EHDV-2型单克隆抗体、制备源细胞株、产物应用及试剂盒的制作方法

ehdv
‑
2型单克隆抗体、制备源细胞株、产物应用及试剂盒
技术领域
1.本发明涉及病毒抗体检测领域，尤其涉及流行性出血病病毒2型单克隆抗体、制备源细胞株及其试剂盒。


背景技术：

2.流行性出血病病毒2型简写ehdv
‑
2型。ehd
‑
2型属于ehd九种血清型中的一种。ehd不同的血清型毒株对牛的致病性差异较大。现有的研究认为仅ehdv
‑
2型的其中1个毒株
‑
茨城病病毒(ibaraki virus，ibav)对牛有较强致病性，其引起牛的突发高热、咽喉麻痹、关节疼痛性肿胀等症状。我国每年从国外进口10万
‑
20万头种牛，加强ehdv
‑
2型病毒抗体的监测，是保障我国种牛健康养殖的措施之一。
3.ehd抗体检测方法，现有中和试验(vn)、琼扩试验和elisa检测方法，其中中和试验实验环境要求高，需要生物安全一定级别实验室进行，试验周期长3
‑
5天；琼扩试验需要有经验的实验员观察判定，不能数字显示检测结果；elisa方法，通过酶联免疫分析仪读取，结果以数字化形式判定，客观、准确，具有较强的使用优势。本专利研制的ehd
‑
2型b
‑
elisa抗体检测方法，主要针对ehd感染牛致病性的毒株产生的抗体检测而设计，具有显著的针对性，对于ehd感染牛的防控意义较大，同时研制的试剂盒其检测灵敏性、特异性等指标均与oie推荐的类似方法相近。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题在于，利用制备的ehd
‑
2型单克隆抗体、ehd
‑
2型病毒包被的elisa板，组装试剂盒，试剂盒检测指标达到国际认可的检测值。
5.本发明解决上述技术问题的技术方案是，一种制备流行性出血病病毒2型单克隆抗体的细胞株，该细胞株：杂交瘤细胞株ehd e2c5，保藏时间：2021年8月12日，保藏编号：cctcc no:c2021180，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地点：中华人民共和国湖北省武汉市武汉大学保藏中心。
6.使用上述的细胞株制备流行性出血病病毒2型单克隆抗体的方法，该方法包括以下步骤：在杂交瘤细胞株ehd e2c5中提取流行性出血病病毒2型单克隆抗体，注射小鼠腹腔，取腹水纯化制备而得。
7.上述的方法，包括以下步骤：
8.(1)用纯化的ehdv
‑
2型灭活病毒，分别加等体积弗氏完全佐剂(fca)乳化和弗氏不完全佐剂(fia)乳化，先后免疫balb/c小鼠(balb/c小鼠)三次；
9.(2)取免疫小鼠的脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇(mw1500)融合剂下融合，hat培养基筛选杂交瘤细胞，用间接elisa方法检测分泌抗ehdv
‑
2病毒的阳性孔；用有限稀释法进行细胞克隆，经间接elisa筛选阳性克隆，获得能稳定传代并分泌抗ehdv
‑
2病毒蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株ehd e2c5。
10.上述方法制备产物的应用，所述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体针对口蹄疫a
型或asia i型或蓝舌病或赤羽病或病毒性腹泻无任何免疫反应。
11.上述方法制备产物的应用，所述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体仅针对ehdv
‑
2病毒的抗原决定簇
12.上述方法制备产物的应用，所述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体仅与ehdv
‑
2病毒及ehd抗原有特异性免疫反应。
13.一种抗体试剂盒，所述的试剂盒包括如上述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体。
