儿配方食品)。
[0037]
本发明中，“配方食品”指的是含有可能作为补充、主要或唯一的营养源的足够营养物(例如蛋白质、碳水化合物、脂类、维生素、矿物质和电解质)的为婴儿、幼儿、儿童、成人或其组合设计的营养组合物。
[0038]
本发明中，“婴儿(infant)”指的是不超过大约12月龄的人，包括0
‑
约4个月大的婴儿、约4
‑
约8个月大的婴儿、约8
‑
约12个月大的婴儿；“较大婴儿(older infant)”指的是约6
‑
约12月龄的人；“幼儿(young children)”指的是12月龄以上、3岁以内的人；“儿童”指的是3岁以上、12岁以下的人。
[0039]
本发明中，“婴儿配方食品(infant formula)”指的是适合于婴儿食用的人乳替换或替代品，其能量和营养成分能够满足0
‑
6月龄婴儿的正常营养需要。
[0040]
本发明中，“较大婴儿配方食品”指的是适于7
‑
12月龄婴儿食用的配方食品，其营养成分能满足正常较大婴儿的部分营养需要，可作为人乳替换或替代品。
[0041]
本发明中，“幼儿配方食品”指的是适于13
‑
36月龄幼儿食用的配方食品，其营养成分能满足正常幼儿的部分营养需要，可作为人乳替换或替代品。
[0042]
本发明中，“特殊医学用途婴儿配方食品”指的是针对患有特殊紊乱、疾病或医疗状况等特殊医学状况婴儿的营养需求而设计制成的配方食品；在医生或临床营养师的指导下，单独食用或与其它食物配合食用时，其能量和营养成分能够满足0月龄～6月龄特殊医学状况婴儿的生长发育需求。
[0043]
在某些实施方案中，除了母乳低聚糖之外，所述婴幼儿配方食品(例如婴儿配方食品、较大婴儿配方食品、幼儿配方食品或特殊医学用途婴儿配方食品)还可以包含以下成分或其任意组合：作为能量来源的蛋白质(例如乳蛋白、大豆蛋白、α
‑
乳清蛋白、β
‑
酪蛋白)、脂肪(例如亚油酸、α
‑
亚麻酸、1,3
‑
二油酸
‑2‑
棕榈酸甘油三酯)和碳水化合物(例如乳糖、乳糖和葡萄糖聚合物)，维生素(例如维生素a、维生素d、维生素k、维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素b12、烟酸、叶酸、维生素c、生物素、胆碱)，矿物质(例如钠、钾、铜、镁、铁、锌、锰、钙、磷、碘、氯、硒)；任选地，所述婴幼儿配方食品还可以包含膳食纤维、核苷酸、肌醇、牛磺酸、左旋肉碱、二十二碳六烯酸、二十碳四烯酸或其任意组合。
[0044]
在某些实施方案中，以上发明所涉及的营养组合物(例如配方食品)是仅用物理方法生产加工制成的液态或粉状产品。
[0045]
在某些实施方案中，以上发明所涉及的营养组合物是婴幼儿辅助食品。
[0046]
在某些实施方案中，以上发明所涉及的营养组合物为乳制品(例如1段配方乳粉、2段配方乳粉、3段配方乳粉、发酵乳)。
[0047]
在某些实施方案中，以上发明所涉及的营养组合物为营养补充剂。所述营养补充剂可以是丸剂、胶囊、片剂、颗粒剂、液体制剂或其他适于口服或管饲的形式。在某些实施方案中，所述营养补充剂还含有一种或多种载体或赋形剂。适当的载体或赋形剂可以选自：糖(例如乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇)、纤维素制品(例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮)、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐(例如海藻酸钠)、水。
[0048]
在某些实施方案中，以上发明所涉及的营养组合物或药物中，所述母乳低聚糖为可预防和/或治疗个体的与金黄色葡萄球菌感染相关的疾病、或缓解个体的与金黄色葡萄球菌感染相关的不适、或提升个体对金黄色葡萄球菌感染的抵御能力、或提升个体先天免疫和/或抗衰老的单一活性成分。在某些实施方案中，所述营养组合物或药物中还含有可用于预防和/或治疗个体的与金黄色葡萄球菌感染相关的疾病、或缓解个体的与金黄色葡萄球菌感染相关的不适、或提升个体对金黄色葡萄球菌感染的抵御能力、或提升个体先天免疫和/或抗衰老的其他活性成分。
[0049]
