一种固液相结合制备达西高血糖素的方法与流程

1.本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种合成达西高血糖素的方法。


背景技术：

2.先天性高胰岛素性低血糖血症（congenital hyperinsulinemic hypoglycemia，chi）又称婴儿持续性高胰岛素血症性低血糖症(phhi)。患有这种疾病的人有异常高水平的胰岛素，经常发生低血糖症。2018年5月11日，该疾病被列入中国国家卫生健康委员会等5部门联合制定的《第一批罕见病目录》。该病以药物治疗为主，如药物治疗无效可外科治疗（开腹胰腺切除术）。
3.严重低血糖症是一种急性的、危及生命的疾病，主要由胰岛素治疗引起的血糖水平严重下降引起，是糖尿病治疗中最令人担心的并发症之一。最常见低血糖原因为胰岛素治疗和磺脲类药物，其发生率约占20%，尤其是第一代磺脲类药物氯磺丙脲最易引起低血糖。
4.2021年03月23日zealand pharma a/s生物技术公司宣布，美国食品和药物管理局（fda）已批准zegalogue（dasiglucagon）注射液，用于治疗年龄在6岁及以上儿童和成人糖尿病患者的严重低血糖。达西高血糖素（dasiglucagon）是目前第一个也是唯一一个用于治疗6岁及以上儿童和成人糖尿病患者严重低血糖的胰高血糖素类似物。达西高血糖素有29个氨基酸残基组成，分子量3185.57，其氨基酸序列如下：h
‑1his
‑
ser
‑
gln
‑
gly
‑5thr
‑
phe
‑
thr
‑
ser
‑
asp
‑
10
tyr
‑
ser
‑
lys
‑
tyr
‑
leu
‑
15
asp
‑
aib
‑
ala
‑
arg
‑
ala
‑
20
glu
‑
glu
‑
phe
‑
val
‑
lys
‑
25
trp
‑
leu
‑
glu
‑
ser
‑
thr
‑
oh原研专利ep2875043（cn104662038）采用标准的fmoc化学固相合成法合成达西高血糖素，其中用到假脯氨酸fmoc
‑
phe
‑
thr(ψ，me，me，pro)
‑
oh、fmoc
‑
asp
‑
ser(ψ，me，me，pro)
‑
oh和fmoc
‑
glu
‑
ser(ψ，me，me，pro)
‑
oh来作为原料。该专利的合成方法，主要缺点是肽链较长，固相逐步合成会导致粗肽纯度较低，并且肽序中富含gly、ala等结构简单的氨基酸残基，容易产生缺失gly或ala杂质肽，这样就会造成纯化难度较大，总收率较低。
5.为了提高粗肽的纯度，减少缺失gly或ala杂质肽的产生，本技术人对达西高血糖素的合成方法进行了研究，用片段法合成的方法得到了本发明的技术方案。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种片段法制备达西高血糖素的方法。本发明降低了合成难度，提高了粗肽纯度，从而降低了纯化难度，提高了收率，降低了生产成本，有利于规模化工业生产。
7.为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：(a)液相合成单体boc
‑
his(trt)
‑
ser(tbu)
‑
gln(trt)
‑
oh、fmoc
‑
gly
‑
thr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
leu
‑
asp(otbu)
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
arg(pbf)
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
glu(otbu)
‑
oh、fmoc
‑
val
‑
lys(boc)
‑
oh、fmoc
‑
leu
‑
glu(otbu)
‑
oh；
(b)采用wang resins或2
‑
ctc resins为固相载体，用fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh与之偶联反应制备fmoc
‑
thr(tbu)
‑
树脂,再按序列依次偶联fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
leu
‑
glu(otbu)
‑
oh、fmoc
‑
trp(boc)
‑
oh、 fmoc
‑
val
‑
lys(boc)
–
oh、fmoc
‑
phe
‑
oh、fmoc
‑
glu(otbu)
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
glu(otbu)
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
arg(pbf)
‑
oh、fmoc
‑
aib
‑
oh、fmoc
‑
leu
‑
asp(otbu)
‑
oh，fmoc
‑
tyr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
lys(boc)
–
oh、fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
tyr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
asp(otbu)
‑
