一种砂仁SSR分子标记引物组及其应用的制作方法

一种砂仁ssr分子标记引物组及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种砂仁ssr分子标记引物组、指纹图谱构建及其在砂仁种质资源鉴定中的应用。


背景技术：

2.砂仁(amomi fructus)为姜科、豆蔻属多年生草本植物，具有化湿开胃、理气安胎、醒脾等作用，为中国“四大南药”之一。砂仁为中国传统药材，据记载约有1300的应用历史，是中国传统药材，每年市场需求量估计达到2.2
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106kg，正品砂仁干燥成熟果实包括阳春砂(amomum villosum lour.)、绿壳砂(a.villosum lour.var.ranthioides t.l.wu et senjen)和海南砂(a.longiligulare t.l.wu)3种，其中，阳春砂仁为砂仁中的主流品种。由于砂仁种质多元，引种随意，保存较为分散，地方栽培种独立命名，因此存在同名不同种、同种不同名，以及药材间相互伪充等问题，造成种质利用困难，种植混乱，甚者对砂仁带来不利的影响。因此，有必要建立一种方法对来自不同品种或来自不同地方的砂仁种质进行鉴别，为每一个品种或种类建立独有特征指纹，以达到鉴定、分类，甚至是控制质量的目的。
3.关于砂仁分子鉴别，欧阳霄妮采用rapd标记技术对4种农家栽培类型的阳春砂基因组dna进行鉴定，结果显示均来源于姜科豆蔻属植物阳春砂(欧阳霄妮.阳春砂资源调查与品质评价研究[d].广州中医药大学,2010.)。张忠廉等用issr标记技术对不同产地、不同表型性状的砂仁样品进行遗传多样性及亲缘关系分析，筛选出11条issr引物，进行聚类分析结果表明各居群表型性状差异较小，表明砂仁种质资源的遗传多样性较低(张忠廉,李学兰,杨春勇,唐德英,王继永,高微微.砂仁遗传多样性的issr分析[j].中草药,2011,42(03):570
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574.)。焦文静等基于its2序列建立了单核苷酸多态性(snp)技术鉴别砂仁3个基原(阳春砂、海绿砂、绿壳砂)的方法(焦文静,张鹏,廖保生,王丽丽,韩建萍.基于snp位点鉴定砂仁药材物种[j].世界科学技术
‑
中医药现代化,2014,16(02):295
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300.)。总体来看，以往的研究多选用传统分子技术手段，且分析的材料数比较有限，至今砂仁不同品种指纹图谱尚未报道。
[0004]
ssr分子标记有着形态标记更突出的优势，具有重复性高，结果准确的优点。形态鉴定虽然直接方便，但数量有限，易受环境影响。研究表明，具有相似形态的相似个体可能包含较大的遗传变异，这些变异可以通过分子标记来识别。dna指纹图谱是在分子标记的基础上绘制而成的，这种图谱多态性丰富，具有高度的个体特异性和环境稳定性，犹如人的指纹一样能够鉴别生物个体之间的差异，因此被称为dna指纹图谱(dna fingerprinting)。dna指纹图谱具有快速、准确的特点，是鉴别品种、品系的有力工具，也非常适应于种质资源的鉴定工作。ssr分子标记具有多态性高、重复性好、操作简单等优点，被广泛应用于植物的鉴定和指纹图谱的构建。目前为止，利用ssr标记构建砂仁dna指纹图谱并提供相应的二维码信息，在国内外尚未报道。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于克服现有技术中存在砂仁种质资源鉴别的缺陷和不足，提供一种砂仁ssr分子标记引物组在砂仁种质资源鉴定上的应用。
[0006]
本发明的第一个目的在于提供一种砂仁ssr分子标记引物组；
[0007]
本发明的第二个目的在于提供基于所述砂仁ssr分子标记引物组构建指纹图谱的方法；
[0008]
本发明的第三个目的在于提供所述砂仁ssr分子标记引物组在砂仁种质资源鉴定中的应用。
[0009]
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
[0010]
本发明利用转录组测序技术提供了砂仁ssr引物，根据引物设计基本原则，同时以2个、3个、4个、5个及6个核苷酸重复次数至少分别为12次、9次、8次、5次及5次的要求进行引物对的初步筛选，选用共计64对引物，并利用4个形态差异较大的砂仁种质对引物进行多态性扩增，从中筛选了6对多态性高，扩增稳定的引物，可准确、高效、稳定地鉴定砂仁种质资源，为砂仁种质资源鉴定和品种利用提供技术保障。
[0011]
因此，本发明首先提供一种砂仁ssr分子标记引物组，包括以下6对引物：ssr
‑
06、ssr
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29、ssr
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33、ssr
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49、ssr
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56及ssr
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38，其序列依次如seq id no:1～12所示。
[0012]
本发明还提供包含所述砂仁ssr分子标记引物组的检测试剂或试剂盒。
