一种简单有效的诱导扩增iNKT细胞的方法及应用与流程

一种简单有效的诱导扩增inkt细胞的方法及应用
技术领域
1.本发明属于细胞免疫治疗领域，涉及一种简单有效的诱导扩增inkt细胞的方法及应用。


背景技术：

2.inkt细胞因其表达独特的invariant tcr而得名，其主要识别由cd1d分子呈递的糖脂抗原，通过分泌大量的细胞因子，同时介导先天性免疫和适应性免疫。目前inkt细胞被认为是一群稀有的但是具有强有力的免疫调节和效应功能的t细胞，在抗肿瘤免疫中发挥重要的功能。
3.目前多项研究表明肿瘤患者存在体内inkt细胞含量低或功能受损(分泌ifn
‑
γ能力降低)的现象。肿瘤内浸润的inkt细胞数量与神经母细胞瘤和结肠癌等的临床预后密切相关；一项中位随访时间长达8.7年的研究报道，循环in kt细胞严重缺乏的头颈鳞癌患者临床预后差；造血干细胞移植后外周血中ink t细胞的重建有助于儿童白血病的长期缓解等。以上发现均提示inkt细胞具有有效的抗肿瘤活性，近年来inkt免疫细胞疗法备受关注。
4.目前认为inkt细胞主要通过以下机制发挥抗肿瘤作用：
5.1、cd1d依赖性直接的细胞毒杀伤活性：主要由perforin、fasl、granb、tnf
‑
α等介导；
6.2、cd1d非依赖性的细胞毒杀伤活性：一旦活化通过分泌大量的th1/th2型细胞因子同时激活机体的先天免疫及适应性免疫，其中inkt与dc细胞间由cd40
‑
cd40l或cd1d脂类抗原/itcr介导的“交叉对话”及通过分泌ifn
‑
γ活化cd8

t细胞尤为重要，从而增强抗肿瘤效果；
7.3、免疫调节机制：最新研究报道在原发性神经母细胞瘤中，发现inkt细胞通过杀死肿瘤相关巨噬细胞(tam)来介导抗肿瘤活性；此外在人和小鼠甲型流感病毒感染的模型中，发现inkt细胞能够降低髓样来源抑制细胞(mds c)的免疫抑制活性。这些发现提示inkt细胞存在一种新的作用机制，即通过杀伤免疫抑制细胞来调节肿瘤微环境，从而增强抗肿瘤免疫效应。
8.近年来利用inkt细胞治疗肿瘤的临床试验陆续开展。临床数据显示扩增培养的inkt细胞过继性免疫治疗肿瘤无明显副作用，具有良好的临床应用前景。但是由于人体外周血中inkt细胞含量低(约占淋巴细胞的0.01～1％)，目前扩增方法存在起始细胞需求量大、扩增周期长、细胞制剂纯度低、活性弱等技术难题，最终导致临床整体缓解率低，抗肿瘤效果不理想。


技术实现要素：

9.优化的淋巴细胞培养基
10.本发明提供一种优化的淋巴细胞培养基，所述优化的淋巴细胞培养基是向基础淋巴细胞培养基中添加细胞激动剂和细胞因子配制而成。
11.优选地，所述细胞激动剂是α
‑
半乳糖基神经酰胺(α
‑
galcer)。
12.优选地，所述细胞因子包括gm
‑
csf(粒细胞巨噬细胞集落剌激因子)、sicam
‑
1(人可溶性细胞间粘附分子1)、il
‑
1(白介素1)、il
‑
1alpha receptor(白介素1α受体)、il1 alpha(白介素1α)、il
‑
3(白介素3)、il
‑
2(白介素2)、il
‑
21(白介素21)、il
‑
10(白介素10)、il
‑
16(白介素16)、il
‑
13(白介素13)、il
‑
17(白介素17)、ip
‑
10(干扰素诱导蛋白10)、scya2(小诱导型细胞因子a2)、mig(干扰素γ诱生单核因子)、mip
‑
1alpha(巨噬细胞炎性蛋白lα)、tgf
‑
beta(转化生长因子β)、il
‑
4(白介素4)、traf6(tnf受体相关因子6)、fgf(成纤维细胞生长因子)、igf(胰岛素样生长因子)、pdgf(血小板衍生生长因子)、lif(白血病抑制因子)、mtor(雷帕霉素靶蛋白)、lps(细胞内毒素)、tlrl(toll
‑
样受体1)、il
‑
12(白介素12)、il
‑
23(白介素23)、ngf(神经生长因子)、tnf alpha(α干扰素)、il
‑
1beta(白介素1β)或前述任一种的功能片段。
13.优选地，所述细胞因子包括以下一种或多种的组合：il
‑
