一种喹啉酸合酶突变体及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种喹啉酸合酶突变体及其应用。


背景技术：

2.nadh(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原型辅酶i)和nadph(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，还原型辅酶ⅱ)是微生物细胞中主要的还原力来源，也是细胞中氨基酸等多种代谢物合成的重要辅因子。目前，在微生物代谢工程领域，提高细胞内还原力(nadh/nadph)用于氨基酸等代谢物的生产的手段主要集中在提供还原力的再生能力，然而，nad从头合成的能力的改善少有研究和利用。
3.l
‑
谷氨酸(l
‑
glutamate)，化学名称为α
‑
氨基戊二酸，分子式为c5h9no4，分子量为147.13076，分子中含有两个羧基，是一种酸性氨基酸。谷氨酸是含量最丰富的氨基酸之一，除了参与蛋白质合成之外，在营养和信号传导方面也起着重要作用。谷氨酸或其单钠盐(味精)可作为食品添加剂提升食品的鲜味，因此被广泛地工业化生产。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种喹啉酸合酶突变体、表达该喹啉酸合酶突变体的微生物及其应用。
5.具体地，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供一种喹啉酸合酶突变体，以谷氨酸棒杆菌野生型喹啉酸合酶的氨基酸序列为参考序列，该喹啉酸合酶突变体含有第312位天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的突变。
7.喹啉酸合酶(ec 2.5.1.72)是nad从头合成的关键酶，nad从头合成以天冬氨酸作为底物，通过天冬氨酸氧化酶、喹啉酸合酶、喹啉酸酯磷酸核糖基转移酶催化合成烟酸单核苷酸。本发明对nad从头合成途径中喹啉酸合酶nada第312位天冬氨酸进行点突变，显著增强了喹啉酸合酶的催化活性，从而增强nadh、nadph的合成能力，提高微生物细胞的还原力水平，进而能够显著促进依赖还原力合成的代谢物的积累。
8.优选地，以谷氨酸棒杆菌野生型喹啉酸合酶的氨基酸序列为参考序列，所述喹啉酸合酶突变体含有第312位天冬氨酸被天冬酰胺取代的突变。
9.更优选地，所述喹啉酸合酶突变体具有如seq id no.1所示的氨基酸序列。
10.本领域技术人员应该理解，在上述蛋白突变体序列的n端或c端添加标签蛋白或将其与其他蛋白进行融合形成融合蛋白，在不改变上述突变蛋白本身的活性的情况下，上述添加标签的蛋白或融合蛋白也在本发明的保护范围内。
11.本发明还提供编码所述喹啉酸合酶突变体的核酸。
12.根据上述提供的喹啉酸合酶突变体的氨基酸序列，本领域技术人员能够获得其编码核酸的序列。基于密码子的简并性，编码上述氨基酸序列的核酸序列不止一种，所有能够编码上述蛋白突变体的核酸均在本发明的保护范围内。
glutamicum)、有效棒杆菌(corynebacterium efficiens)、钝齿棒杆菌(corynebacterium crenatum)、嗜热产氨棒杆菌(corynebacterium thermoaminogenes)、产氨棒杆菌(corynebacterium aminogenes)中的一种；
36.所述短杆菌属细菌为选自黄色短杆菌(brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(brevibacterium lactofermentum)中的一种。
37.更优选地，所述重组微生物为谷氨酸棒杆菌。
38.在用于目标产物的生产时，所述重组微生物的出发菌株应该为能够积累目标产物的菌株。
39.作为本发明的一种实施方式，所述重组微生物的出发菌株为能够积累谷氨酸的谷氨酸棒杆菌。
40.具体地，所述出发菌株优选含有如下突变中的一种或多种：
41.(1)在yggb中引入点突变a106v；
42.(2)对odha基因进行失活改造；
43.(3)过表达gdh基因；
44.(4)过表达glta基因。
45.作为本发明的一种实施方式，所述出发菌株为保藏编号为cgmcc no.11941的谷氨酸棒杆菌mhz
‑
0112
‑
8。
46.谷氨酸棒杆菌mhz