在某些实施方案中，以上发明所涉及的药物可以为固体、半固体、凝胶或液体形式的制剂，例如片剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂、溶液剂、贮库剂(depository)、凝胶剂和注射剂。适于口服给予的制剂可呈现为离散单元，例如胶囊、片剂、糖锭。其它制剂包括：水性液体或非水性液体中的混悬液，例如糖浆剂、酏剂、凝胶剂或乳剂。在某些实施方案中，所述药物还含有一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。适当的载体或赋形剂可以选自：糖(例如乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇)、纤维素制品(例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮)、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐(例如海藻酸钠)、水。
[0050]
在某些实施方案中，以上发明所涉及的母乳低聚糖、营养组合物或药物可以通过肠内途径给予至个体，例如，以粉末、粉末饮料、液体、胶囊或丸剂的形式口服。在某些实施方案中，以单一剂量将母乳低聚糖给予至个体，而在其它实施方案中，在特定时段给予多剂量。例如，在某些实施方案中，每天给予母乳低聚糖1
‑
5次、5
‑
10次或10次以上。在某些实施方案中，给予持续约1周、约2周、约3周、约4周、约1月、约5周、约6周、约2月、约3月、约4月、约5月、约6月或约1年时间。在某些实施方案中，持续给予直至个体中的临床症状改善。
[0051]
本发明中，2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
‑
岩藻糖基乳糖、乳糖
‑
n
‑
四糖、6
’‑
唾液酸基乳糖的任意组合可以选自以下组合：
[0052]
(1)由2
’‑
岩藻糖基乳糖和3
‑
岩藻糖基乳糖组成的组合；
[0053]
(2)由2
’‑
岩藻糖基乳糖和乳糖
‑
n
‑
四糖组成的组合；
[0054]
(3)由2
’‑
岩藻糖基乳糖和6
’‑
唾液酸基乳糖组成的组合；
[0055]
(4)由2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
‑
岩藻糖基乳糖和乳糖
‑
n
‑
四糖组成的组合；
[0056]
(5)由2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
‑
岩藻糖基乳糖和6
’‑
唾液酸基乳糖组成的组合；
[0057]
(6)由2
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖
‑
n
‑
四糖和6
’‑
唾液酸基乳糖组成的组合；
[0058]
(7)由3
‑
岩藻糖基乳糖和乳糖
‑
n
‑
四糖组成的组合；
[0059]
(8)由3
‑
岩藻糖基乳糖和6
’‑
唾液酸基乳糖组成的组合；
[0060]
(9)由3
‑
岩藻糖基乳糖、乳糖
‑
n
‑
四糖和6
’‑
唾液酸基乳糖组成的组合；
[0061]
(10)由乳糖
‑
n
‑
四糖和6
’‑
唾液酸基乳糖组成的组合；以及
[0062]
(11)由2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
‑
岩藻糖基乳糖、乳糖
‑
n
‑
四糖和6
’‑
唾液酸基乳糖组成的组合。
[0063]
本发明中，2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
‑
岩藻糖基乳糖、乳糖
‑
n
‑
四糖、6
’‑
唾液酸基乳糖中的一种或多种与3
’‑
唾液酸基乳糖形成的组合可以选自以上(1)
‑
(11)中的任一组合与3
’‑
唾液酸基乳糖形成的组合。
[0064]
在某些实施方案中，所述母乳低聚糖是由2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)、3
‑
岩藻糖基
乳糖(3
‑
fl)、乳糖
‑
n
‑
四糖(lnt)、3
’‑
唾液酸基乳糖(3
’‑
sl)和6
’‑
唾液酸基乳糖(6
’‑
sl)中的至少四种组成的组合，各母乳低聚糖的比例为2
’‑
fl:3
‑
fl:lnt:3
’‑
sl:6
’‑
sl＝(1％
‑
60％):(0
‑
50％):(5％
‑
40％):(2％
‑
85％):(0
‑
12％)，优选为：(2％
‑
55％):(0
‑
44％):(10％
‑
35％):(5％
‑