[0013]
本发明还提供砂仁ssr分子标记引物组、或检测试剂/试剂盒在砂仁种质资源鉴定中的应用。
[0014]
砂仁ssr分子标记引物组、或检测试剂/试剂盒在构建砂仁种质dna指纹图谱和相应的二维码信息中的应用。
[0015]
本发明还提供一种砂仁种质dna指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
[0016]
s1.提取砂仁基因组dna；
[0017]
s2.以步骤s1提取的基因组dna为模板，利用权利要求1所述的ssr分子标记引物组进行pcr扩增；
[0018]
s3.用聚丙烯酰胺凝胶对步骤s2 pcr产物进行检测，银染显色；
[0019]
s4.分析步骤s3检测结果，构建砂仁dna指纹图谱。
[0020]
优选地，还包括利用构建的砂仁dna指纹图谱获取二维码信息；
[0021]
更优选地，步骤s1中提取的砂仁为幼苗期嫩叶片；
[0022]
更优选地，步骤s2所述pcr扩增体系为：dna模板1μl，ddh2o 4μl，2
×
santaq pcr mix 4μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl。
[0023]
进一步优选地，步骤s2所述pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。
[0024]
本发明还提供一种砂仁ssr标记指纹图谱的构建方法在砂仁种质资源鉴定中的应用。
[0025]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0026]
从本发明开发了一种砂仁ssr分子标记引物组，包括6对多态性高，扩增稳定的引物，可准确、高效、稳定地鉴定砂仁种质资源；所述6对ssr分子标标记引物组同时具有较好的多态性和通用性，不仅可以作为阳春砂仁指纹图构建引物，也可以作为海南砂仁植物图
谱构建的引物，为砂仁种质资源鉴定和品种利用提供技术保障。本发明采用砂仁ssr分子标记引物构建的dna指纹图谱，和相对应的二维码信息，为每一个品种或种类建立独有特征指纹二维码信息，以达到鉴定、分类，甚至是控制质量的目的，为砂仁的种质资源筛选、建库以及仿伪品的区分提供可行性方案。
附图说明
[0027]
图1为砂仁种质叶片。
[0028]
图2为砂仁ssr类型分布图。
[0029]
图3为85份砂仁种质二维码信息。
[0030]
图4为13份海南砂仁种质二维码信息。
具体实施方式
[0031]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0032]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0033]
实施例1砂仁ssr分子标记引物的开发
[0034]
取砂仁幼苗期嫩叶片如图1所示，剪碎放于1.5ml离心管中。对砂仁基因组叶片dna进行提取，采用天根植物基因组提取试剂盒提取步骤如下：
[0035]
(1)取砂仁新鲜叶片2g，在研钵充分研磨后装入离心管，加入400μl缓冲液fp1和6μl的rnase，旋涡振荡1分钟，65℃水浴30分钟。
[0036]
(2)加入130μl缓冲液fp2，充分混匀，涡旋振荡1分钟。
[0037]
(3)12000rpm离心5分钟，将上清转移至新的离心管中。
[0038]
(4)向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，此时会出现絮状基因组dna，12000rpm离心2分钟，弃上清，保留沉淀。
[0039]
(5)加入700μl 70％乙醇，涡旋振荡5秒钟，12000rpm离心2分钟，弃上清。
[0040]
(6)重复步骤(5)。
[0041]
(7)开盖倒置，室温放置5
‑
10分钟，彻底晾干残余的乙醇。
[0042]
(8)加入适量洗脱缓冲液te，65℃水浴10
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60分钟溶解dna，其间颠倒混匀数次助溶，最终得到dna溶液。
[0043]
再用1％琼脂糖凝胶电泳检测提取的砂仁dna的纯度与浓度，其中取10μl砂仁dna稀释到100ng/μl制备工作液，原液保存于
‑
20℃备用。
[0044]
砂仁转录组数据来源于本研究课题2020年对砂仁2份种质illumina高通量深度测序的结果。测序时利用砂仁3个部位(根、茎、叶)，提取rna后委托百迈客生物科技有限公司进行rna
‑
seq转录组测序。筛选500bp以上的转录本，利用misa软件做ssr分析，共预测出62390个ssr，鉴定出7种类型的ssr：mono
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nucleotide(单碱基)、di
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nucleotide(双碱基)、tri
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nucleotide(三碱基)、tetra
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nucleotide(四碱基)、penta
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nucleotide(五碱基)、hexa