‑
0112
‑
8的纯培养物已经于2015年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmcc no.11941。本发明所提及的谷氨酸棒杆菌mhz
‑
0112
‑
8(cgmcc no.11941)已在中国专利公布号cn 105695383 a中公开。
47.本发明还提供所述重组微生物的构建方法，该方法包括：使所述重组微生物表达酶活性增强的喹啉酸合酶突变体，或者，增加所述喹啉酸合酶的编码基因的拷贝数，或者，将所述喹啉酸合酶的编码基因的转录和/或翻译调控元件替换为活性更高的调控元件。
48.优选地，所述方法包括将携带编码所述喹啉酸合酶突变体的基因的重组质粒导入出发菌株中。
49.优选地，所述重组质粒为可在菌体中发生同源重组的质粒，将质粒上的喹啉酸合酶突变体的编码基因与染色体上的同源基因进行交换。
50.进一步优选地，所述构建方法包括：
51.(1)构建含有编码所述喹啉酸合酶突变体的基因的重组质粒；
52.(2)将重组质粒转化出发菌株，用含抗生素的选择培养基筛选转化子；
53.(3)在阳性转化子中筛选发生目标突变的重组微生物。
54.本发明提供所述重组微生物的如下任一种应用：
55.(1)依赖还原力合成的代谢物的发酵生产；
56.(2)喹啉酸的发酵生产。
57.本发明所述的重组微生物可用于依赖还原力合成的代谢物的发酵生产，所述代谢物包括但不限于谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸，异亮氨酸等。
58.同样地，基于喹啉酸合酶突变体的功能，本领域技术人员可以理解，所述重组微生物也能够用于喹啉酸的发酵生产。
59.本发明提供一种生产依赖还原力合成的代谢物或喹啉酸的方法，该方法包括将所述重组微生物进行发酵培养的步骤。
60.优选地，当进行谷氨酸或喹啉酸的发酵时，发酵培养基包括如下组分：葡萄糖50
‑
60g/l，硫酸铵10
‑
20g/l，kh2po
4 0.5
‑
1.5g/l，mgso4·
7h2o 0.2
‑
0.5g/l，feso4·
7h2o 0.05
‑
0.15mg/l，mnso4·
5h2o 0.8
‑
1.2mg/l，vb
1 150
‑
250μg/l，生物素250
‑
350μg/l，大豆水解液0.3
‑
0.6g/l，ph 7.2
‑
7.5；
61.或者，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖15
‑
25g/l，玉米浆15
‑
25g/l，盐酸盐甜菜碱0.1
‑
0.3g/l，k2hpo
4 6
‑
8g/l，mgso4·
7h2o 1
‑
2g/l，v
b1 150
‑
250μg/l，v
h 550
‑
650μg/l，feso4·
7h2o 25
‑
35mg/l、mnso4·
h2o 25
‑
35mg/l，尿素0.4
‑
0.7g/l，ph 7.2
‑
7.5。
62.当进行赖氨酸的发酵培养时，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖55
‑
65g/l，(nh4)2so
4 22
‑
28g/l，kh2po41.5
‑
2.5g/l，mgso4·
7h2o 0.8
‑
1.2g/l，酵母粉8
‑
12g/l，caco
3 20
‑
30g/l，ph 6.8
‑
7.2。
63.具体地，所述生产依赖还原力合成的代谢物或喹啉酸的方法包括：将所述重组微生物接种至斜面培养基进行斜面培养，挑取斜面培养基上的菌苔接种至种子培养基进行种子培养，然后将种子培养物转入发酵培养基进行发酵。
64.当进行谷氨酸或喹啉酸的生产时，优选地，所述斜面培养基为：酵母粉5g/l，牛肉膏10g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉2.5g/l，ph 7.0
‑
7.2。
65.所述种子培养基为：葡萄糖25g/l，尿素3.0g/l，k2hpo4·
3h2o 2.2g/l，mgso4·
7h2o 0.9g/l，玉米浆33ml/l，豆饼水解液22ml/l，ph 7.0
‑
7.2。
66.所述发酵培养基为：葡萄糖60g/l，硫酸铵15g/l，kh2po
4 1.0g/l，mgso4·
7h2o 0.4g/l，feso4·
7h2o 1.0mg/l，mnso4·
5h2o 1.0mg/l，v
