一种检测马来酸氯苯那敏的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种检测马来酸氯苯那敏的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.马来酸氯苯那敏(chlorphenamine maleate)，又名扑尔敏，化学名为n，n
‑
二甲基
‑7‑
(4
‑
氯苯基)
‑2‑
吡啶丙胺顺丁烯二酸盐，是一种组胺hl受体拮抗剂，能对抗过敏反应所导致的毛细血管扩张，具有明显的中枢抑制作用，能增加麻醉药、镇痛药、催眠药和局麻药的作用，临床上多用于皮肤过敏症，也常用于过敏性鼻炎、药物及食物过敏等。但是过量使用马来酸氯苯那敏，可能出现心悸、皮肤瘀斑、出血倾向。在市场监督管理局公布的检测公告中，部分不法商家受利益驱使，往凉茶中非法添加马来酸氯苯那敏，对消费者的身体带来潜在危害。
3.目前，我国并没有建立针对马来酸氯苯那敏的标准检测方法。而国内外相关文献中，对马来酸氯苯那敏的检测技术，主要包括有光谱法、非水酸碱滴定法、质谱法、色谱法及其联用技术等(李建定,王沛.马来酸氯苯那敏的检测方法[j].科技视界,2015(17):176 205.)。这些方法虽然准确度高，但仪器设备昂贵、样品前处理复杂繁琐、检测成本高且需要专业人员操作，不符合现场即时检测的要求，中国发明专利cn101865857a公开了利用沉淀作用检测非生物材料中的马来酸氯苯那敏的检测方法，该方法虽然适用于现场快速检测，但是仅仅使用于样品中马来酸氯苯那敏含量稍高的样品检测；中国发明专利cn102565042a公开了一种中成药和保健食品中掺杂马来酸氯苯那敏的快速筛查方法和快速半定量测定方法，该方法虽然可实现快速筛查，但仅仅能实现半定量的检测样品中的马来酸氯苯那敏的浓度，难以满足现场快速检测的食品监管需求。因此，急需开发一种快速、准确、高效、稳定的检测食品中马来酸氯苯那敏的方法。


技术实现要素：

[0004]
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中马来酸氯苯那敏检测方法的缺陷和不足，提供一种检测马来酸氯苯那敏的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。
[0005]
本发明的目的在于提供两种检测马来酸氯苯那敏的半抗原，半抗原1和半抗原2。
[0006]
本发明的目的还在于提供所述半抗原1、半抗原2在制备用于检测马来酸氯苯那敏的人工抗原中的应用。
[0007]
本发明的目的还在于提供用于检测马来酸氯苯那敏的人工抗原1和人工抗原2。
[0008]
本发明的目的还在于提供半抗原1、人工抗原1、半抗原2或人工抗原2在制备用于检测马来酸氯苯那敏的人工抗体中的应用。
[0009]
本发明的目的还在于提供一种检测马来酸氯苯那敏的抗体。
[0010]
本发明的目的还在于提供用于免疫检测马来酸氯苯那敏的人工抗原组。
[0011]
本发明的目的还在于提供一种检测马来酸氯苯那敏的试剂盒。
[0012]
本发明的目的还在于提供一种检测马来酸氯苯那敏的免疫分析方法。
[0013]
本发明的上述目的通过以下技术手段实现：
[0014]
本发明提供了一种检测马来酸氯苯那敏的半抗原1，所述半抗原1的结构式如式(i)所示：
[0015][0016]
所述半抗原1采用系统命名法为：4
‑
((4
‑
氯苯基)(吡啶
‑2‑
基)甲氧基)
‑4‑
氧代丁酸。
[0017]
本发明所述半抗原1的制备方法为：
[0018]
将(4
‑
氯苯基)(吡啶
‑2‑
基)甲醇、三乙胺、4
‑
二甲氨基吡啶溶于溶剂无水吡啶中，然后添加丁二酸酐，搅拌反应后分离纯化即可得到半抗原1。
[0019]
优选地，所述搅拌反应的温度为80～90℃，时间为3～5h。
[0020]
所述半抗原1在制备用于检测马来酸氯苯那敏的人工抗原中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0021]
本发明还提供了一种检测马来酸氯苯那敏的半抗原2，其结构式如式(ii)所示：
[0022][0023]
所述半抗原2采用系统命名法为：4
‑
((4
‑
氯苯基)(吡啶
‑2‑
基)甲氧基)甲基)苯甲酸。
[0024]
本发明所述半抗原2的制备方法为：
[0025]
s1.将(4
‑
氯苯基)(吡啶
‑2‑
基)甲醇、氢化钠溶于溶剂无水乙腈中，搅拌反应后加入4
‑
溴甲基苯甲酸甲酯，继续搅拌反应后分离纯化；