2或其功能片段、il
‑
21或其功能片段、il
‑
4或其功能片段、gm
‑
csf或其功能片段。
14.优选地，所述细胞因子是商品化的il
‑
2、il
‑
21、il
‑
4和gm
‑
csf的组合。
15.优选地，所述α
‑
galcer的终浓度(工作浓度)是50～1000ng/ml。
16.优选地，所述α
‑
galcer的终浓度是50
‑
500ng/ml。
17.优选地，所述α
‑
galcer的终浓度是100ng/ml。
18.优选地，所述il
‑
2的终浓度为10～200u/ml。
19.优选地，所述il
‑
2的终浓度为10～100u/ml。
20.优选地，所述il
‑
2的终浓度是50u/ml。
21.优选地，所述il
‑
21终浓度为5～100ng/ml。
22.优选地，所述il
‑
21终浓度为5～50ng/ml。
23.优选地，所述il
‑
21的终浓度是10ng/ml。
24.优选地，所述gm
‑
csf终浓度为100～1000u/ml。
25.优选地，所述gm
‑
csf终浓度为300～700u/ml。
26.优选地，所述gm
‑
csf的浓度是500u/ml。
27.优选地，所述il
‑
4终浓度为100～1000u/ml。
28.优选地，所述il
‑
4终浓度为300～700u/ml。
29.优选地，所述il
‑
4的终浓度是500u/ml。
30.优选地，所述基础淋巴细胞培养基是含有fcs的x
‑
vivo 15培养基。
31.优选地，所述基础淋巴细胞培养基是含有5％fcs的x
‑
vivo 15培养基。
32.活化nkt细胞的抗体液
33.本发明提供了一种活化nkt细胞的抗体液，所述抗体液含有cd3单克隆抗体和cd28单克隆抗体。
34.优选地，所述nkt细胞是inkt细胞。
35.优选地，所述cd3单克隆抗体的工作浓度是1～10μg/ml。
36.优选地，所述cd3单克隆抗体的工作浓度是1μg/ml。
37.优选地，所述cd28单克隆抗体的工作浓度是1～10μg/ml。
38.优选地，所述cd28单克隆抗体的工作浓度是1μg/ml。
39.优选地，所述抗体包被孔板后可用于活化nkt细胞.
40.优选地，所述孔板是24孔板。
41.含有il
‑
7和il
‑
15的淋巴细胞培养基
42.本发明提供了一种含有il
‑
7和il
‑
15的淋巴细胞培养基，其是向基础淋巴细胞培养基中添加il
‑
7和il
‑
15配制而成。
43.优选地，所述il
‑
7的工作浓度是5～50ng/ml。
44.优选地，所述il
‑
7的工作浓度是10ng/ml。
45.优选地，所述il
‑
15的工作浓度是1～50ng/ml。
46.优选地，所述il
‑
15的工作浓度是5ng/ml。
47.优选地，所述基础淋巴细胞培养基是含有fcs的x
‑
vivo 15培养基。
48.优选地，所述基础淋巴细胞培养基是含有5％fcs的x
‑
vivo 15培养基。
49.诱导nkt细胞的方法
50.本发明提供了一种诱导nkt细胞的方法，所述方法包括使用前述优化的淋巴细胞培养基培养样品的步骤。
51.优选地，所述nkt细胞是inkt细胞。
52.优选地，所述培养时细胞的初始浓度为1
×
106/ml～50
×
106/ml。
53.优选地，所述培养时细胞的初始浓度为1
×
106/ml～10
×
106/ml。
54.优选地，所述培养时细胞的初始浓度为2
×
106/ml。
55.优选地，所述培养的培养条件是37℃、5％co2。
56.优选地，所述培养隔天换液。
57.优选地，所述换液是半量换液。
58.优选地，所述样品含有或不含有inkt细胞。
59.优选地，所述样品的来源包括骨髓、脐带血和胎盘血、外周血。
60.优选地，所述样品来源于外周血。
61.优选地，所述样品是外周血中分离得到的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，pbmc)。
62.优选地，所述外周血中分离得到的外周血单个核细胞是本领域熟知的，包括但不限于ficoll分层液法(ficoll密度梯度离心法)或percoll分层液法。