80％):(0
‑
10％)，更优选为：(2％
‑
53％):(0
‑
41％):(10％
‑
32％):(5％
‑
80％):(0
‑
8％)，进一步优选为(5％
‑
53％):(21％
‑
41％):(16％
‑
32％):(5％
‑
22％):(0
‑
5％)。在这些实施方案中，3
’‑
sl在组合物中的含量比例优选大于5％。
[0065]
在某些实施方案中，所述母乳低聚糖是由2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)、3
‑
岩藻糖基乳糖(3
‑
fl)、乳糖
‑
n
‑
四糖(lnt)和3
’‑
唾液酸基乳糖(3
’‑
sl)组成的组合，各母乳低聚糖的比例为2
’‑
fl:3
‑
fl:lnt:3
’‑
sl＝(1％
‑
60％):(1％
‑
50％):(5％
‑
40％):(2％
‑
90％)，优选为(1％
‑
56％):(1％
‑
45％):(10％
‑
35％):(5％
‑
88％)，更优选为(2％
‑
56％):(1％
‑
41％):(11％
‑
32％):(5％
‑
86％)，进一步优选为(5％
‑
56％):(22％
‑
41％):(17％
‑
32％):(5％
‑
22％)。在这些实施方案中，3
’‑
sl在组合物中的含量比例优选大于5％。
[0066]
在某些实施方案中，所述母乳低聚糖是由2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)、乳糖
‑
n
‑
四糖(lnt)、3
’‑
唾液酸基乳糖(3
’‑
sl)和6
’‑
唾液酸基乳糖(6
’‑
sl)组成的组合，各母乳低聚糖的比例为2
’‑
fl:lnt:3
’‑
sl:6
’‑
sl＝(1％
‑
75％):(5％
‑
65％):(1％
‑
85％):(1％
‑
15％)，优选为(2％
‑
70％):(10％
‑
60％):(2％
‑
80％):(1％
‑
10％)，更优选为(2％
‑
67％):(10％
‑
54％):(6％
‑
80％):(1％
‑
8％)，进一步优选为(9％
‑
67％):(20％
‑
54％):(6％
‑
37％):(1％
‑
6％)。在这些实施方案中，3
’‑
sl在组合物中的含量比例优选大于5％。
[0067]
在某些实施方案中，所述母乳低聚糖是由2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)、3
‑
岩藻糖基乳糖(3
‑
fl)、乳糖
‑
n
‑
四糖(lnt)、3
’‑
唾液酸基乳糖(3
’‑
sl)和6
’‑
唾液酸基乳糖(6
’‑
sl)组成的组合，五种母乳低聚糖的比例为2
’‑
fl:3
‑
fl:lnt:3
’‑
sl:6
’‑
sl＝(5％
‑
53％):(21％
‑
44％):(16％
‑
32％):(5％
‑
22％):(0
‑
5％)，其中6
’‑
sl的比例大于0。
[0068]
在某些实施方案中，五种母乳低聚糖的比例为2
’‑
fl:3
‑
fl:lnt:3
’‑
sl:6
’‑
sl＝(5％
‑
10％、10％
‑
20％、20％
‑
30％、30％
‑
40％、40％
‑
50％或50％
‑
53％):(21％
‑
25％、25％
‑
30％、30％
‑
35％、35％
‑
40％或40％
‑
44％):(16％
‑
20％、20％
‑
24％、24％
‑
30％或30％
‑
32％):(5％
‑
8％、8％
‑
12％、12％
‑
16％、16％
‑
18％或18％
‑
22％):(0
‑
1％、1％
‑
2％、2％
‑
3％、3％
‑
4％或4％
‑
5％)。
[0069]
在某些实施方案中，五种母乳低聚糖的比例为2
’‑
fl:3
‑
fl:lnt:3
’‑
sl:6
’‑
sl＝(50％
‑
53％):(21％
‑
25％):(16％
‑
20％):(5％
‑
8％):(4％
‑
5％)。
[0070]
在某些实施方案中，五种母乳低聚糖的比例为2
’‑
fl:3
‑
fl:lnt:3
’‑
sl:6
’‑
sl＝53％:21％:16％:5％:5％。
[0071]
本发明中，当所述母乳低聚糖以2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
‑
岩藻糖基乳糖、乳糖
‑
n
‑
四糖或6
’‑