[0026]
s2.将步骤s1分离纯化的产物溶于溶解于溶剂甲醇中，然后加入氢氧化钠/碱性水溶液搅拌反应，反应结束后调酸即得半抗原2。
[0027]
优选地，所述步骤s1中溶于溶剂无水乙腈的溶解液先在常温下搅拌反应30min，加
入4
‑
溴甲基苯甲酸甲酯后搅拌反应1h，然后升温至75℃继续反应2h。
[0028]
优选地，所述步骤s2中氢氧化钠水溶液浓度为1mol/l。
[0029]
优选地，所述步骤s2中搅拌反应为室温下搅拌反应3～5h。
[0030]
优选地，所述步骤s2中调酸是利用1mol/l盐酸调节ph为6～7。
[0031]
所述半抗原2在制备用于检测马来酸氯苯那敏的人工抗原中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0032]
本发明还提供了两种用于检测马来酸氯苯那敏的人工抗原，人工抗原1和人工抗原2，所述人工抗原1结构式如式(iii)所示：
[0033][0034]
所述人工抗原2结构式如式(iv)所示：
[0035][0036]
所述人工抗原1的制备方法，由所述半抗原1(peo)通过碳二亚胺法偶联载体蛋白得到。
[0037]
所述人工抗原2的制备方法，由所述半抗原2(pb1)通过活泼酯法偶联载体蛋白得到。
[0038]
优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(bovine serum albumin,bsa)、钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,klh)、乳铁蛋白(lactoferrin,lf)或者鸡卵清白蛋白(ovalbumin,ova)任意一种或几种。
[0039]
作为上述方法的一个具体实施方式，人工抗原1的制备方法，包括如下步骤：
[0040]
s1.将载体蛋白溶解于pbs缓冲液(0.01mol/l，ph＝7.4)中，得到载体蛋白溶液；
[0041]
s2.将半抗原1(peo)溶解于n,n
‑
二甲基甲酰胺(dmf)中，得到半抗原peo溶液；
[0042]
s3.将步骤s2的半抗原peo溶液与步骤s1载体蛋白溶液混合，在加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)干粉，室温下避光搅拌12h；
[0043]
s4.用pbs缓冲液透析步骤s3所得反应液即得人工抗原1。
[0044]
优选地，步骤s4所述透析为透析2天，每天换液4次。
[0045]
优选的，步骤(1)中所述半抗原1(peo)与edc的摩尔质量比为1:1.5～3。
[0046]
更优选的，步骤(1)中所述半抗原1(peo)与edc的摩尔质量比为1:2。
[0047]
优选的，步骤(2)中所述载体蛋白与磷酸盐缓冲液的质量体积比为10mg:1ml。
[0048]
优选的，步骤(1)中所述半抗原1(peo)与步骤(2)中所述载体蛋白的摩尔质量比为1～2:1～4。
[0049]
更优选的，步骤(1)中所述半抗原1(peo)与步骤(2)中所述载体蛋白的摩尔质量比为1:2。
[0050]
作为上述方法的一个具体实施方式，人工抗原2的制备方法，包括如下步骤：
[0051]
(1)将半抗原2(pb1)与nhs和edc溶解于dmf中，室温下避光搅拌2～4h，得到半抗原pb1活化液；
[0052]
(2)将载体蛋白加入到pbs缓冲液(0.01mol/l，ph＝7.4)中；
[0053]
(3)将半抗原pb1活化液缓慢逐滴加入步骤(2)的载体蛋白溶液中，4℃反应12h；
[0054]
(4)用pbs缓冲液透析步骤(3)所得反应液即得人工抗原2。
[0055]
优选的，步骤(1)中所述半抗原2、nhs与edc的摩尔质量比为1:1.1～2:1～2.1。
[0056]
更优选的，步骤(1)中所述半抗原2、nhs与edc的摩尔质量比为1:1.4:1.6。
[0057]
优选的，步骤(2)中所述载体蛋白与磷酸盐缓冲液的质量体积比为10mg:1ml。
[0058]
优选的，步骤(1)中所述半抗原2与步骤(2)中所述载体蛋白的摩尔质量比为1～2:1～4。
[0059]
更优选的，步骤(1)中所述半抗原2(pb1)与步骤(2)中所述载体蛋白的摩尔质量比为1:2。
[0060]
一种检测马来酸氯苯那敏的人工抗原组，以载体蛋白为钥孔血蓝蛋白的人工抗原1(peo
‑
klh)或人工抗原2(pb1
‑
klh)或以载体蛋白为乳铁蛋白的人工抗原1(peo