14.上述述的抗体试剂盒，所述的试剂盒还包括流行性出血病病毒2型抗原预包被板、强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、hrp羊抗鼠二抗、20倍浓缩洗涤液、稀释液、底物液以及终止液。
15.上述20倍浓缩洗涤液为20倍浓缩的含0.05％～0.5％tween
‑
20的0.01mol/lph7.4 pbst；稀释液为含1％～10％bsa、0.05％～0.5％tween
‑
20ph7.4的pbs；底物液为可溶性tmb；终止液为1
‑
2mol/l h2so4溶液。
16.上述的抗体试剂盒各组成部分的体积或数量如下：流行性出血病病毒2型抗原预包被板2块；ehd
‑
2型单克隆抗体0.3ml；强阳性对照0.6ml；弱阳性对照0.6ml；阴性对照0.6ml；hrp标记羊抗鼠二抗0.3ml；20倍浓缩洗涤液50ml；稀释液60ml；底物液25ml；终止液25ml；封板纸6张；说明书1份。
17.所述ehdv
‑
2型病毒包被板通过以下方法制备：
18.ehdv
‑
2病毒接种于长成单层的bhk21细胞，5％co
2 37℃培养3d
‑
5d，细胞出现缩圆脱落后，
‑
20℃冻融细胞3次，收集病毒液。用ph4.0柠檬酸缓冲液透析24h，再用ph7.0 pbs透析24h，收集病毒液。病毒液中加入等体积饱和硫酸铵，沉淀2h，离心弃上清，取沉淀，用pbs溶解，作为包被用抗原。ehdv
‑
2型病毒抗原按照1:500～1:1000比列，用ph9.0
‑
10.0碳酸盐缓冲液稀释，每孔100ul加入康宁公司高吸附可拆酶标板，4℃放置18～24h，洗板3次，用含1％～10％bsa pbs缓冲液封闭1h，pbst洗板，干燥1h～3h制得。
19.一种如上所述的试剂盒的制备方法，包括：
20.(1)使用ehdv
‑
2型抗原预包被板；
21.(2)使用纯化的灭活ehdv
‑
2病毒免疫balb/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞，将所述脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞在融合剂下融合后筛选获得杂交瘤细胞株ehd e2c5，取杂交瘤细胞上清，利用proteing柱纯化的ehdv
‑
2型单克隆抗体。
22.在本发明所述的试剂盒的制备方法中，还包括强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、hrp标记羊抗鼠二抗、20倍浓缩洗涤液、稀释液、底物液以及终止液，并将所述液体和ehdv
‑
2型抗原预包被板、ehdv
‑
2单克隆抗体分开放置。
23.本发明的试剂盒采用阻断elisa检测牛、羊和鹿等动物血清ehdv
‑
2病毒抗体，可用于ehdv
‑
2及ehd其它血清型病毒血清抗体的快速检测和流行病学调查。
24.本发明有益效果为，试剂盒中ehdv
‑
2型病毒单克隆抗体通过ehdv
‑
2型灭活病毒免疫balbc小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合而制得；通过单克隆抗体与ehd
‑
2灭活病毒，优化反应条件制备的ehdv
‑
2型病毒阻断elisa抗体检测试剂盒，操作程序简单，检测结果、技术性能指标均等同于世界动物卫生组织(oie)推荐的ehd elisa抗体检测方法。
具体实施方式
25.本发明提供一种制备流行性出血病病毒2型单克隆抗体的细胞株，该细胞株：杂交瘤细胞株ehd e2c5，保藏时间：2021年8月12日，保藏编号：cctcc no:c2021180，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地点：中华人民共和国湖北省武汉市武汉大学保藏中心。
26.使用上述的细胞株制备流行性出血病病毒2型单克隆抗体的方法，该方法包括以下步骤：在杂交瘤细胞株ehd e2c5中提取流行性出血病病毒2型单克隆抗体，注射小鼠腹腔，取腹水纯化制备而得。
27.上述的方法，包括以下步骤：
28.(1)用纯化的ehdv
‑