b1 200μg/l，生物素300μg/l，大豆水解液0.48g/l，ph 7.2
‑
7.5。
67.所述种子培养为31.5℃，220rpm下振荡培养至对数生长中后期，培养时间为10
‑
14h。
68.所述发酵为31.5℃，220rpm振荡培养12
‑
20h。
69.本发明的有益效果在于：本发明提供的喹啉酸合酶突变体具有显著增强的喹啉酸合酶的催化活性，能够增强微生物细胞nadh、nadph的合成能力，提高微生物细胞的还原力水平，进而能够显著促进依赖还原力合成的代谢物和喹啉酸的积累。本发明提供的表达该喹啉酸合酶突变体的重组微生物的还原力水平显著提高，有利于合成需要消耗还原力的代谢物(如谷氨酸)以及喹啉酸的产量和转化率的提升。
具体实施方式
70.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
71.以下实施例中涉及的引物名称及序列如表1所示。
72.表1引物序列
[0073][0074][0075]
实施例中涉及的菌株：
[0076]
以下实施例中涉及的菌株如下：
[0077]
出发菌株mhz
‑
0112
‑
8为谷氨酸棒杆菌，谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)mhz
‑
0112
‑
8的纯培养物已经于2015年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmcc no.11941。本发明所提及的谷氨酸棒杆菌mhz
‑
0112
‑
8(cgmcc no.11941)已在中国专利公布号cn 105695383 a中公开。
[0078]
在一些实施方案中，赖氨酸生产菌株引入nada基因点突变构建方法中使用的棒状细菌为保藏编号为cgmcc no.11942的谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)mhz
‑
0912
‑
6，该菌株已于2015年12月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.11942，该菌株已在专利cn105734004b中公开。
[0079]
实施例1重组质粒pk18
‑
nada(d312n)的构建
[0080]
根据ncbi数据库中nada(genbank no:ncgl1024)基因的序列设计引物，引物序列如表1所示。利用phusion超保真聚合酶(new england biolabs)，nada
‑
up
‑
1f/nada
‑
up
‑
1r，nada
‑
dn
‑
2f/nada
‑
dn
‑
2r作为引物对，以谷氨酸棒杆菌mhz
‑
0112
‑
08的基因组为模板，制备重组片段，pcr程序为：98℃变性10s，50℃复性20s，72℃延伸15s，循环30次，72℃彻底延伸10min，所得片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，随后以nada
‑
up
‑
1f/nada
‑
dn
‑
2r为引物对，以上下游同源臂为模板，制备重组片段，pcr程序为：98℃变性10s，50℃复性20s，72℃延伸30s，循环30次，72℃彻底延伸10min，所得重组片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，然后利用xbai/hindiii进行消化，同时将pk18
‑
mobsacb利用xbai/hindiii进行消化，并用t4 dna连接酶(transgen biotech)将片段与载体进行连接，转化trans1t1感受态细胞(transgen biotech)，挑取卡那抗性克隆，xbai/hindiii酶切鉴定得到片段插入pk18mobsacb的阳性克隆，进一步通过测序(invitrogen公司)鉴定插入的片段正确,将所得到的质粒命名为pk18
‑
nada
d312n
。
[0081]
实施例2 mhz
‑
0112
‑
8菌株引入nada基因点突变
[0082]
按照谷氨酸棒杆菌经典方法(c.glutamicum handbook,charpter 23)制备mhz
‑
0112
‑
8感受态细胞，将重组质粒pk18
‑
nada
d312n
以电转化方法转入谷氨酸棒杆菌mhz
‑
0112
‑