63.优选地，所述外周血中分离得到pbmc使用的是ficoll密度梯度离心法。
64.扩增nkt细胞的方法
65.本发明提供了一种扩增nkt细胞的方法，所述方法包括使用前述含有il
‑
7和il
‑
15的淋巴细胞培养基培养包含nkt细胞的细胞液，然后将细胞接种到前述抗体液包被的孔板上培养；
66.优选地，所述nkt细胞是inkt细胞。
67.优选地，所述包含nkt细胞的细胞液是磁珠分选得到的。
68.优选地，所述包含nkt细胞的细胞液是磁珠分选前述诱导nkt细胞的方法制备得到的细胞得到的。
69.优选地，所述磁珠分选中磁珠选用的是anti
‑
inkt microbeads。
70.优选地，所述磁珠分选中重悬、冲洗、洗脱任一使用的buffer是macs buffer。
71.优选地，所述磁珠分选中使用ls分选柱。
72.优选地，所述培养的培养条件是37℃、5％co2。
73.优选地，所述培养时细胞的浓度维持在1
×
106/ml左右。
74.优选地，所述培养隔天换液。
75.优选地，所述换液是半量换液。
76.试剂盒
77.本发明提供一种制备nkt细胞的试剂盒；所述试剂盒中包含前述优化的淋巴细胞培养基、前述活化nkt细胞的抗体液、前述包含il
‑
7和il
‑
15的淋巴细胞培养基、配制前述优化的淋巴细胞培养基使用的试剂、配制前述活化nkt细胞的抗体液使用的试剂、配制前述包含il
‑
7和il
‑
15的淋巴细胞培养基所使用的试剂；
78.优选地，所述nkt细胞是inkt细胞。
79.细胞
80.另一方面本发明还提供了一种能杀伤肿瘤细胞(癌细胞)的nkt细胞，所述nkt细胞由前述诱导nkt细胞的方法或扩增nkt细胞的方法制备而来。
81.优选地，所述肿瘤细胞是肾癌细胞。
82.优选地，所述nkt细胞是inkt细胞。
83.方法
84.本发明提供了一种杀伤肿瘤细胞的方法，所述方法包括上述nkt细胞与肿瘤细胞接触。
85.优选地，所述杀伤肿瘤细胞是发生在体外的。
86.优选地，所述肿瘤细胞是肾癌细胞。
87.优选地，所述肿瘤细胞是人肾癌细胞细胞系。
88.药物组合物
89.另一方面本发明还提供了一种治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含由前述诱导nkt细胞的方法和/或扩增nkt细胞的方法制备而来的nkt细胞。
90.优选地，所述癌症是肾癌。
91.优选地，所述药物组合物还包括其他可用于治疗癌症或有益于健康的成分。
92.优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的赋形剂和/或添加剂。
93.优选地，所述赋形剂包括但不限于缓冲体系、增稠剂、稳定剂、中和试剂、保湿剂。
94.优选地，所述添加剂包括但不限于充填剂、结合剂、增湿剂、助流剂、稳定剂、防腐剂、乳化剂。
95.优选地，所述nkt细胞是inkt细胞。
96.应用
97.另一方面本发明提供了前述优化的淋巴细胞培养基、前述活化nkt细胞的抗体液、前述包含il
‑
7和il
‑
15的淋巴细胞培养基、前述试剂盒任一在诱导(制备)nkt细胞中的用途。
98.另一方面本发明提供了α
‑
galcer、il
‑
2、il
‑
21、il
‑
4和gm
‑
csf任一在诱导nkt细胞中的用途。
99.另一方面本发明提供了il
‑
7或il
‑
15在诱导nkt细胞中的用途。
100.另一方面本发明提供了cd3单克隆抗体或cd28单克隆抗体在诱导nkt细胞中的用途。
101.另一方面，本发明还提供了前述nkt细胞或药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。
102.优选地，所诉癌症是肾癌。
103.优选地，所述nkt细胞是inkt细胞。
附图说明
104.图1为流式细胞术对inkt细胞表型分析的结果图；图1a是诱导之前的pbmcs细胞，图1b是传统方法诱导后第9天的细胞，图1b’是本发明方法诱导后第9天的细胞，图1c是磁珠分选之后的细胞。