oh、fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
thr (tbu)
‑
oh、fmoc
‑
phe
‑
oh、fmoc
‑
gly
‑
thr(tbu)
‑
oh、boc
‑1his(trt)
‑
ser(tbu)
‑
gln(trt)
‑
oh得到达西高血糖素肽树脂:boc
‑1his(trt)
‑
ser(tbu)
‑
gln(trt)
‑
gly
‑5thr(tbu)
‑
phe
‑
thr(tbu)
‑
ser(tbu)
‑
asp(otbu)
‑
10
tyr(tbu)
‑
ser(tbu)
‑
lys
‑
tyr(tbu)
‑
leu
‑
15
asp(otbu)
‑
aib
–
ala
‑
arg(pbf)
‑
ala
‑
20
glu(otbu)
‑
glu(otbu)
‑
phe
‑
val
‑
lys(boc)
‑
25
trp(boc)
‑
leu
‑
glu(otbu)
‑
ser(tbu)
‑
thr(tbu)
‑
树脂；（c）肽树脂经裂解、纯化、冻干得达西高血糖素精肽。
8.优选的，步骤（a）合成单体fmoc
‑
val
‑
lys(boc)
‑
oh的具体操作步骤为：取碱a溶解在溶剂b中，配成碱性溶液；在低温浴下将h
‑
lys(boc)
‑
oh溶解于配置好的碱溶液中，且溶解后溶液仍显碱性；低温下向反应液中加入fmoc
‑
val
‑
osu溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应,tlc监测反应终点，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体fmoc
‑
val
‑
lys(boc)
‑
oh。
9.优选的，步骤（a）合成单体fmoc
‑
gly
‑
thr(tbu)
‑
oh的具体操作步骤为：取碱a溶解在溶剂b中，配成碱性溶液；在低温浴下将h
‑
thr(tbu)
‑
oh溶解于配置好的碱溶液中，且溶解后溶液仍显碱性；低温下向反应液中加入fmoc
‑
gly
ꢀ‑
osu溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应,tlc监测反应终点，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体fmoc
‑
gly
‑
thr(tbu)
‑
oh。
10.优选的，步骤（a）合成单体fmoc
‑
leu
‑
asp(otbu)
‑
oh的具体操作步骤为：取碱a溶解在溶剂b中，配成碱性溶液；在低温浴下将h
‑
asp(otbu)
‑
oh溶解于配置好的碱溶液中，且溶解后溶液仍显碱性；低温下向反应液中加入fmoc
‑
leu
‑
osu溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应,tlc监测反应终点，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体fmoc
‑
leu
‑
asp(otbu)
‑
oh。
11.优选的，骤（a）合成单体fmoc
‑
ala
‑
arg(pbf)
‑
oh的具体操作步骤为：取碱a溶解在溶剂b中，配成碱性溶液；在低温浴下将h
‑
arg(pbf)
‑
oh溶解于配置好的碱溶液中，且溶解后溶液仍显碱性；低温下向反应液中加入fmoc
‑
ala
‑
osu溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应,tlc监测反应终点，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体fmoc
‑
ala
‑
arg(pbf)
‑
oh。
12.优选的，骤（a）合成单体fmoc
‑
leu
‑
glu(otbu)
‑
oh的具体操作步骤为：取碱a溶解在溶剂b中，配成碱性溶液；在低温浴下将h
‑
glu(otbu)
‑
oh溶解于配置好的碱溶液中，且溶解后溶液仍显碱性；低温下向反应液中加入fmoc
‑
leu
‑
osu溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应,tlc监测反应终点，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体fmoc
‑
leu
‑
glu(otbu)
‑
oh。
13.优选的，骤（a）合成单体fmoc
‑
ala
‑ꢀ
glu(otbu)
‑
oh的具体操作步骤为：取碱a溶解在溶剂b中，配成碱性溶液；在低温浴下将h
‑
glu(otbu)
‑
oh溶解于配置好的碱溶液中，且溶解后溶液仍显碱性；低温下向反应液中加入fmoc
‑
ala
‑
osu溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应,tlc监测反应终点，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体fmoc
‑
ala
‑
glu(otbu)
‑
oh。
14.优选的，骤（a）合成单体boc
‑
his(trt)
‑
ser(tbu)
‑
gln(trt)
‑
oh的具体操作步骤为：取碱a溶解在溶剂b中，配成碱性溶液；在低温浴下将h
‑
ser(tbu)
‑
oh溶解于配置好的碱溶液中，且溶解后溶液仍显碱性；低温下向反应液中加入boc