‑
lf)作为免疫原，以载体蛋白为牛血清白蛋白或乳铁蛋白的人工抗原1(peo
‑
bsa或peo
‑
lf)作为包被原。
[0061]
优选地，所述人工抗原组以载体蛋白为钥孔血蓝蛋白的人工抗原2(pb1
‑
klh)作为免疫原，以载体蛋白为牛血清白蛋白的人工抗原1(peo
‑
bsa)作为包被原。
[0062]
所述人工抗原组在检测马来酸氯苯那敏中的应用，也在本发明的保护范围之内。
[0063]
优选地，所述人工抗原组在检测食品中马来酸氯苯那敏中的应用。
[0064]
一种检测马来酸氯苯那敏的特异性抗体，所述抗体由人工抗原1或人工抗原2免疫动物制备得到。
[0065]
优选地，所述抗体由人工抗原2免疫动物制备得到。
[0066]
优选地，所述特异性抗体为单克隆抗体、多克隆抗体中一种或两种。
[0067]
所述抗体在检测马来酸氯苯那敏中的应用，也在本发明的保护范围之内。
[0068]
优选地，所述抗体在检测食品中马来酸氯苯那敏的应用。
[0069]
一种检测马来酸氯苯那敏的试剂盒，包含以载体蛋白为钥孔血蓝蛋白的人工抗原1(peo
‑
klh)或人工抗原2(pb1
‑
klh)或以载体蛋白为乳铁蛋白的人工抗原1(peo
‑
lf)作为免疫原，以载体蛋白为牛血清白蛋白或乳铁蛋白的人工抗原1(peo
‑
bsa或peo
‑
lf)作为包被原的人工抗原组和人工抗原1(peo
‑
klh或peo
‑
lf)或人工抗原2(pb1
‑
klh)免疫动物制备得到
的特异性抗体。
[0070]
优选地，所述试剂盒包含以载体蛋白为钥孔血蓝蛋白的人工抗原2(pb1
‑
klh)作为免疫原，以载体蛋白为牛血清白蛋白的人工抗原1(peo
‑
bsa)作为包被原的人工抗原组和人工抗原2(pb1
‑
klh)免疫动物制备得到的特异性抗体。
[0071]
进一步优选地，所述试剂盒包含：包被有人工抗原的酶标板、马来酸氯苯那敏标准品溶液、马来酸氯苯那敏抗体、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液；所述包被人工抗原为peo
‑
载体蛋白；所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的马来酸氯苯那敏抗体。
[0072]
一种马来酸氯苯那敏胶体金免疫层析试纸条，包括衬板1和依次排列在衬板1上的样品垫2、金标结合物垫3、纤维素膜4和吸水垫7，所述金标结合物垫3内吸附有胶体金标记的人工抗原1(peo
‑
klh或peo
‑
lf)或人工抗原2(pb1
‑
klh)免疫动物制备得到的特异性抗体，所述纤维素膜4上印有隐形检测线5和隐形质控线6，所述隐形检测线5采用包被抗原溶液印制，所述隐形质控线6采用羊抗兔抗体印制；所述包被抗原为以载体蛋白为牛血清白蛋白或乳铁蛋白的人工抗原1(peo
‑
bsa或peo
‑
lf)。
[0073]
优选地，所述金标结合物垫3内吸附有胶体金标记的人工抗原2(pb1
‑
klh)免疫动物制备得到的特异性抗体；所述包被抗原为以载体蛋白为牛血清白蛋白的人工抗原1(peo
‑
bsa)。
[0074]
一种检测马来酸氯苯那敏的免疫分析方法，以载体蛋白为牛血清白蛋白或乳铁蛋白的人工抗原1(peo
‑
bsa或peo
‑
lf)作为包被原，以载体蛋白为钥孔血蓝蛋白的人工抗原1(peo
‑
klh)或人工抗原2(pb1
‑
klh)或以载体蛋白为乳铁蛋白的人工抗原1(peo
‑
lf)作为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
[0075]
优选地，以载体蛋白为牛血清白蛋白的人工抗原1(peo
‑
bsa)作为包被原，以载体蛋白为钥孔血蓝蛋白的人工抗原2(pb1
‑
klh)作为免疫原免疫动物制备得到的特异性抗体为检测抗体进行检测。
[0076]
所述免疫分析方法包括但不局限于酶免疫分析、免疫层析、免疫传感、免疫胶体金等。
[0077]
相比现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0078]