2型灭活病毒，分别加等体积弗氏完全佐剂(fca)乳化和弗氏不完全佐剂(fia)乳化，先后免疫balb/c小鼠(balb/c小鼠)三次；
29.(2)取免疫小鼠的脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇(mw1500)融合剂下融合，hat培养基筛选杂交瘤细胞，用间接elisa方法检测分泌抗ehdv
‑
2病毒的阳性孔；用有限稀释法进行细胞克隆，经间接elisa筛选阳性克隆，获得能稳定传代并分泌抗ehdv
‑
2病毒蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株ehd e2c5。
30.上述方法制备产物的应用，所述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体针对口蹄疫a型或asia i型或蓝舌病或赤羽病或病毒性腹泻无任何免疫反应。
31.上述方法制备产物的应用，所述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体仅针对ehdv
‑
2病毒的抗原决定簇
32.上述方法制备产物的应用，所述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体仅与ehdv
‑
2病毒及ehd抗原有特异性免疫反应。
33.一种抗体试剂盒，所述的试剂盒包括如上述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体。
34.上述述的抗体试剂盒，所述的试剂盒还包括流行性出血病病毒2型抗原预包被板、强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、hrp羊抗鼠二抗、20倍浓缩洗涤液、稀释液、底物液以及终止液。
35.上述20倍浓缩洗涤液为20倍浓缩的含0.05％～0.5％tween
‑
20的0.01mol/l ph7.4 pbst；稀释液为含1％～10％bsa、0.05％～0.5％tween
‑
20ph7.4的pbs；底物液为可溶性tmb；终止液为1
‑
2mol/l h2so4溶液。
36.上述的抗体试剂盒各组成部分的体积或数量如下：ehdv
‑
2抗原预包被板2块；ehd
‑
2型单克隆抗体0.3ml；强阳性对照0.6ml；弱阳性对照0.6ml；阴性对照0.6ml；hrp标记羊抗鼠二抗0.3ml；20倍浓缩洗涤液50ml；稀释液60ml；底物液25ml；终止液25ml；封板纸6张；说明书1份。
37.一种ehdv
‑
2病毒单克隆抗体的制备和相应的elisa抗体检测试剂盒，该试剂盒包括分别放置的ehdv
‑
2抗原预包被板，ehdv
‑
2病毒特异性单克隆抗体。
38.此外，在上述试剂盒中，还包括分别放置的强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、hrp标记羊抗鼠二抗、20倍浓缩洗涤液、稀释液、底物液以及终止液。其中所述20倍浓缩洗涤液为20倍浓缩的含0.05％～0.1％tween
‑
20的0.01mol/l ph 7.4pbst；稀释液为含1％～10％bsa、0.05％～0.1％tween
‑
20ph7.4的pbs；底物液为可溶性tmb；终止液为1mol/l h2so4溶液。
39.为了便于使用，上述试剂盒的各组成部分的体积或数量如下：
[0040][0041]
以下提供制备上述试剂盒的具体实例：
[0042]
1.制备ehdv
‑
2抗原预包被板：ehdv
‑
2病毒接种于长成单层的bhk21细胞，5％co
2 37℃培养3天，细胞出现缩圆，脱落后，
‑
20℃冻融细胞3次，收集病毒液。用ph4.0柠檬酸缓冲液透析24h，再用ph7.0 pbs透析24h，收集病毒液。病毒液中加入等体积饱和硫酸铵，沉淀2h，离心弃上清，取沉淀，用pbs溶解，作为包被用抗原。ehdv
‑
2型病毒抗原按照1:500～1:1000比列，用ph9.0
‑