‑
his(trt)
‑
osu溶液，滴加完毕
后，升温继续搅拌反应,tlc监测反应终点，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体boc
‑
his(trt)
‑
ser(tbu)
‑
oh；然后将其溶接在有机溶剂中，加入一定量的dcc/hosu反应3h,过滤、浓缩、析晶，得boc
‑
his(trt)
‑
ser(tbu)
‑
osu；再取一定的碱溶解在溶剂中，配成碱性溶液；在低温浴下将h
‑
gln(trt)
‑
oh溶解于配置好的碱溶液中，且溶解后溶液仍显碱性；低温下向反应液中加入boc
‑
his(trt)
‑
ser(tbu)
‑
osu溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应,tlc监测反应终点，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体boc
‑
his(trt)
‑
ser(tbu)
‑
gln(trt)
‑
oh。
15.所述的碱a溶解在溶剂b中配成的碱性溶液可以是氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾等水溶液或与水互溶的有机溶剂的混合溶液；同时也可以是三乙胺、二乙胺、n，n
‑
二异丙基乙胺等有机碱的有机溶液；优选的，所述步骤（c）中，裂解试剂为加入体积比1
‑
5%清除剂的tfa溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水和tis中的一种或几种。
16.相对于现有技术，本发明的有益效果是：本发明首次采用单体boc
‑
his(trt)
‑
ser(tbu)
‑
gln(trt)
‑
oh、fmoc
‑
gly
‑
thr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
leu
‑
asp(otbu)
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
arg(pbf)
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
glu(otbu)
‑
oh、fmoc
‑
val
‑
lys(boc)
‑
oh、fmoc
‑
leu
‑
glu(otbu)
‑
oh作为原料，固相合成达西高血糖素，与现有技术中的合成方法相比，本发明能够有效的提高粗肽的纯度，降低纯化的难度，提高终产品的收率，有利于合成规模的放大，降低生产成本。
17.说明书附图图1是达西高血糖素峰谱图。
18.图2是达西高血糖素峰面积结果图。
具体实施方式
19.下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但不限定本专利；根据本发明改变原料的投料比、或是反应溶剂或及缩合剂等，均在本发明的保护范围内。
20.说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下：fmoc：9
‑
芴甲氧羰基；tbu：叔丁基；pbf：2，2，4，6，7
‑
五甲基苯并呋喃
‑5‑
磺酰基；trt：三苯甲基；dcm：二氯甲烷；dmf：n，n
‑
二甲基甲酰胺；dipea：n，n
‑
二异丙基乙胺；dic：n，n
‑
二异丙基碳二亚胺；hbtu：苯并三氮唑
‑
n，n，n'，n'
‑
四甲基脲六氟磷酸盐；hatu：2
‑
(7
‑
偶氮苯并三氮唑)
‑
n，n，n'，n'
‑
四甲基脲六氟磷酸酯；tbtu：o
‑
苯并三氮唑
‑
n，n，n'，n'
‑
四甲基脲四氟硼酸；hobt：1
‑
羟基苯并三唑；hoat：1
‑
羟基
‑7‑
偶氮苯并三氮唑；tfa：三氟乙酸；
tis：三异丙基硅烷；boc：叔丁氧羰基；su：琥珀酰亚胺基；dtt：二硫苏糖醇。
21.实施例1：fmoc
‑
val
‑
lys(boc)
‑
oh的合成准确称取h
‑
lys(boc)
‑
oh 5.92kg(20mol)于100l反应釜中，加入10%碳酸钠水溶液24l，搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入fmoc
‑
val
‑
osu 8.72kg(20mol)/24l四氢呋喃溶液，搅拌反应，tlc监测终点；经减压浓缩、调酸、乙酸乙酯萃取、干燥、析晶，得纯度99.2%的二肽单体fmoc
‑
val
‑
lys(boc)
‑
oh10.36kg，收率91.28%。
22.实施例2：fmoc
‑
leu
‑
glu(otbu)
‑
oh的合成准确称取h
‑
glu(otbu)
‑
oh 4.06kg(20mol)于100l反应釜中，加入10%碳酸钠水溶液24l，搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入fmoc
‑
leu
‑
osu 9.01kg(20mol)/24l四氢呋喃溶液，搅拌反应，tlc监测终点；经减压浓缩、调酸、乙酸乙酯萃取、干燥、析晶，得纯度99.3%的二肽单体fmoc
‑
leu
‑
glu(otbu)
‑
oh9.28kg，收率86.21%。
23.实施例3：fmoc
‑
leu
‑
asp(otbu)
‑
oh的合成准确称取h
‑
asp(otbu)
‑