105.图2为rtca实验分析inkt细胞的体外杀伤活性的结果图；图2a是杀伤786
‑
o细胞时的归一细胞指数，图2b是杀伤osrc
‑
2细胞时的归一细胞指数，图2c是inkt细胞对786
‑
o细胞的细胞毒杀伤活性，图2d是inkt细胞对osrc
‑
2细胞的细胞毒杀伤活性。
106.图3为elisa方法检测inkt细胞与肾癌细胞786
‑
o、osrc
‑
2共培养时分泌细胞因子水平结果图；a.ifn
‑
γ浓度，b.il
‑
2浓度，c.tnf
‑
α浓度。
具体实施方式
107.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。如本文中所使用的，术语“淋巴细胞培养基”是指含有使淋巴细胞生长的营养素，可以维持淋巴细胞生存的溶液。所述淋巴细胞培养基是本技术领域人员所熟知的培养基，通常提供标准无机盐如锌、铁、镁、钙和钾，以及维生素、葡萄糖、缓冲体系和必需氨基酸。
108.可以用于本技术的培养基(包括淋巴细胞培养基)包括但不限于tesr
‑
e8、mtesr1、e8、essential 8
tm medium、达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem)、最小必需培养基(mem)、伊格尔基本培养基(bme)、f
‑
10、f
‑
12、α
‑
最小必需培养基(α
‑
mem)、g
‑
最小必需培养基(g
‑
mem)、impm(imdm)、amnioma x、新型二代羊水培养基(amino maxⅱcomplete medium)、chang’s培养基、mesemcult
‑
xf培养基、rpmi 1640、ham’s f12、dmem/f12、ham's f
‑
12k mediu m、hepatozyme
‑
sfm、william’s emedium、waymouth’s medium、hepatocyte culture medium。
109.所述淋巴细胞培养基可以购买商品化培养基，也可以根据配方自行配制；根据不同的需要还可以添加其他物质。
110.如本文中所使用的，术语外周血单个核细胞(pbmc，pbmcs)是指，外周血中具有单个细胞核的细胞的总称，包括但不限于淋巴细胞(t细胞、b细胞、nk细胞、nkt细胞)、单核细胞或树突状细胞。
111.下面将参考附图并结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。
在不矛盾的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
112.本发明实施例中所用的试剂如下：
113.表1.本发明实施例所使用的试剂
114.试剂公司x
‑
vivo 15培养基lonza公司淋巴细胞分离液axis
‑
shield公司cd3单克隆抗体、cd28单克隆抗体biolegend公司rhil
‑
2、rhil
‑
7、rhil
‑
15、rhil
‑
21、rhil
‑
4、rhgm
‑
csfprimegene公司α
‑
galcerfunakoshi公司anti
‑
inkt microbeadsmiltenyi biotec公司percp
‑
cy5.5 cd3、pe invariant nktbd biosciences公司
115.实施例1.inkt细胞的制备
116.1)分离pbmcs：采集供者外周血，用等量生理盐水稀释全血，将淋巴细胞分离液与稀释血按1:2比例加入离心管中，2000rpm/min离心20分钟，收集白膜层细胞，生理盐水清洗两次，1500rpm/min离心8分钟，获得外周血单个核细胞pbmcs。
117.2)诱导inkt细胞：用淋巴细胞培养基重悬pbmcs，调整细胞浓度为2
×
106/ml，加入100ng/mlα
‑
galcer、50u/ml il
‑
2、10ng/ml il
‑
21、500u/ml il
‑
4和500u/ml gm
‑