唾液酸基乳糖的单体形式存在时，母乳低聚糖的含量或剂量指的是所述单体的含量或剂量。当所述母乳低聚糖以组合形式存在时，母乳低聚糖的含量或剂量指的是所述组合的含量或剂量。
[0072]
本发明中，所述与金黄色葡萄球菌感染相关的疾病或不适包括但不限于：
[0073]
(1)金黄色葡萄球菌引起的食物中毒，包括恶心、呕吐、头晕等；
[0074]
(2)金黄色葡萄球菌感染后引起的肠炎、肺炎等疾病；
[0075]
(3)金黄色葡萄球菌感染后引起的皮肤感染、伤口溃烂等；
[0076]
(4)金黄色葡萄球菌感染后引起的脑膜炎等。
[0077]
本发明中，“个体”可以为人或非人动物。示例性的人个体包括患有疾病或不适(例如本文所述的疾病或不适)的人个体(称为患者)或正常个体。“非人动物”包括所有脊椎动物和非脊椎动物，例如非哺乳动物(例如鸟类、两栖动物、爬行动物)和哺乳动物，例如非人灵长类、家畜和/或驯化动物(例如绵羊、犬、猫、奶牛、猪等)。本发明中，“个体”还可以是线虫，例如秀丽隐杆线虫。
[0078]
在某些实施方案中，所述个体为婴儿、幼儿、儿童或成人(例如60岁以上的成人)。
[0079]
本发明中，“抗衰老”包括延缓金黄色葡萄球菌感染导致的衰老甚至死亡现象，亦即，所述“抗衰老”包括延长寿命。
[0080]
有益效果
[0081]
发明人发现，2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
‑
岩藻糖基乳糖、乳糖
‑
n
‑
四糖、6
’‑
唾液酸基乳糖可以升高受金黄色葡萄球菌感染后线虫的存活率，证明这些母乳低聚糖可用于提高机体应对或抵抗金黄色葡萄球菌感染的能力、或提升个体先天免疫和/或抗衰老。特别地，6
’‑
唾液酸基乳糖和3
‑
岩藻糖基乳糖保护效果明显，具有在较低浓度发挥作用的潜力。此外，这些母乳低聚糖的组合(例如2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
‑
岩藻糖基乳糖、乳糖
‑
n
‑
四糖、6
’‑
唾液酸基乳糖与3
’‑
唾液酸基乳糖的组合)还表现出一定的协同效应。
[0082]
这些母乳低聚糖可用于预防或治疗与金黄色葡萄球菌感染相关的疾病，或用于缓解与金黄色葡萄球菌感染相关的不适，例如食物中毒、肠炎、肺炎、皮肤感染或伤口溃烂、脑膜炎等，或用于提升个体先天免疫和/或抗衰老，可添加在婴幼儿食品(包括婴幼儿配方乳粉、辅食、营养补充剂)，以及儿童或成人的营养补充剂或食品中，以提升个体对金黄色葡萄球菌感染的抵御能力，或提升个体先天免疫和/或抗衰老，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0083]
图1显示不同剂量的母乳低聚糖2
’‑
fl对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时存活率的影响。图中各组别在感染阶段添加的干预物(hmo)情况分别与培养阶段相同。
[0084]
图2显示一定剂量的母乳低聚糖2
’‑
fl对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时存活率的影响。图中各组别在感染阶段添加的干预物(hmo)情况分别与培养阶段相同。
[0085]
图3显示多个不同剂量的母乳低聚糖2
’‑
fl对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时第三天的存活率的影响。
[0086]
图4线虫模型中使用金黄色葡萄球菌进行的致病菌存活率测试，2
’‑
fl受试浓度为15mg/ml。图中各组别在感染阶段添加的干预物(hmo)情况分别与培养阶段相同。
[0087]
图5显示不同剂量的母乳低聚糖3
‑
fl对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时存活率的影响。图中各组别在感染阶段添加的干预物(hmo)情况分别与培养阶段相同。
[0088]
图6显示不同剂量的母乳低聚糖2
’‑
fl和3
‑
fl对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时第三天的存活率的不同影响比较。
[0089]
图7显示不同剂量的母乳低聚糖lnt对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时存活率的影响。图中各组别在感染阶段添加的干预物(hmo)情况分别与培养阶段相同。