8感受态细胞中，在含有15mg/l的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。利用fast taq dna聚合酶(transgen biotech)，以nada
‑
up
‑
1f/p85，p82/nada
‑
dn
‑
2r引物对进行菌落pcr鉴定kan
r
克隆，pcr参数为：94℃30s，50℃30s，72℃35s，共30个循环，72℃彻底延伸10min。两对引物对扩增出1208bp、1103bp的片段的克隆为阳性克隆。将挑选出的阳性克隆接种到无抗bhi培养基中培养12
‑
14h，将菌液稀释100
‑
1000倍后涂布在含有10％蔗糖的固体bhi培养基上培养36h，将所筛选出的菌株进一步进行卡那抗性表型验证，挑选kan
s
的重组子利用鉴定引物对nada
‑
f/nada
‑
dn
‑
2r验证点突变重组子，通过摸索退火温度，获得含点突变的重组子，将得到的阳性重组子用id
‑
f/id
‑
r扩增测序，正确重组子长1116bp，测序正确的菌株命名为mhz
‑
0112
‑
9。
[0083]
实施例3 mhz
‑
0112
‑
9突变菌株生产谷氨酸和喹啉酸的性能验证
[0084]
对实施例2构建的重组谷氨酸棒杆菌进行发酵，验证其谷氨酸和喹啉酸的生产性能，具体如下：
[0085]
将冻存于
‑
80℃甘油管中的菌株接种于上述斜面培养基中进行活化，于31.5℃下培养24h后长出菌苔，从新鲜活化的斜面上挑取菌苔，接种于上述种子培养基中，于31.5℃，220rpm下振荡培养至对数生长中后期，培养时间为12h，制得种子液，以10％的接种量将上述种子液接种至装有20ml发酵培养基的500ml摇瓶中，在31.5℃，220rpm振荡培养16h。在葡萄糖被完全消耗之后，通过hplc方法测定培养基中积累的l
‑
谷氨酸和喹啉酸的浓度。
[0086]
培养基配方如下：
[0087]
斜面培养基：酵母粉5.0g/l，牛肉膏10g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉2.5g/l，ph 7.0
‑
7.2，121℃0.1mpa灭菌30min；
[0088]
种子培养基：葡萄糖25g/l，尿素3.0g/l，k2hpo4·
3h2o 2.2g/l，mgso4·
7h2o 0.9g/l，玉米浆33ml/l，豆饼水解液22ml/l，ph 7.0
‑
7.2，121℃0.1mpa灭菌15min；
[0089]
发酵培养基：葡萄糖60g/l，硫酸铵15g/l，kh2po
4 1.0g/l，mgso4·
7h2o 0.4g/l，feso4·
7h2o 1.0mg/l，mnso4·
5h2o 1.0mg/l，v
b1 200μg/l，生物素300μg/l，大豆水解液0.48g/l，用naoh调节至ph 7.2
‑
7.5，121℃0.1mpa灭菌15min，后添加1.0g热灭菌的碳酸钙。
[0090]
表2突变菌株谷氨酸和喹啉酸的含量检测
[0091][0092]
结果如表2所示(od
600
是稀释100倍的培养液在600nm的浊度并表示细胞量，glu(g/l)表示积累的l
‑
谷氨酸的量，qa(g/l)表示积累的喹啉酸的量)，在mhz
‑
0112
‑
9中nada的312位氨基酸由天冬氨酸(d)突变为天冬酰胺(n)，即gac突变为aac后，喹啉酸从0.06g/l提高到0.53g/l，谷氨酸从34.9g/l提高到35.4g/l，转化率提高1.2％。结果表明，本发明的喹啉酸合酶突变体可以提高菌株的喹啉酸和谷氨酸的合成。
[0093]
实施例4 mhz
‑
0112
‑
9菌株还原力nadh/nadph含量测定
7.5g/l，mgso4·
7h2o 1.5g/l，v
b1 200μg/l，vh 600μg/l，feso4·
7h2o 30mg/l、mnso4·
h2o 30mg/l，尿素0.55g/l，ph 7.2
‑
7.5。
[0106]
表4突变菌株谷氨酸和喹啉酸的含量检测
[0107][0108]
结果如表4所示(od
600
是稀释200倍的培养液在600nm的浊度并表示细胞量，glu(g/l)表示积累的l
‑
谷氨酸的量，qa(g/l)表示积累的喹啉酸的量)，在mhz
‑
0112
‑