本发明制备得到了马来酸氯苯那敏半抗原1和半抗原2，应用半抗原1和半抗原2偶联载体蛋白得到人工抗原，应用半抗原2制备得到用于检测马来酸氯苯那敏的抗体，应用半抗原1制备得到用于包被的人工抗原1，该抗体对马来酸氯苯那敏具有高灵敏度和高特异性的识别能力，半抑制浓度为1.16ng/ml，最低检测限为0.06ng/ml，对其类似物无交叉反应或交叉反应率小于0.01％，可有效的排除其类似物的干扰，为建立马来酸氯苯那敏的酶联免疫检测方法提供了核心材料。本发明建立了一种凉茶中马来酸氯苯那敏的免疫快速检测方法，具有特异性强、灵敏度高、检测时间短、成本低，对操作人员技能要求较低等优点，适用于现场大量样品的快速检测。而上述方法建立的关键在于设计出合适的马来酸氯苯那敏半抗原及人工抗原并获得灵敏度高、特异性强的抗体。另外，本发明利用马来酸氯苯那敏抗体开发了马来酸氯苯那敏免疫检测试剂盒在食品中马来酸氯苯那敏的免疫快速检测中的应用。本发明开发的酶联免疫试剂盒和胶体金免疫层析试纸条能够特异性识别马来酸氯苯那敏，对马来酸氯苯那敏的检测灵敏度高。
附图说明
[0079]
图1为马来酸氯苯那敏半抗原1(peo)的合成路线。
[0080]
图2为马来酸氯苯那敏半抗原2(pb1)的合成路线。
[0081]
图3为马来酸氯苯那敏人工抗原pb1
‑
klh的合成路线。
[0082]
图4为马来酸氯苯那敏人工抗原peo
‑
bsa的合成路线。
[0083]
图5为实施例4中klh、pb1与pb1
‑
klh的紫外光谱图。
[0084]
图6为实施例4中bsa、peo与peo
‑
bsa紫外光谱图。
[0085]
图7为马来酸氯苯那敏抗体对马来酸氯苯那敏的标准抑制曲线。
[0086]
图8为马来酸氯苯那敏胶体金免疫层析试纸条的侧面示意图，其中1：衬板；2：样品垫；3：金标结合物垫；4：纤维素膜；5：隐形检测线；6：隐形质控线；7：吸水垫。
[0087]
图9为马来酸氯苯那敏胶体金免疫层析试纸条检测结果判定图。
具体实施方式
[0088]
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0089]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0090]
实施例1马来酸氯苯那敏半抗原的合成与鉴定
[0091]
利用马来酸氯苯那敏结构的特征，在试验数据的基础上，设计了2种人工半抗原。
[0092]
1、半抗原peo的合成与鉴定(合成路线见图1)
[0093]
取(4
‑
氯苯基)(吡啶
‑2‑
基)甲醇(1mol)，三乙胺(3mol)，4
‑
二甲氨基吡啶(3mol)，以无水吡啶作为溶剂，与丁二酸酐(1.5mol)在80
‑
90℃搅拌下反应3～5h，分离纯化即可得到半抗原peo。
[0094]
半抗原peo质谱结果：ms：c
16
h
14
clno4：319.06，esi
‑
[m
‑
h]
‑
:：318.0。
[0095]
半抗原peo核磁结果：1h nmr(500mhz,chloroform
‑
d)δ8.66(dd,j＝4.4,1.7hz,1h),7.65(td,j＝7.2,1.7hz,1h),7.57
–
7.48(m,2h),7.40
–
7.30(m,4h),7.05(s,1h),2.79
–
2.68(m,2h),2.68
–
2.57(m,2h).
[0096]
半抗原peo的结构式如式(i)所示：
[0097][0098]
半抗原peo采用系统命名法命名为：4
‑
((4
‑
氯苯基)(吡啶
‑2‑
基)甲氧基)
‑4‑
氧代丁酸。
[0099]
2、半抗原pb1的合成与鉴定(合成路线见图2)
[0100]
(1)取(4
‑
氯苯基)(吡啶
‑2‑
基)甲醇(1mol)，氢化钠(1.3mol)，以无水乙腈作为溶
剂，常温下搅拌反应30min后，加入4
‑
溴甲基苯甲酸甲酯(1.5mol)搅拌反应1h，然后升温至75℃继续反应2h，停止反应，然后分离纯化。
[0101]
(2)将分离纯化后的产物溶解于5ml甲醇中，加入1mol/l的氢氧化钠水溶液在室温下搅拌反应3～5h，反应结束后用1mol/l盐酸调节ph为6～7，即得半抗原pb1。
[0102]
半抗原pb1质谱结果：ms：c
20
h
16
clno3：353.08，esi
‑
[m
‑
h]
‑
：：352.1。
[0103]
半抗原pb1核磁结果：1h nmr(500mhz，chloroform
‑
d)δ9.63(s，1h)，8.65(dd，j＝4.4，1.7hz，1h)，7.99
‑
7.93(m，2h)，7.63(td，j＝7.3，1.7hz，1h)，7.51(ddd，j＝7.1，4.4，1.3hz，1h)，7.45(dd，j＝7.4，1.4hz，1h)，7.42
‑
7.30(m，6h)，5.98(s，1h)，4.71(t，j＝1.0hz，2h).