[0090]
图8显示几个不同剂量的母乳低聚糖lnt对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时第三天的存活率的影响。
[0091]
图9显示不同剂量的母乳低聚糖6
’‑
sl对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时存活率的影响。图中各组别在感染阶段添加的干预物(hmo)情况分别与培养阶段相同。
[0092]
图10显示几个不同剂量的母乳低聚糖6
’‑
sl对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时第三天的存活率的影响。
[0093]
图11显示不同剂量的母乳低聚糖3
’‑
sl对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时存活率的影响。图中各组别在感染阶段添加的干预物(hmo)情况分别与培养阶段相同。
[0094]
图12显示不同剂量的母乳低聚糖3
’‑
sl对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时第三天的存活率的影响。
[0095]
图13显示不同剂量的母乳低聚糖组合物对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时存活率的影响。图中各组别在感染阶段添加的干预物(hmo)情况分别与培养阶段相同。
[0096]
图14显示不同剂量的母乳低聚糖组合物对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时第三天的存活率的影响。
[0097]
图15显示10mg/ml的母乳低聚糖组合物和五种母乳低聚糖单体对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时第三天的存活率的不同影响比较。
[0098]
图16显示30mg/ml的母乳低聚糖组合物和五种母乳低聚糖单体对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时第三天的存活率的不同影响比较。
[0099]
图17显示30mg/ml的母乳低聚糖组合物和五种母乳低聚糖单体对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时第五天的存活率的不同影响比较。
[0100]
图18线虫模型中使用金黄色葡萄球菌进行的致病菌存活率测试，组合物a受试浓度为8和15mg/ml。图中各组别在感染阶段添加的干预物(hmo)情况分别与培养阶段相同。
[0101]
图19线虫模型中使用金黄色葡萄球菌进行的致病菌存活率测试，组合物g受试浓度为8和15mg/ml。图中各组别在感染阶段添加的干预物(hmo)情况分别与培养阶段相同。
[0102]
图20线虫模型中使用金黄色葡萄球菌进行的致病菌存活率测试，组合物h受试浓度为8和15mg/ml。图中各组别在感染阶段添加的干预物(hmo)情况分别与培养阶段相同。
[0103]
图21线虫模型中使用金黄色葡萄球菌进行的致病菌存活率测试，组合物j受试浓度为8和15mg/ml。图中各组别在感染阶段添加的干预物(hmo)情况分别与培养阶段相同。
[0104]
图22感染5天后，线虫存活率的百分比。线虫与不同剂量下(8和15mg/ml)的hmo组合物a、g、h、j共培养。虚线显示了在金黄色葡萄球菌感染，没有任何干预物质情况下的线虫存活率。星号体现了各受试组与金葡对照组(无干预物质)比较的统计学差异。
[0105]
图23显示培养皿圆片扩散测试中，不同母乳低聚糖单体与金黄色葡萄球菌共培养观察是否直接抑菌，并与阳性对照庆大霉素对比的情况。
具体实施方式
[0106]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0107]
除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。
[0108]
此外，为避免重复，以下列出各实施例中的实验需要经过的通用步骤，如菌株培养等。
[0109]
材料与方法
[0110]
表1受试母乳低聚糖样品
[0111]
中文名称英文名称英文缩写2
’‑
岩藻糖基乳糖2
’‑