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nucleotide(六碱基)、compound ssr(混合微卫星，两个ssr距离小于100bp)。对不同ssr类型的密度分布进行统计，结果如图2所示，在56530个ssr中，包含1个以上ssr的序列数
占比19.74％，混合微卫星占比1.13％，单碱基占比137.22％，双碱基占比39.96％，三碱基占44.06％，四碱基占2.23％，五碱基占比0.78％，六碱基占比1.2％。
[0045]
利用转录组测序技术提供了砂仁ssr分子标记引物，根据引物设计基本原则，同时以2个、3个、4个、5个、6个核苷酸重复次数至少分别为12次、9次、8次、5次、5次的要求进行引物对的初步筛选，选用共计64对引物，并利用5个形态差异较大的砂仁种质对引物进行多态性扩增，从中筛选了6对多态性高，扩增稳定的引物，引物对序列及退火温度等信息详见表1。
[0046]
表1 ssr引物名称
[0047][0048]
使用popgene软件计算变异等位基因的个数、统计有效等位基因数、nei’s基因多样性指数及shannon’s多态信息指数。利用powermaker软件计算多态信息含量值。筛选出的6对ssr标记引物的多态性分析结果详见表2，可以看出等位基因数位于5～8个之间，多样性指数、观测杂合度、期望杂合度和多样性指数分别居于0.9638～1.8091、0.000～0.6415、0.1896～0.5175和0.4802～0.8067之间，其中多态性信息含量(pic)都大于0.4481(0.5以上，说明多态性较好)，说明所选择ssr分子标记引物组的多样性较好。
[0049]
表2 ssr标记多态性分析
[0050][0051]
实施例2砂仁dna指纹图谱的构建方法
[0052]
(1)样品扩增
[0053]
供试材料来自中国热带农业科学院湛江实验站收集保存的85份砂仁群体资源，具体材料名称详见表3。提取砂仁样品的幼苗期嫩叶片dna，方法如实施例1中砂仁dna的提取步骤所示。以提取的dna为模板，利用表1提供的ssr分子标记引物组进行pcr扩增。
[0054]
pcr扩增反应在takara tp
‑
600pcr仪上进行。采用10μl反应体系，反应体系包含dna模板1μl，ddh2o 4μl，2
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santaq pcr mix预混液(由生工生物工程有限公司提供)4μl，上游引物和下游引物各0.5μl。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，复性30s(温度以引物最适退火温度而定)，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。
[0055]
表3材料名称
[0056][0057]
(2)检测样品
[0058]
采用6％聚丙烯酰胺凝胶对pcr产物进行电泳，电压180v，电流80a，时间60～90min。银染方法参考creste(2001)的方法。在整个染色过程中，凝胶板放置于在振荡器。拆卸凝胶装置，将带有结合凝胶的玻璃板放在塑料托盘上，加入1000ml固定溶液(10％乙醇，1％乙酸)并轻轻摇动10分钟；用蒸馏水洗涤凝胶1分钟，加入1000ml的1.5％硝酸预处理凝
胶(氧化)3分钟，充分震荡。再加入1000ml蒸馏水冲洗凝胶1分钟。用1000ml的0.2％agno3溶液浸渍凝胶20分钟，轻轻摇晃。后用1000ml蒸馏水冲洗凝胶30秒两次。再用250ml显影液并轻轻摇动直至溶液变暗。更换新的显影液4
‑
7分钟，直到出现所需强度的条带，去除显影液。加入1000ml 5％乙酸5分钟，用蒸馏水清洗凝胶。晾干后拍照或扫描保存。
[0059]
(3)数据分析
[0060]
对扩增稳定清晰的条带采用“0
‑
1”记录其位置，在相同的迁移位置上的条带标记为“1”，无带标记为“0”，建立0、1的ssr标记矩阵图。参考王琰琰等(2021)的构建图谱代码的方法，将选出来的核心ssr引物按照顺序用a、b、c
……
进行编号，每个引物扩增出的主带，根据分子量的大小，从1、2、3
……
进行条带编号，用0代表没有扩增出来的条带。然后每个品种按照顺序读带形成由字母和阿拉伯数字组成的一系列带型编号，该编号就是该种质的ssr指纹图谱代码。利用在线软件草料二维码生成器(http://cli.im/)对每个品种进行编码，将各个品种的品种名称、全国统一编号、类型、植物学分类、指纹图谱代码等信息一并录入，生成供试砂仁种质的二维条码。构建的85分砂仁指纹图谱代码详见表4，其相对应的种质二维码信息详见图3。
[0061]
表4 85份阳春砂仁ssr指纹图谱代码
[0062]
[0063]
[0064][0065]
实施例4砂仁ssr标记引物的通用性
[0066]
利用筛选出的6对砂仁ssr分子标记引物组对13份海南砂仁进行指纹图谱构建，方法如实施例3所示，指纹图谱代码如表5所示，结果进一步证明了筛选出的6对砂仁ssr分子标记引物组具有较好的多态性和通用性，不仅可以作为阳春砂仁指纹图构建引物，也可以作为海南砂仁植物图谱构建的引物。13份海南砂仁对应的二维码信息详见图4。
[0067]
表5 13份海南砂仁ssr指纹图谱代码
[0068]
[0069][0070]
以上结果表明，本发明提供的砂仁ssr分子标记引物组，并基于所述ssr分子标记引物组建立的砂仁dna指纹图谱，可准确、高效、稳定地鉴定砂仁种质资源，为砂仁种质资源鉴定、品种辨别和分子标记辅助育种等相关研究提供理论依据和技术支持，具有良好的应用前景。
[0071]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。