oh 3.78kg(20mol)于100l反应釜中，加入10%碳酸钠水溶液24l，搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入fmoc
‑
leu
‑
osu 9.01kg(20mol)/24l四氢呋喃溶液，搅拌反应，tlc监测终点；经减压浓缩、调酸、乙酸乙酯萃取、干燥、析晶，得纯度99.2%的二肽单体fmoc
‑
leu
‑
glu(otbu)
‑
oh8.61kg，收率82.12%。
24.实施例4：fmoc
‑
ala
‑
arg(pbf)
‑
oh的合成准确称取h
‑
arg(pbf)
‑
oh 8.53kg(20mol)于100l反应釜中，加入10%碳酸钠水溶液24l和thf 3l,搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入fmoc
‑
ala
‑
osu 8.17kg(20mol)/24l四氢呋喃溶液，搅拌反应，tlc监测终点；经减压浓缩、调酸、乙酸乙酯萃取、干燥、析晶，得纯度98.7%的二肽单体fmoc
‑
ala
‑
arg(pbf)
‑
oh11.90kg，收率82.62%。
25.实施例5：fmoc
‑
ala
‑
glu(otbu)
‑
oh的合成准确称取h
‑
glu(otbu)
‑
oh 4.06kg (20mol)于100l反应釜中，加入10%碳酸钠水溶液24l,搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入fmoc
‑
ala
‑
osu 8.17kg(20mol)/24l四氢呋喃溶液，搅拌反应，tlc监测终点；经减压浓缩、调酸、乙酸乙酯萃取、干燥、析晶，得纯度98.6%的二肽单体fmoc
‑
ala
‑
glu(otbu)
‑
oh 8.30kg，收率83.62%。
26.实施例6：fmoc
‑
gly
‑
thr(tbu)
‑
oh的合成准确称取h
‑
thr(tbu)
‑
oh 3.51kg (20mol)于100l反应釜中，加入10%碳酸钠水溶液24l,搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入fmoc
‑
gly
‑
osu 7.89kg(20mol)/24l四氢呋喃溶液，搅拌反应，tlc监测终点；经减压浓缩、调酸、乙酸乙酯萃取、干燥、析晶，得纯度99.1%的二肽单体fmoc
‑
gly
‑
thr(tbu)
‑
oh7.83kg，收率86.16%。
27.实施例7：boc
‑
his(trt)
‑
ser(tbu)
‑
gln(trt)
‑
oh的合成准确称取h
‑
ser(tbu)
‑
oh 3.22kg (20mol)于100l反应釜中，加入10%碳酸钠水溶液24l,搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入boc
‑
his(trt)
‑
osu11.89kg(20mol)/24l四氢呋喃溶液，搅拌反应，tlc监测终点；经减压浓缩、调酸、乙酸乙酯萃取、干燥、析晶，得纯度98.6%的二肽单体boc
‑
his(trt)
‑
ser(tbu)
‑
oh 10.56kg，收率82.38%。
28.准确称取fmoc
‑
gly
‑
thr(tbu)
‑
oh 10.56kg(16.5mol)和hosu 2.07kg(18mol)于100l反应釜中，加入24l四氢呋喃，搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入dcc 3.71kg(18mol)/18l四氢呋喃溶液，搅拌反应3h，经过滤、浓缩、析晶，得到boc
‑
his(trt)
‑
ser(tbu)
‑
osu固体，将固体复溶于24l四氢呋喃中，待用。
29.准确称取h
‑
gln(trt)
‑
oh 6.40kg (16.5mol)于100l反应釜中，加入10%碳酸钠水溶液24l和thf 3l,搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入boc
‑
his(trt)
‑
ser(tbu)
‑
osu/24l四氢呋喃溶液，搅拌反应，tlc监测终点；经减压浓缩、调酸、乙酸乙酯萃取、干燥、析晶，得纯度99.2%的二肽单体boc
‑
his(trt)
‑
ser(tbu)
‑
gln(trt)
‑
oh 13.63kg，收率81.66%。
30.实施例8：fmoc
‑
thr(tbu)
‑
wang resins的合成将载体wang树脂400.0g(sub=0.47mmol/g)置于合成柱中，用2400ml dmf 洗涤两次，加入2400ml dcm溶胀30min；抽滤掉dcm后，加入fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh/dic/hobt的混合dcm溶液[称取79.5g(200mmol) fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh和32.4g(240mmol) hobt置于甘氨酸活化瓶，加入2000ml体积比例为1∶1的dmf和dcm混合溶液搅拌溶解，低温(0℃）下加入38.2ml(240mmol) dic,活化5分钟]，反应10min后加入2.4g(2mmol) dmap；反应2h，抽掉反应液，用2400ml dmf洗涤两次，加入封端试剂2400ml(480ml乙酸酐和408ml吡啶溶解于1512ml dmf中)反应2h，抽滤掉反应液，分别用dmf、dcm、甲醇洗涤2次，真空干燥后得fmoc