[0104]
半抗原pb1的结构式如式(ii)所示：
[0105][0106]
半抗原pb1采用系统命名法命名为：4
‑
((4
‑
氯苯基)(吡啶
‑2‑
基)甲氧基)甲基)苯甲酸。
[0107]
实施例2马来酸氯苯那敏人工抗原1的合成
[0108]
1、马来酸氯苯那敏人工抗原1的合成
[0109]
马来酸氯苯那敏人工抗原1的合成方法，包括：
[0110]
将半抗原peo通过碳二亚胺法偶联载体蛋白。将4mol载体蛋白溶解于500μl的pbs缓冲液(0.01mol/l，ph＝7.4)中，得到载体蛋白溶液；称取1mol半抗原peo溶解于300μl dmf中，得到peo溶液；将peo溶液与载体蛋白溶液混合，往混合液中加入1.5mol edc干粉，在室温下避光搅拌12h；然后用pbs缓冲液透析2天，每天4次，透析结束后即得马来酸氯苯那敏人工抗原peo
‑
载体蛋白，分装于离心管中，于
‑
20℃保存，备用。
[0111]
(2)将半抗原pb1通过活泼酯法偶联载体蛋白，称取1mol半抗原pb1，1.1mol nhs和1mol edc溶解于50～200μl dmf中，室温下避光搅拌2～4h，得到pb1活化液；将4mol载体蛋白溶解于1ml的pbs缓冲液(0.01mol/l，ph＝7.4)中，再将pb1活化液室温下缓慢逐滴加入，4℃反应12h；用pbs缓冲液透析2天，每天4次，透析结束后即得马来酸氯苯那敏人工抗原pb1
‑
载体蛋白，分装于离心管中，于
‑
20℃保存，以供使用。
[0112]
其中，pbs缓冲液的配方：na2hpo4·
12h2o 2.90g，nacl 8.50g，kcl 0.20g，kh2po
4 0.20g，加蒸馏水定容至1000ml。
[0113]
实施例3马来酸氯苯那敏人工抗原的合成
[0114]
1、马来酸氯苯那敏人工抗原的合成
[0115]
马来酸氯苯那敏人工抗原的合成方法，包括：
[0116]
(1)将半抗原peo通过碳二亚胺法偶联载体蛋白。将0.5mol载体蛋白溶解于500μl
的pbs缓冲液(0.01mol/l，ph＝7.4)中，得到载体蛋白溶液；称取1mol半抗原peo溶解于300μl dmf中，得到peo溶液；将peo溶液与载体蛋白溶液混合，往混合液中加入3mol edc干粉，在室温下避光搅拌12h；然后用pbs缓冲液透析2天，每天4次，透析结束后即得马来酸氯苯那敏人工抗原peo
‑
载体蛋白，分装于离心管中，于
‑
20℃保存，备用。
[0117]
(2)将半抗原pb1通过活泼酯法偶联载体蛋白，称取1mol半抗原pb1，2mol nhs和2.1mol edc溶解于50～200μl dmf中，室温下避光搅拌2～4h，得到pb1活化液；将0.5mol载体蛋白溶解于1ml的pbs缓冲液(0.01mol/l，ph＝7.4)中，再将pb1活化液室温下缓慢逐滴加入，4℃反应12h；用pbs缓冲液透析2天，每天4次，透析结束后即得马来酸氯苯那敏人工抗原pb1
‑
载体蛋白，分装于离心管中，于
‑
20℃保存，以供使用。
[0118]
其中，pbs缓冲液的配方：na2hpo4·
12h2o 2.90g，nacl 8.50g，kcl 0.20g，kh2po
4 0.20g，加蒸馏水定容至1000ml。
[0119]
实施例4马来酸氯苯那敏人工抗原的合成和鉴定
[0120]
1、马来酸氯苯那敏人工抗原的合成
[0121]
马来酸氯苯那敏人工抗原的合成方法，包括：
[0122]
(1)将半抗原peo通过碳二亚胺法偶联载体蛋白。将2mol载体蛋白溶解于500μl的pbs缓冲液(0.01mol/l，ph＝7.4)中，得到载体蛋白溶液；称取1mol半抗原peo溶解于300μl dmf中，得到peo溶液；将peo溶液与载体蛋白溶液混合，往混合液中加入2mol edc干粉，在室温下避光搅拌12h；然后用pbs缓冲液透析2天，每天4次，透析结束后即得马来酸氯苯那敏人工抗原peo
‑
载体蛋白，分装于离心管中，于
‑
20℃保存，备用。
[0123]
(2)将半抗原pb1通过活泼酯法偶联载体蛋白，称取1mol半抗原pb1，1.4mol nhs和1.6mol edc溶解于50～200μl dmf中，室温下避光搅拌2～4h，得到pb1活化液；将2mol载体蛋白溶解于1ml的pbs缓冲液(0.01mol/l，ph＝7.4)中，再将pb1活化液室温下缓慢逐滴加入，4℃反应12h；用pbs缓冲液透析2天，每天4次，透析结束后即得马来酸氯苯那敏人工抗原pb1
‑
载体蛋白，分装于离心管中，于
‑
20℃保存，以供使用。
[0124]
其中，pbs缓冲液的配方：na2hpo4·
12h2o 2.90g，nacl 8.50g，kcl 0.20g，kh2po
4 0.20g，加蒸馏水定容至1000ml。
[0125]
其中，最佳组合的两种马来酸氯苯那敏人工抗原为4
‑
((4
‑
氯苯基)(吡啶
‑2‑
基)甲氧基)甲基)苯甲酸
‑
klh(pb1
‑
klh)(合成路线见图3)和4
‑
((4
‑
氯苯基)(吡啶
‑2‑
基)甲氧基)
‑4‑
氧代丁酸
‑
bsa(peo
‑
bsa)(合成路线见图4)(详见实施例6)。
[0126]
具体地，图3为半抗原4
‑
((4
‑
氯苯基)(吡啶
‑2‑
基)甲氧基)甲基)苯甲酸通过活泼酯法偶联钥孔血蓝蛋白(klh)，合成得到人工抗原为4
‑
((4
‑
氯苯基)(吡啶
‑2‑
基)甲氧基)甲基)苯甲酸
‑
klh。
[0127]
图4为半抗原4
‑
((4
‑
氯苯基)(吡啶
‑2‑
