一种胞外中性金属蛋白酶empr的异源表达及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种中性金属蛋白酶empr的重组表达及其应用的技术领域。


背景技术：

2.蛋白酶作为一类催化蛋白质水解为氨基酸的物质，是一种重要的工业酶制剂，能用于食品加工、饲料、制革工业、医药、环保等行业。
3.我国的蛋白酶研究还存在以下问题：（1）分泌孢外蛋白酶的微生物资源开发不足；（2）蛋白酶的种类较少；（3）酶制剂品种单一、价格昂贵；（4）应用面还不够广等。蛋白酶市场现在仍然是供不应求的状态，当前的研究重点仍然是选育高产蛋白酶菌株，对其进行培养条件优化和相关性质研究，提升我国蛋白酶品质和产量。
4.随着人们对蛋白酶的认识、研究不断加深，加之基因组测序技术的发展，蛋白酶的研究也逐渐转向在异源宿主中的高效表达，以便更有利于工业的发展。目前已有来源于芽胞杆菌、放线菌、霉菌等的蛋白酶，实现了在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母等宿主的异源表达。其中大肠杆菌作为首选宿主，成功表达了多种蛋白质。然而大肠杆菌在表达蛋白酶时，蛋白酶对细胞的毒性作用容易造成溶菌现象或产生不具有蛋白酶活性的包涵体。而酵母异源表达成本较高，极大地限制了其应用。枯草芽孢杆菌是非常高效的异源表达宿主，而且不致病，不产内毒素，被美国fda认证为安全的宿主，成本也相对低廉适宜大规模生产。


技术实现要素：

5.本发明首先提供了一种编码胞外金属蛋白酶的基因empr，是以从新疆的盐碱地土壤中筛选出的高产蛋白酶菌株lcb14为出发菌株，提取其总基因组dna，设计引物并结合其全基因组序列分析，通过pcr扩增出empr基因片段（genbank id：mn480449），该基因全长1566bp，编码521个氨基酸，其中1-27位氨基酸为信号肽，28-221为氨基酸为前肽，222-521位氨基酸为该蛋白酶的成熟肽。
6.本发明将获得的基因与载体pub10连接，构建重组表达载体pub10-empr，转化至bacillus subtilis sck6，培养所得重组枯草芽孢杆菌，进行表达。离心收集上清液，经过阳离子离子交换层析纯化得到纯酶，具有蛋白酶活性。
7.本发明所得金属蛋白酶分子量约为54kd，最适温度50
o
c，最适ph 6.5，应用于制革过程脱毛流程中，具有优秀的脱毛性能，这将在皮革工业上中具有很好的应用前景。
附图说明
8.图1为empr基因的的电泳图；m：dna marker；1：重组质粒pub10-empr多聚体；2：empr基因；3：质粒pub10。
9.图2为重组芽孢杆菌蛋白酶表达sds-page；m，标准蛋白；1，蛋白酶empr。
10.图3为纯化的蛋白酶empr的最适ph，ph稳定性。
11.图4为纯化的蛋白酶empr的最适温度，温度稳定性。
12.图5脱毛效果。
具体实施方式
13.实施例一：empr基因的获得提取芽孢杆菌lcb14的基因组dna，进行全基因组序列测序（由美吉生物完成），结合得到的orf阅读框，进行相关文献的查阅及数据库的比对，选定一个胞外蛋白酶基因empr。
14.实施例二：empr基因的表达设计引物扩增empr基因，上游引物(5'-ctcggggaatttatcttgtagccataacagttcttgatctgtccgtccttccttttttc-3')，下游引物(5'-gttgctagtaacatctgaccgagatttttttgagcaacttcagttttcatttggaatgg-3')。并设计引物使质粒pub10线性化，上游引物(5'-caagaactgttatggctacaag-3'),下游引物(5'-agttgctcaaaaaaatctcggtc-3')。将扩增的线性化质粒pub10和empr切胶回收，进行重叠延伸pcr得到pub10-empr核酸多聚体，转化bacillus subtilis sck6，挑取阳性克隆至lb液体培养基，37
o
c，220rpm 培养基培养48h，经sds-page做蛋白酶表达量的分析。
15.实施例三：蛋白酶empr的纯化重组菌经37
o
c，220rpm 培养基培养48h，10000rpm离心收集上清。超滤浓缩，用hitrap sp ff阳离子交换柱进行纯化，用（20mm tris-hcl，ph 6.5）平衡柱子，用含1m nacl线性梯度洗脱目的蛋白，进行sds-page鉴定。
16.实施例四：蛋白酶活性的测定方法取100
µ
l纯化的蛋白酶加入到700
µ
l 50mm的tris-hcl缓冲溶液中，加入200
µ
l的酪蛋白溶液（2%），50
o
c水浴锅中反应20min，加入200
µ
l三氯乙酸（6.56%）终止反应，10000rpm离心10min。离心后取上清400
µ
l，加入2ml碳酸钠（4.24%），400
µ
l福林酚试剂，测定660nm的吸光度。空白以加入三氯乙酸后再加等体积酶液作为空白对照。
17.实施例五：蛋白酶empr的酶学性质研究分别在不同ph条件下测定蛋白酶的活性（hac-naac ph 4-6.5，tris-hcl ph 6-9，gly-naoh ph 9-11）；在不同的ph（hac-naac ph 4-6.5，tris-hcl ph 6-9，gly-naoh ph 9-11）条件下孵育一个小时，测定蛋白酶的ph稳定性；分别在不同温度（20
o
c，25
o
c，30
o
c，35
o
c，40
o
c，45
o
c，50
o
c，55
o
c，60
o
c，65
o
c，70
o
c，75
o
c）测定蛋白酶活；在不同温度（20
o
c，25
o
c，30
o
c，35
o
c，40
o
c，45
o
c，50
o
c，55
o
c，60
o
c，65
o
c，70
o
c，75
o
c）下孵育一个小时，测定蛋白酶的热稳定性。
18.实施例六：蛋白酶empr脱毛性能研究取羊皮经浸水去肉脱脂后，称重，加至转鼓中，添加水至液比1，温度37
o
c，按照200iu/g羊皮添加蛋白酶empr，转鼓转动30min，停30min直至羊毛全部脱掉。


技术特征：
1.一种胞外金属蛋白酶empr的基因序列，在芽孢杆菌中的异源表达及其在脱毛中的应用。2.如权利要求1所述的胞外金属蛋白酶empr，该蛋白酶基因由1566个核苷酸组成，编码521个氨基酸，其中1-27位氨基酸为信号肽。3.将empr基因连接入pub110载体，在bacillus subtilis sck6中实现了高效表达，应用于皮革脱毛实验中，展现出优异的脱毛性能。4.经纯化后的蛋白酶特征为：最适温度50
o
c，最适ph 6.5，将在皮革脱毛工业中具有很好的应用前景。

技术总结
本发明公开了一种胞外金属蛋白酶基因及其应用，属于生物技术领域。本发明所述的empr基因全长是通过提取芽孢杆菌LCB14的基因组DNA，通过PCR技术得到的。该基因全长1566bp，编码521个氨基酸。本发明实现了empr基因在枯草芽孢杆菌的克隆、异源表达、纯化，蛋白酶学性质表征及其在羊皮脱毛中的应用。蛋白酶empr在羊皮脱毛过程中展现出优秀的脱毛性能，在皮革脱毛应用中具有广阔的前景。毛应用中具有广阔的前景。


技术研发人员：田永强 李晓广 田杰伟
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：2020.04.16
技术公布日：2021/10/22