10.0碳酸盐缓冲液稀释，每孔100ul加入康宁公司高吸附可拆酶标板，4℃放置18～24h，洗板3次，用含1％～10％bsa pbs缓冲液封闭1h，pbst洗板，干燥1h～3h制得。
[0043]
2、制备抗ehdv
‑
2型病毒单克隆抗体：用纯化的ehdv
‑
2型灭活病毒，分别加等体积弗氏完全佐剂(fca)乳化和弗氏不完全佐剂(fia)乳化，先后免疫balb/c小鼠(balb/c小鼠)三次；取免疫小鼠的脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇(mw1500)融合剂下融合，hat培养基筛选杂交瘤细胞，用间接elisa方法检测分泌抗ehdv
‑
2病毒的阳性孔；用有限稀释法进行细胞克隆，经间接elisa筛选阳性克隆，获得能稳定传代并分泌抗ehdv
‑
2病毒蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株ehd e2c5；用间接elisa方法鉴定制备的单克隆抗体仅与ehdv
‑
2病毒蛋白抗原有特异性免疫反应，而与其它相关病毒(如口蹄疫a型、asia i型，蓝舌病、赤羽病、病毒性腹泻等)没有任何免疫反应。
[0044]
3、制备强阳性对照：挑选体格健壮的16个月以上的山羊2～3只，将灭活的ehdv
‑
2病毒经背部皮下注射，5ml/只；首免后第2周和第4周分别用ehdv
‑
2病毒进行二免和三免；待山羊血清中抗ehdv
‑
2病毒抗体，酶联免疫吸附试验效价达1:100以上，无菌采血分离血清，离心或过滤除去沉淀，抽滤除菌，3ml/管分装，贴上标签，
‑
80℃保存。
[0045]
4、阴性对照的制备：选择体格健壮的18个月以上的山羊，采血用oie(2010)《ehdv病毒中和试验》检测方法确认血清中是否有ehdv
‑
2病毒抗体，证实无ehdv
‑
2病毒抗体的山羊，无菌采血分离血清。3ml/管分装，贴上标签，
‑
80℃保存。
[0046]
5、制备弱阳性对照：利用阴性对照，倍比稀释ehdv
‑
2病毒强阳性对照，采用oie推荐的elisa方法进行效价测定，与国际标准阳性血清进行比较，制备ehdv
‑
2病毒弱阳性对照。
[0047]
6、包被缓冲液：0.05mol/lph9.6碳酸盐缓冲液(nahco31.465g、na2co30.795g或na2co3.10h2o 1.2g、水500ml)。溶解后过滤除菌，置于4℃冰箱，一周内使用。
[0048]
7、单克隆抗体制备：取5d3杂交瘤细胞株，利用20％胎牛血清的imdm培养基进行培养，收集细胞上清，8000rpm离心，取上清利用proteing柱进行纯化，纯化后，稀释成0.48mg/ml进行保存。
[0049]
8、底物液：tiangen(中国)，可溶性单组份tmb(货号：pa107
‑
01)。
[0050]
9、20倍浓缩洗涤液、稀释液、底物液、终止液的优选：本发明通过试验，选定如下最佳的洗涤液、稀释液，终止液配方。
[0051]
20倍浓缩洗涤液配方：nacl160g，kh2po
4 4.8g，na2hpo429g，kcl4g，tween
‑
20 10ml，蒸馏水1000ml，充分溶解，过滤除菌后分装。用时作20倍稀释。
[0052]
稀释液配方：nacl8g，kh2po
4 0.24g，na2hpo41.44g，kcl 0.2g，蒸馏水1000ml，充分溶解，加入3％bsa，过滤除菌后分装。
[0053]
终止液：将10.87ml初始浓度为95％～98％的硫酸缓慢加入到89.13ml的去离子水中混匀，即为终止液。
[0054]
10、羊抗鼠二抗：采用商品化的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(usa，kpl公司，货号074
‑
1806，1.0mg)，作1：50稀释。
[0055]
11、试剂盒的组装：将按上述方法制备好的ehdv
‑
2抗原预包被板、单克隆抗体、hrp羊抗鼠二抗、稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液、终止液、强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照定量分装，分别贴上标签与说明。1份详细的试剂盒使用操作说明书。6张贴板纸。装入专用的试剂盒外壳内，外壳上贴上试剂盒标签。