9中nada的312位氨基酸由天冬氨酸(d)突变为天冬酰胺(n)，即gac突变为aac后，喹啉酸从0.18g/l提高到0.88g/l，谷氨酸从180.6g/l提高到187.5g/l，转化率从61.34％提高到63.59％，转化率提高了2.25％。结果表明，本发明的喹啉酸合酶突变体可以提高菌株的喹啉酸和谷氨酸的合成。
[0109]
实施例6赖氨酸生产菌株引入nada基因点突变
[0110]
按照谷氨酸棒杆菌经典方法(c.glutamicum handbook,charpter 23)制备cgmcc no.11942感受态细胞，将重组质粒pk18
‑
nada
d312n
以电转化方法转入谷氨酸棒杆菌cgmcc no.11942感受态细胞中，在含有15mg/l的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。利用fast taq dna聚合酶(transgen biotech)，以nada
‑
up
‑
1f/p85，p82/nada
‑
dn
‑
2r引物对进行菌落pcr鉴定kan
r
克隆，pcr参数为：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共30个循环，72℃彻底延伸10min。两对引物对扩增出1208bp、1103bp的片段的克隆为阳性克隆。将挑选出的阳性克隆接种到无抗bhi培养基中培养12～14h，将菌液稀释100
‑
1000倍后涂布在含有10％蔗糖的固体bhi培养基上培养36h，将所筛选出的菌株进一步进行卡那抗性表型验证，挑选kan
s
的重组子利用鉴定引物对nada
‑
f/nada
‑
dn
‑
2r验证点突变重组子，通过摸索退火温度，获得含点突变的重组子，将得到的阳性重组子用id
‑
f/id
‑
r扩增测序，正确重组子长1116bp，测序正确的菌株命名为mhz
‑
0112
‑
10。
[0111]
实施例7 mhz
‑
0112
‑
10突变菌株生产赖氨酸的性能验证
[0112]
对实施例6构建的重组谷氨酸棒杆菌进行发酵，验证其赖氨酸的生产性能，具体如下：
[0113]
将冻存于
‑
80℃甘油管中的菌株接种于上述斜面培养基中进行活化，于31.5℃下培养24h后长出菌苔，从新鲜活化的斜面上挑取菌苔，接种于上述种子培养基中，于31.5℃，220rpm下振荡培养至对数生长中后期，培养时间为12h，制得种子液，以10％的接种量将上述种子液接种至装有20ml发酵培养基的500ml摇瓶中，在31.5℃，220rpm振荡培养16h。在葡萄糖被完全消耗之后，通过hplc方法测定培养基中积累的赖氨酸的浓度。
[0114]
培养基配方如下：
[0115]
斜面培养基：酵母粉5.0g/l，牛肉膏10g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉2.5g/l，ph 7.0
‑
7.2，121℃0.1mpa灭菌30min；
[0116]
种子培养基：葡萄糖25g/l，尿素3.0g/l，k2hpo4·
3h2o 2.2g/l，mgso4·
7h2o 0.9g/l，玉米浆33ml/l，豆饼水解液22ml/l，ph 7.0
‑
7.2，121℃0.1mpa灭菌15min；
[0117]
发酵培养基：葡萄糖60g/l，(nh4)2so
4 25g/l，kh2po
4 2.0g/l，mgso4·
7h2o 1.0g/l，酵母粉10g/l，caco
3 30g/l，naoh调ph7.0。
[0118]
表5突变菌株赖氨酸的含量检测
[0119]
菌株od
600
(
×
100)lys(g/l)转化率％cgmcc no.119420.476
±
0.0318.2
±
0.1213.6
±
0.002mhz
‑
0112
‑
100.455
±
0.01210.8
±
0.0818.0
±
0.01
[0120]
结果如表5所示(od
600
是稀释100倍的培养液在600nm的浊度并表示细胞量，lys(g/l)表示积累的l
‑
赖氨酸的量。在mhz
‑
0112
‑
10中nada的312位氨基酸由天冬氨酸(d)突变为天冬酰胺(n)，即gac突变为aac后，赖氨酸从8.2g/l提高到10.8g/l，转化率从13.6％提高到18.0％，转化率提高了4.4％。结果表明，本发明的喹啉酸合酶突变体通过增加还原力的供应可以提高赖氨酸的产量。
[0121]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。