csf，将细胞接种于24孔板，置于37℃、5％co2培养箱。每日观察细胞状态，隔天半量换液，通过细胞计数监测扩增效果，利用流式细胞术对inkt细胞表型进行分析。
118.3)磁珠分选inkt细胞：第10天收集诱导后细胞，用500μl macs buffer重悬，按照说明书用量加入anti
‑
inkt microbeads，混匀置于4℃孵育30分钟，加入5ml macs buffer清洗，400
×
g离心5分钟，弃上清；用500μlmacs buffer重悬，上样ls分选柱，macs buffer清洗3次，每次3ml；最后将分选柱置于收集管，加500μl macs buffer洗脱获得inkt阳性细胞。图1c为流式细胞术分析分选后inkt细胞纯度。
119.4)活化扩增inkt细胞：培养第9天，准备1μg/ml cd3和cd28单克隆抗体工作液，准备一个新的24孔板，每孔加0.5ml抗体稀释液(抗体工作液)，轻轻晃动使抗体稀释液完全覆盖孔底，用封口膜封板，置于4℃冰箱过夜。第10天用含有10ng/ml il
‑
7和5ng/ml il
‑
15的淋巴细胞培养基重悬上一步纯化所得细胞，接种于cd3ab和cd28ab预包被板，置于37℃、5％co2培养箱进行大量扩增。
120.实验结果：
121.使用流式细胞仪对不同时期的细胞进行检测，结果如图1所示：图1a是诱导之前的pbmcs细胞，图1b是传统方法诱导后第9天的细胞，图1b’是本发明方法诱导后第9天的细胞，图1c是磁珠分选之后的细胞；
122.表2为本发明方法与传统方法实验过程中细胞数的对比，根据细胞数统计得知本发明起始需求量小(～106数量级)，获得的inkt细胞比例高，7～9天后inkt细胞比例从0.01～1％提高至20～80％，最终inkt细胞扩增2595倍。
123.表2：为本发明与传统方法的扩增效果对比
[0124][0125]
以上实验结果证明，本发明的方法能显著提高制备intk细胞的效率。
[0126]
实施例2.inkt细胞体外杀伤肿瘤细胞活性
[0127]
效应细胞：实施例1获得的inkt细胞
[0128]
靶细胞：786
‑
o细胞和osrc
‑
2细胞(本实施例以人肾癌细胞为例)
[0129]
首先在xcelligence细胞功能分析仪的e
‑
plate检测板中加入50μl肿瘤细胞完全培养基，测定背景阻抗值；收集处于对数期的靶细胞，调整细胞悬液浓度至1
×
105/ml，向e
‑
plate检测板中加入100μl细胞悬液，室温静置30分钟后置于检测台上；实时动态观察待靶细胞增殖处于平台期时，按照效靶比20:1、10:1、5:1分别加入50μl效应细胞，对照组仅加t细胞培养基；继续进行实时观察inkt细胞介导的细胞杀伤效应曲线。
[0130]
图2a证明实施例1获得的inkt细胞在效靶比是20:1、10:1、5:1时均可以杀伤786
‑
o细胞，效应细胞比例越大，杀伤效果越好；
[0131]
图2b证明实施例1获得的inkt细胞在效靶比是20:1、10:1、5:1时均可以杀伤osrc
‑
2细胞，效应细胞比例越大，杀伤效果越好；
[0132]
图2c证明在相同效靶比的情况下，实施例1获得的inkt细胞对肾癌细胞786
‑
o的细胞毒杀伤活性24小时均高于4小时；
[0133]
图2d证明在相同效靶比的情况下，实施例1获得的inkt细胞对肾癌细胞osrc
‑
2的细胞毒杀伤活性24小时均高于4小时。
[0134]
实施例3.inkt细胞分泌细胞因子的能力
[0135]
消化肿瘤细胞，清洗计数调整密度为1
×
105/ml，铺24孔板，每孔2ml贴壁过夜；收集扩增好的inkt细胞，按照1:1的比例加入肿瘤细胞中共培养，24h后收集上清，elisa方法检测ifn
‑
γ、il
‑
2、tnf
‑
α。
[0136]
图3结果所示：inkt细胞与肾癌细胞共孵育，能够分泌细胞因子a.ifn
‑
γ、b.il
‑
2、c.tnf
‑
α。
[0137]
以上结果证明实施例1获得的inkt细胞具有分泌细胞因子的能力。
[0138]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。