fucosyllactose2
’‑
fl3
‑
岩藻糖基乳糖3
‑
fucosyllactose3
‑
fl乳糖
‑
n
‑
四糖lacto
‑
n
‑
tetraoselnt3
’‑
唾液酸基乳糖3
’‑
sialyllactose3
’‑
sl6
’‑
唾液酸基乳糖6
’‑
sialyllactose6
’‑
sl五种母乳低聚糖组合物human milk oligosaccharide mixhmo mix
[0112]
表2受试母乳低聚糖组合物配比
[0113]
比例(％)2
’‑
fl3
‑
fllnt3
’‑
sl6
’‑
sl组合物a53211655组合物g54132220组合物h303025123组合物j2010808
[0114]
用蒸馏水配制母乳低聚糖溶液，并在含有不同终浓度(分别是1、10、30mg/ml)的线虫生长培养基的培养皿中进行培养。为了更好地确定理想的浓度范围，先初步进行了一个2
’‑
fl剂量和反应关系的初筛，所使用的2
’‑
fl浓度为0.001，0.01，0.1，1和10mg/ml。hmo组合物添加到线虫培养基中的受试浓度增加了8mg/ml以及15mg/ml的方案。
[0115]
用补充了1％半胱氨酸的mrs培养基来培养动物双歧杆菌bb
‑
12，并在37℃厌氧环境中孵育过夜。收获细胞并用生理盐水溶液冲洗，调整细菌浓度将其接种在含有线虫生长培养基的平皿中，终浓度为1
×
108cfu。
[0116]
线虫感染模型
[0117]
获取年龄一致的线虫并将其培养在含线虫琼脂培养基(线虫培养基中含有大肠杆菌op50为食物)的培养皿中，添加不同剂量的hmo(1，8，10，15，30mg/ml)进行共培养。在线虫成年后，它们被转移到接种了金黄色葡萄球菌atcc25923(添加量约为108～109cfu/ml)的培养皿中，来模拟受到金黄色葡萄球菌感染的情况。各组别在感染阶段添加的干预物(hmo)情况分别与培养阶段相同。使用两个对照，分别是没有致病菌的条件(线虫培养皿中含有大肠杆菌op50)，以及有致病菌金黄色葡萄球菌感染但没有任何干预物的(只含有金黄色葡萄球菌的培养皿)。另设置培养阶段添加干预物而感染阶段没有任何干预物的组别、以及培养阶段未添加干预物而感染阶段添加干预物的组别。
[0118]
将线虫培养几天后，对它们的存活率进行每日计数。如果线虫对铂丝没有反应，则可被认为是死亡。每种条件均进行两次独立测定(即除特别注明外，实施例中各实验数据均为两次独立实验结果)。
[0119]
对存活曲线进行统计学的比较分析，用graphpad prism 4或graphpad prism 9统计学软件包进行log rank survival显著性分析。用one
‑
way anova分析在感染第三天或第五天各组存活率的显著性差异。进行组间比较时，用星号*体现显著性差异的程度，****表
示p<0.0001，***表示p<0.001。ns表示不显著。
[0120]
实验结果
[0121]
实施例1不同浓度的母乳低聚糖2
’‑
fl对金黄色葡萄球菌感染后线虫存活率的影响
[0122]
首先，为确定实验中受试hmo的剂量范围，测试了2
’‑
fl的六种不同剂量。如图1所示，1mg/ml或以下的剂量并未显示任何作用，而10mg/ml引起了线虫存活率相当程度上的增长，效果显著(p<0.0001)。因而如图2显示，测定了较高的剂量，当2
’‑
fl剂量达到30mg/ml时，保护作用有显著的增加，效果显著(p<0.0001)。由此可见，2
’‑
fl对于金黄色葡萄球菌有显著保护作用，且该作用取决于剂量，在30mg/ml时最理想。图3柱状图显示了当被金黄色葡萄球菌感染3天后，2
’‑
fl各个剂量对于线虫存活率的不同影响，可见浓度较高时，保护作用较明显。
[0123]
本发明在另一批次的实验中，还评估了hmo单体2
′‑
fl在15mg/ml浓度下对于金黄色葡萄球菌感染后，线虫存活率的提升效果。结果参见图4。可见在此浓度下，单独的2
′‑
fl显著提升了线虫的存活率，体现了2
’‑
fl对于生物机体免疫功能的调控与提升效果。
[0124]
实施例2不同浓度的母乳低聚糖3
‑
fl对金黄色葡萄球菌感染后线虫存活率的影响
[0125]
如图5所示，在3
‑
fl上，也观察到了剂量
‑
效果的对应关系，当剂量更高时，保护作用更强。当浓度为10和30mg/ml时，3
‑
fl起到较好的保护作用(p<0.0001)，且30mg/ml时作用最好。在1mg/ml时没有效果。如图6所示，将3