基)甲氧基)
‑4‑
氧代丁酸通过碳二亚胺法偶联牛血清白蛋白(bsa)，合成得到4
‑
((4
‑
氯苯基)(吡啶
‑2‑
基)甲氧基)
‑4‑
氧代丁酸
‑
bsa。
[0128]
2、马来酸氯苯那敏人工抗原的鉴定
[0129]
(1)取上述合成的pb1
‑
klh，进行紫外扫描，结果如图5所示。
[0130]
具体地，klh、pb1、pb1
‑
klh分别进行紫外(200～400nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现马来酸氯苯那敏免疫原pb1
‑
klh的吸收曲线与载体蛋白klh明显不同，pb1在280nm有一个明显的特征吸光值，而偶联反应后，在280nm处，pb1
‑
klh的
吸光值升高，明显比klh在280nm的吸光值高。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的吸光值变化是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白与pb1的复合物，偶联成功。
[0131]
(2)取上述合成的peo
‑
bsa，进行紫外扫描，结果如图6所示。
[0132]
具体地，bsa、peo、peo
‑
bsa分别进行紫外(200～400nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现马来酸氯苯那敏免疫原peo
‑
bsa的吸收曲线与载体蛋白bsa明显不同，peo在230nm和260nm处各有一个特征峰，而偶联反应后，在240nm和260nm处，peo
‑
bsa的吸光值虽未有明显变化，但对比peo的曲线可看出在240nm处吸光值显著升高，且在280nm处的吸收值也明显升高。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的吸光值变化是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白与peo的复合物，偶联成功。
[0133]
实施例5马来酸氯苯那敏抗体的制备
[0134]
1、多克隆抗体制备
[0135]
用实施例4制备的人工抗原pb1
‑
klh与免疫佐剂(第一次免疫用完全弗氏佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)按体积比1:1乳化均匀，免疫新西兰大白兔。所述新西兰大白兔体重为2.5～3kg，采用颈部和背部皮下多点注射，4周后第二次免疫，以后每间隔3周加强免疫一次。第三次加强免疫后1周耳缘静脉取血，并利用间接竞争elisa测定血清效价。当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。一周后心脏采血，收集到的血获得血清的方式为：在37℃下温浴0.5～1h，然后在4℃下静置过夜，再用胶头滴管吸取析出来的血清，接着在4℃下，3000～5000rpm离心10min，取上清。抗血清采用辛酸
‑
硫酸铵沉淀法纯化得到多克隆抗体，于
‑
20℃冻存备用。
[0136]
2、单克隆抗体制备
[0137]
用实施例4制备得到的人工抗原pb1
‑
klh免疫雌性bal b/c小鼠。取人工抗原pb1
‑
klh与等体积的免疫佐剂(首次免疫用完全弗氏佐剂，加强免疫均用弗氏不完全佐剂)乳化均匀后，采用腹部皮下多点注射法免疫小鼠，每次加强免疫1周后，尾部取血测定抗血清效价。待效价稳定不变时，选取免疫效果最好的小鼠加强一次免疫，3天后取脾细胞进行融合，制备单克隆抗体。
[0138]
实施例6马来酸氯苯那敏抗体的灵敏度及特异性测定
[0139]
1、马来酸氯苯那敏免疫原及包被原组合选择
[0140]
采用间接竞争elisa方法检测各组合的效价及抑制率，并根据结果筛选最优组合。
[0141]
表1马来酸氯苯那敏4组免疫原和包被原组合的效价和抑制率数据
[0142][0143]
马来酸氯苯那敏4组免疫原及包被原组合的效价及抑制率检测结果如表1所示。通
过对不同的免疫原及包被原组合进行筛选后，最佳组合为：以pb1
‑
klh为免疫原和以peo
‑
bsa为包被原。在该组合下，所述抗体可以特异性识别目标分析物马来酸氯苯那敏，且抗体灵敏度较好。
[0144]
2、马来酸氯苯那敏抗体灵敏度测定
[0145]
马来酸氯苯那敏抗体灵敏度的测定，通过建立马来酸氯苯那敏抗体(elisa)标准曲线并求出半数抑制量浓度(ic
50
)来表示。
[0146]
标准曲线建立具体步骤包括：
[0147]
(1)将实施例3制备的马来酸氯苯那敏多克隆抗体用pbst稀释为1:8000，同时设置空白对照孔(用pbst代替)；
[0148]
(2)将马来酸氯苯那敏人工抗原peo
‑
bsa用包被液稀释至125ng/ml的浓度，包被96孔酶标板，每孔加入100μl，37℃恒温水浴箱温育12h，弃去包被液，用pbst(0.01m pbs，0.06％tween
‑
20(v/v))洗涤2次，拍干；
[0149]
(3)每孔加入120μl封闭液(1％的鱼胶蛋白溶液)，37℃封闭3h，弃去封闭液，拍板，在干燥箱37℃烘干备用；
[0150]
(4)用pbst将马来酸氯苯那敏稀释至200000，10000，500，25，1.25，0.0625，0.003125ng/ml；
[0151]