[0056]
12、试剂盒中各种试液的配制与分装
[0057]
试剂盒中试液的配制分装表
[0058][0059]
使用上述试剂盒进行检测操作的程序如下：
[0060]
1.试剂工作液的配置
[0061]
pbst洗液：利用试剂盒提供的20
×
洗液(洗液中如出现沉淀，请37℃加热使其溶解)，用去离子水或蒸馏水进行20倍稀释，即为pbst洗液
[0062]
ehdv
‑
2单克隆抗体工作液：用试剂盒提供的稀释液按1:50稀释ehdv单克隆抗体
(如：10μl单克隆抗体 490μl试剂盒提供稀释液)，即为ehdv单克隆抗体工作液。
[0063]
hrp羊抗鼠二抗工作液：用试剂盒提供的稀释液进行1:100稀释hrp羊抗鼠二抗(如：10μlhrp羊抗鼠二抗 990μl稀释液)，即为hrp羊抗鼠二抗工作液。
[0064]
2.操作步骤：
[0065]
计算测试样品数量，取所需测试elisa板条，进行试验。
[0066]
(1)每孔加入30μl稀释液，然后分别加入：
[0067]
a：加20μl稀释液到a1，a2孔；
[0068]
b：加20μl待检血清样品到测试孔中，每孔加一份样品；
[0069]
c：加20μl强阳性对照到b1，b2，c1，c2孔；
[0070]
d：加20μl弱阳性对照到d1，d2，e1，e2孔；
[0071]
e：加20μl阴性对照到f1，f2，g1，g2孔；
[0072]
37℃连续震荡反应1h；
[0073]
(2)不要洗板。
[0074]
a1，a2孔加50μl稀释液，其余每孔加入50μlehdv
‑
2型单克隆抗体工作液。
[0075]
(3)37℃连续震荡反应45min。
[0076]
(4)用pbst洗液，每孔加250μl，洗板3次，甩干。
[0077]
(5)每孔加入hrp羊抗鼠二抗工作液100μl，37℃连续震荡反应30min。
[0078]
(6)用pbst洗液，每孔加250μl，洗板3次，甩干。
[0079]
(7)每孔加入底物液100μl，37℃避光静置10min～15min。
[0080]
(8)每孔加终止液100μl
[0081]
(9)用elisa仪，在450nm波长下读数。
[0082]
3.结果判定：
[0083]
①
计算公式：
[0084]
s/m＝100
‑
血清样本平均od值/m孔平均od值*100
[0085]
②
判定标准：
[0086]
pi结果≤50阳性>50阴性
[0087]
注：若每份样品做双孔，在结果判定时如出现1孔s/m值小于等于50，1孔pi值大于50时，需重新检测。
[0088]
注：1.试剂盒置4℃保存。
[0089]
2.可疑样品，需用其它方法进行检测。
[0090]
试剂盒阳性判定值的确定：按照上述试剂盒的检测程序，采用oie(2010)《ehd病毒中和试验》检测方法确认的30份阴性对照和120份阳性血清，进行b
‑
elisa试验后，结果所有阳性血清的s/m≤50％，所有阴性s/m>50。因此，获得belisa阴性判定值(cut
‑
off value)为：s/m≤50被检血清ehdv
‑
2型抗体阳性；反之阴性。
[0091]
试剂盒的临床样品检测与应用以及试剂盒敏感性、特异性的评价：按照上述试剂盒的检测程序，用oie(2010)《ehd病毒中和试验》检测方法确认的30份阴性对照和30份阳性血清，进行belisa试验。统计获得试剂盒的特异性为97％(阴性结果数/阴性样品总数＝29/
30)，敏感性为90％(阳性结果数/阳性样品总数＝27/30)，本试剂盒的特异性、敏感性为良好。
[0092]
上述具体实施例的实验数据表明，本发明的ehdv
‑
2型病毒抗体阻断酶联免疫吸附试验(b
‑
elisa)试剂盒特异性强，敏感性高，适用于鹿流行性出血病病毒的快速诊断、检测、检疫和流行病学调查。
[0093]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护。