‑
fl与2
’‑
fl和动物双歧杆菌bb
‑
12对于线虫存活率影响的数据进行比较，发现当被金黄色葡萄球菌感染3天后，3
‑
fl在10mg/ml时能达到2
’‑
fl在30mg/ml时相同的效果。可见3
‑
fl对于线虫受到金黄色葡萄球菌感染的保护比同等剂量2
’‑
fl效果更好。推断低于10mg/ml的3
‑
fl具有在受到金黄色葡萄球菌感染的情况下，保护线虫存活率，使之显著高于阴性对照组的潜力。
[0126]
实施例3不同浓度的母乳低聚糖lnt对金黄色葡萄球菌感染后线虫存活率的影响
[0127]
如图7所示，类似地，当lnt添加浓度在1mg/ml时，对金黄色葡萄球菌感染后秀丽隐杆线虫(简称线虫)的存活率没有太大提升，但当lnt添加浓度为10mg/ml或30mg/ml时，对金黄色葡萄球菌感染后线虫的存活率有显著的提升。可见lnt对金黄色葡萄球菌感染后线虫生长的调控也存在剂量
‑
效果的对应关系。图8的柱状图显示了当被金黄色葡萄球菌感染3天后，lnt各个剂量对于线虫存活率的不同影响，可见浓度较高时，保护作用较明显。
[0128]
实施例4不同浓度的母乳低聚糖6
’‑
sl对金黄色葡萄球菌感染后线虫存活率的影响
[0129]
如图9所示，在6
’‑
sl中也观察到类似的效果：当6
’‑
sl添加浓度在1mg/ml时，对金黄色葡萄球菌(简称金葡)感染后秀丽隐杆线虫(简称线虫)的存活率没有太大提升，但当6
’‑
sl添加浓度为10mg/ml或30mg/ml时，对金葡感染后线虫的存活率有显著提升。可见6
’‑
sl对金黄色葡萄球菌感染后线虫生长的调控也存在剂量
‑
效果的对应关系。图10的柱状图显示了当被金黄色葡萄球菌感染3天后，6
’‑
sl各个剂量对线虫存活率的不同影响，可见浓度较高时，保护作用较明显。且6
’‑
sl在10mg/ml时存活率达到的效果与其30mg/ml时相近，并比较其他各种受试hmo单体，发现6
’‑
sl保护的线虫存活率数值较高，达到了75％。推断低于10mg/ml的6
’‑
sl具有在受到金黄色葡萄球菌感染的情况下，保护线虫存活率，使之显著高于阴性对照组的潜力。
[0130]
此外，对6
’‑
sl的同分异构体3
’‑
sl，也用同样方法进行了三个浓度(1mg/ml，10mg/ml与30mg/ml)的测试，但未见任何显著效果(图11，图12)。可见对金黄色葡萄球菌感染的应对，是受具体物质结构影响的，并非所有低聚糖类物质都可有效果，且不同物质效果也各异。
[0131]
实施例5不同浓度的母乳低聚糖组合物对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时存活率的影响，及其与同等剂量单体的比较
[0132]
首先，为确定实验中受试hmo组合物的剂量范围，测试了hmo组合物a的六种不同剂量。如图13所示，1mg/ml或以下的剂量并未显示任何作用，而10mg/ml引起了线虫存活率相当程度上的增长，效果显著(p<0.0001)。因而如图13显示，测定了较高的剂量，当hmo组合物a剂量达到30mg/ml时，保护作用有显著的增加，效果显著(p<0.0001)。由此可见，hmo组合物a对于金黄色葡萄球菌有显著保护作用，且该作用取决于剂量，在10mg/ml和30mg/ml时较理想。图14柱状图显示了当被金黄色葡萄球菌感染3天后，hmo组合物a各个剂量对于线虫存活率的不同影响，可见浓度较高时，保护作用较明显。
[0133]
此外，在与金黄色葡萄球菌培养第三天时，将母乳低聚糖组合物a与各单体在剂量为10mg/ml(图15)和30mg/ml(图16)时分别比较，可见在10mg/ml时，母乳低聚糖组合物a的效果比单体如2
’‑
fl，lnt和3
’‑
sl在同等剂量下均效果更好，呈现显著性；在30mg/ml时，母乳低聚糖组合物a的效果比单体如2
’‑
fl，lnt和3
’‑
sl在同等剂量下均效果更好，呈现显著性，且比3
‑
fl和6
’‑
sl单体有效果更好的趋势，体现出一定协同效应。
[0134]
在与金黄色葡萄球菌培养第五天时，将母乳低聚糖组合物a与各单体在剂量为30mg/ml(图17)时再次分别比较，母乳低聚糖组合物的效果比所有受试单体，包括2
’‑
fl，3
‑
fl，lnt，3
’‑
sl和6
’‑
sl在同等剂量下均效果更好，呈现显著性，体现出组合物的协同效应与优势。
[0135]