(5)每行加50μl马来酸氯苯那敏稀释液，浓度分别为200000，10000，500，25，1.25，0.0625，0.003125ng/ml(三组平行)，浓度为0ng/ml的孔加入50μl/孔pbst稀释液，再加入步骤(1)所述马来酸氯苯那敏抗体稀释液，每孔加50μl。在37℃下温育40min后，弃去孔中液体，用pbst(0.01m pbs，0.06％tween
‑
20(v/v))洗涤5次，拍干；
[0152]
(6)加入羊抗兔二抗igg
‑
hrp(5000倍稀释)，在37℃下温育30min后，弃去孔中液体，用pbst(0.01m pbs，0.06％tween
‑
20(v/v))洗涤5次，拍干；
[0153]
(7)每孔加100μl显色液，在37℃下温育显色10min；
[0154]
(8)每孔加入50μl终止液(10％h2so4)终止反应，并用酶标仪在450nm处读取od值；
[0155]
其中pbst的配方为：na2hpo4·
12h2o 14.50g，nacl 42.50g，kcl 1.00g，kh2po
4 1.00g，tween
‑
20 3.0ml，加蒸馏水定容至5000ml。
[0156]
1％的鱼胶蛋白溶液配制：将0.01g鱼胶蛋白粉溶解于1ml pbst中，具体的按实际用量计算。
[0157]
以od值为纵坐标，相应的标准品浓度对数值为横坐标，应用origin软件四参数对函数进行曲线拟合：y＝(a
‑
d)/[1 (x/c)b] d，其中，a和d分别代表药物浓度最小和最大的吸光值(od)，c为中点浓度，当标准品浓度等于c时的od值为(a d)/2，正处于曲线的拐点处，半数抑制量浓度为ic
50
，b表示曲线的陡峭程度，称斜率因子：以标准曲线中ic
10
所对应的药物浓度为检测限，以ic
20
～ic
80
为检测范围。
[0158]
以马来酸氯苯那敏为标准品建立elisa的标准曲线，最低检测限为0.06ng/ml，半抑制浓度为1.16ng/ml。结合图7可知，以马来酸氯苯那敏为标准品建立的标准曲线具备典型的s型曲线，检测灵敏度好。
[0159]
3、马来酸氯苯那敏抗体特异性测定
[0160]
通过马来酸氯苯那敏与其类似物进行交叉反应实验来确定马来酸氯苯那敏抗体的特异性，用交叉反应率(cr)表示抗体的特异性，交叉反应越小，特异性越好。
[0161]
将马来酸氯苯那敏及其类似物作为竞争抗原，分别做系列稀释，采用间接竞争elisa方法测定，步骤参考灵敏度验证的实验方法，得到各类似物的ic
50
值。用以下公式计算马来酸氯苯那敏和各类似物的交叉反应率(cr)：
[0162][0163]
马来酸氯苯那敏与其类似物交叉反应实验结果如表2所示。
[0164]
表2马来酸氯苯那敏与其类似物交叉反应实验结果
[0165]
[0166][0167]
注：nr表示无反应。
[0168]
从表2可知，马来酸氯苯那敏抗体对马来酸氯苯那敏的交叉反应率为100％，ic
50
值为1.16ng/ml，但对结构类似物无交叉反应或交叉反应率均低于0.01％，说明马来酸氯苯那敏抗体对马来酸氯苯那敏具有极高的特异性，可有效的排除类似物的干扰，可专门用于马来酸氯苯那敏的检测。
[0169]
以上结果说明：本发明制备得到的马来酸氯苯那敏抗体对马来酸氯苯那敏具有很强的检测特异性。
[0170]
实施例7马来酸氯苯那敏酶联免疫试剂盒开发
[0171]
1、酶结合物
[0172]
用辣根过氧化物酶标记实施例3制备的马来酸氯苯那敏抗体。
[0173]
2、酶标板的制备
[0174]
用包被缓冲液将peo
‑
bsa稀释成1μg/ml，每孔加入100μl，37℃避光孵育过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入120μl封闭液，25℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。
[0175]
3、检测马来酸氯苯那敏的酶联免疫试剂盒的组建
[0176]
组建检测马来酸氯苯那敏的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：
[0177]
(1)包被原peo
‑
bsa处理过的酶标板；
[0178]
(2)马来酸氯苯那敏标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/l，1.25μg/l，25μg/l，500μg/l，10000μg/l，200000μg/l。
[0179]
(3)酶结合物：辣根过氧化物酶标记的马来酸氯苯那敏抗体。
[0180]
(4)底物显色液由a液和b液组成，a液为过氧化脲，b液为四甲基联苯胺；
[0181]
(5)终止液为10％硫酸；
[0182]
(6)洗涤液为ph值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温
‑
20、0.01
‰
～0.03
‰
叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/l的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；
[0183]
4、实际样品检测
[0184]
将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。根据需要量将酶结合物浓缩液用酶结合物稀释液按1:11体积比进行稀释(即1份酶结合物浓缩液加入11份酶结合物稀释液，现配现用)。加入标准品/样本50μl到对应的微孔中，然后加入酶结合物工作液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应35min。将孔内液体甩干，加入洗涤工作液300μl/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。加入底物液a液50μl/孔，再加入底物液b液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应10min。加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔od值。
[0185]
5、检测结果分析
[0186]
标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准品(0标准)的吸光度值的平均值，再乘以100％，得到标准品或样本的百分吸光度值。以标准品百分吸光率为纵坐标，以马来酸氯苯那敏标准品浓度(μg/l)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中马来酸氯苯那敏的实际浓度。
[0187]
由图7可知，马来酸氯苯那敏抗体的半抑制浓度(ic
50
)为1.16ng/ml，最低检测限为0.06ng/ml；说明本发明制备得到的马来酸氯苯那敏抗体能够满足检测要求，且对马来酸氯苯那敏具有高灵敏度的识别能力，对马来酸氯苯那敏的检测灵敏度高。
[0188]
6、添加回收实验
[0189]
选取市售散装凉茶为加标样本，包括感冒茶、感冒咽喉茶、咽炎茶、清热解毒茶共4类，分别以3种浓度0.05、0.10和0.20mg/l加标，设置未加标样品且经验证不含马来酸氯苯那敏。试样提取方法：取10g(精确到0.001g)试样于100ml干燥烧杯中，准确加入40g超纯水，振荡摇匀，然后静置10min，取上清液备用。
[0190]
按以下回收率公式计算：回收率＝(加标样品马来酸氯苯那敏检出浓度
‑
未加标样品马来酸氯苯那敏检出浓度)/加标浓度
×
100％。
[0191]
添加回收实验的结果如表3所示。
[0192]
表3样本添加回收试验结果
[0193][0194]
结果显示感冒茶、感冒咽喉茶、咽炎茶、清热解毒茶4种样品的添加回收率均在80％～120％之间，变异系数均小于10％，证明试剂盒的精密度高，稳定性好，能满足马来酸氯苯那敏的检测要求。
[0195]
实施例8马来酸氯苯那敏胶体金免疫层析试纸条开发
[0196]
1、金标抗体和金标结合物垫的制备
[0197]
采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法，制备平均直径在40nm的胶体金悬浮液。
[0198]
先将胶体金用0.2mol的k2co3溶液调节ph至8.5，然后采用经典nacl滴定法确定抗体标记量，最终选择将20μg实施例3所制备的马来酸氯苯那敏抗体和1ml胶体金溶液进行标记，得到金标抗体，4℃保存。用xyz
‑
3000三维喷膜仪把4％的bsa溶液以8μl/cm的量喷在玻璃棉上，使用干燥箱42℃干燥50min，再把金标抗体以6μl/cm的量喷在玻璃棉上，用干燥箱42℃干燥50min后真空干燥保存。
[0199]
2、偶联抗原羊抗兔包被纤维素膜
[0200]
用xyz
‑
3000三维喷膜仪把浓度为1mg/ml的包被抗原以1.2μl/cm的量喷在纤维素膜的偏下侧，作为检测线。用xyz
‑
3000三维喷膜仪把浓度为120μg/l的羊抗兔igg以1.2μl/cm的量喷在纤维素膜的偏上侧，作为对照线，两线间隔8mm。
[0201]
3、快速试纸条的组装
[0202]
如图8所示，把纤维素膜4粘贴在衬板1中间部位上，吸水垫7粘贴在纤维素膜4上侧
和纤维素膜4重叠1mm。金标结合物垫3粘贴在纤维素膜4下方重叠1mm。样品垫2粘贴在金标结合物垫3下方重叠2mm。组装好的试纸板用斩切机切成3.05mm宽的试纸条。
[0203]
4、检测样品液的制备
[0204]
1)液体样品1～4制备
[0205]
样品1为林氏凉茶、样品2为黄振龙凉茶、样品3为山草堂凉茶、样品4为平安堂凉茶。称取2g样品溶液于100ml容量瓶中，再用超纯水定容至刻度，即得液体样品1～4，备用。
[0206]
5、快速检测试纸条检测及判断
[0207]
当待测样品溶液加入试纸条或试纸卡测试端后，待测溶液通过虹吸作用带动待测物及金标结合物垫3中的金标抗体一起向纤维素膜4扩散，并最终渗入吸水垫7端。在扩散过程中，如果样品中有待测物时，待测物和金标抗体结合，进而占据了金标抗体上的抗原结合点，阻止金标抗体与纤维素膜4上隐形检测线5(半抗原与载体蛋白的结合物)的结合，使隐形检测线5不显色或者显色很弱即表示检测样品阳性或者弱阳性；如果样品中没有待测样品时，金标抗体在上移过程中，遇隐形检测线5显示一条清晰红线即表示检测样品阴性。同样，金标抗体也与纤维素膜4上的隐形质控线6(羊抗兔igg)结合，使隐形质控线6显红色。隐形质控线6颜色的有或无分别表示此试纸条的有效或无效，判定结果如图9所示。
[0208]
6、检出限的测定
[0209]
往液体样品1～4中添加一系列浓度的标准马来酸氯苯那敏药物，经样品前处理，用上述胶体金试纸条对样品进行检测，通过肉眼定性判断，确定可视检测限。具体结果如表4。
[0210]
表4样品中马来酸氯苯那敏试纸条检测结果
[0211][0212]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。