本发明在另一批次的实验中，还评估了hmo组合物a在8mg/ml和15mg/ml浓度下，对于金黄色葡萄球菌感染后，线虫存活率的提升效果。结果参见图18。可见在8mg/ml(p<0.001)和15mg/ml(p<0.0001)浓度下，组合物a均可提升线虫的存活率，体现了对于金黄色葡萄球菌感染的保护作用。将两个浓度的保护作用进行比较，发现15mg/ml浓度下保护作用更高(p<0.001)。可见该比例下，观察到了组合物的量效反应。
[0136]
同样的，将hmo组合物g在两个不同浓度下进行比较，结果参见图19。可发现浓度为15mg/ml时，hmo组合物对于金黄色葡萄球菌感染下线虫存活率的保护作用更强(p<0.0001)。而浓度为8mg/ml时，组合物g相比没有加任何受试物质的对照，同样体现了显著的保护作用(p<0.0001)。可见该比例下，观察到了组合物的量效反应。
[0137]
图20展现了hmo组合物h在两种不同浓度下的线虫存活率曲线。可见8mg/ml(p<0.001)和15mg/ml(p<0.0001)这两种浓度均比未加受试物质的对照组有显著更高的存活率，其中15mg/ml下的hmo组合物h比8mg/ml的保护效果略微更高(p<0.05)。可见该比例下，观察到了hmo组合物的量效反应。
[0138]
本发明还评估了hmo组合物j的效果。如图21所示，8mg/ml(p<0.01)和15mg/ml(p<0.05)这两种浓度均比未加受试物质的对照组的存活率略微有一定程度的提升，而这两个浓度的存活率提升效果没有差异(p>0.05)。可见该比例下，未观察到组合物的量效反应。
[0139]
将受试的hmo各比例组合物对于金黄色葡萄球菌感染下线虫存活率的保护作用进
行比较，结果参见图22。可发现感染后第五天，所有比例都显示了对于其存活率的保护作用。而hmo组合物a和组合物g，均在15mg/ml条件下，体现了最高的保护效果(p<0.0001)。此外，15mg/ml的hmo组合物g在感染第五天也导致了较高的线虫存活率(p<0.0001)。几乎所有受试组别在8mg/ml下的保护作用均比15mg/ml下面要低，除了hmo组合物j。hmo组合物j对于线虫存活率的保护作用，在两种剂量下均是最低的，且剂量之间没有区别(p>0.05)。
[0140]
可见hmo组合物a、hmo组合物g、hmo组合物h都体现了较好的量效反应，即高浓度的保护效果比低浓度显著地更好。而hmo组合物j没有体现出量效反应，即高低浓度下，保护效果无区别。且hmo组合物j相比阴性对照，其对存活率的提升效果，不及其他比例的hmo组合物a、hmo组合物g和hmo组合物h。
[0141]
实施例6圆片扩散抑菌圈实验
[0142]
为确定受试物质是否本身具有抗菌效果，进行了圆片扩散的抑菌圈实验。用无菌的滤纸制成圆片，并接入受试的hmo物质(10mg/ml，30mg/ml)，并将圆片在无菌条件下干燥过夜。将金黄色葡萄球菌atcc25923(1.0
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106cfu/ml)均匀涂抹在ngm琼脂平板表面，随后再将圆片放置于接种的琼脂平板培养皿表面。庆大霉素(200μg/ml)作为阳性对照。所有培养皿在37摄氏度下培养18小时。通过观察在圆片周围是否形成透明的环状圈来确认受试物质是否能直接抑制细菌生长或者具有抗菌活性。
[0143]
图23显示了在培养皿圆片扩散测试中，不同母乳低聚糖单体与金黄色葡萄球菌共培养观察是否直接抑菌，并与阳性对照庆大霉素对比的情况。
[0144]
为了研究在此前的测试中所出现的，hmo单体或其组合物对于应对金黄色葡萄球菌感染起到的保护作用，是否来源于直接的杀菌或者抑菌功能，进行了受试物质和菌群一起培养并观察是否有抑菌圈形成的测试。如图所示，在两个不同的浓度下(左：10mg/ml，右：30mg/ml)，各个母乳低聚糖单体均没有在接种点周围形成透明的环状抑菌圈。而阳性对照庆大霉素(gentamicin)则显示出了抑菌效果，以透明环状抑菌圈的产生作为标志。由此可见，本研究中体现的各母乳低聚糖单体和其组合物对于线虫受到金黄色葡萄球菌感染的保护作用并非源于物质可以直接杀菌，而背后的机理可能在于其提升了机体应对金葡菌感染时的抵御能力，如激活机体自身免疫系统等，进而起到了抵御病菌和防护作用。
[0145]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。