‑
thr(tbu)
‑
wang resins471.0ｇ；取样测替代度为0.38mmol/g。
[0031]
实施例9：fmoc
‑
thr(tbu)
‑
ctc resins的合成称取ctc树脂50.0g(sub=0.41mmol/g)置于合成柱中，用240ml dmf 洗涤两次,加入240ml dcm溶胀30min；抽滤掉dcm后，加入溶有11.92g(30mmol) fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh的dcm/dmf(3/1,体积比)溶液150ml，搅拌后加入dipea 9.9ml(60mmol)，鼓n2反应60min，抽掉反应液，加入dcm/ch3oh/dipea (体积比17：2：1) 混合溶液300ml封端3次，每次10min；然后用dmf、dcm、甲醇分别洗涤2次，真空干燥得fmoc
‑
thr(tbu)
‑
ctc resins 57.20g。测替代度为0.35mmol/g。
[0032]
实施例10：达西高血糖素肽树脂的制备准确称取实施例8替代度为0.38mmol/g 的fmoc
‑
thr(tbu)
‑
wang resins131.6g(合成规模50mmol)置于合成柱中，加入1000ml dcm溶胀30min；抽滤掉dcm后，1000ml dmf洗涤2次，加入20%哌啶/dmf溶液1000ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用1000ml dmf、dcm、dmf分别洗涤2次；加入fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh38.4g(100mmol)、hobt13.5g(100mmol)和dic 15.5ml(100mmol)的dmf溶液500ml，鼓n2搅拌反应2h，反应终点以kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用1000ml dmf、dcm、dmf分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，按照达西高血糖素肽序，逐一和保护氨基酸偶联；依次连接的保护氨基酸为：fmoc
‑
leu
‑
glu(otbu)
‑
oh、fmoc
‑
trp(boc)
‑
oh、 fmoc
‑
val
‑
lys(boc)
–
oh、fmoc
‑
phe
‑
oh、fmoc
‑
glu(otbu)
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
glu(otbu)
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
arg(pbf)
ꢀ‑
oh、fmoc
‑
aib
‑
oh、fmoc
‑
leu
‑
asp(otbu)
‑
oh，fmoc
‑
tyr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
lys(boc)
–
oh、fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
tyr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
asp(otbu)
‑
oh、fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
thr (tbu)
‑
oh、fmoc
‑
phe
‑
oh、fmoc
‑
gly
‑
thr(tbu)
‑
oh、boc
‑
1his(trt)
‑
ser(tbu)
‑
gln(trt)
‑
oh,得到达西高血糖素肽树脂378.9g。
[0033]
实施例11：达西高血糖素肽树脂的制备
准确称取实施例8替代度为0.35mmol/g 的fmoc
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thr(tbu)
‑
ctc resins 57.1g(合成规模20mmol)置于合成柱中，加入500ml dcm溶胀30min；抽滤掉dcm后，500ml dmf洗涤2次，加入20%哌啶/dmf溶液500ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用500ml dmf、dcm、dmf分别洗涤2次；加入fmoc
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ser(tbu)
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oh 15.4g(40mmol)、hobt 5.4g(40mmol)和dic 6.2ml(40mmol)的dmf溶液500ml，鼓n2搅拌反应2h，反应终点以kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用500ml dmf、dcm、dmf分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，按照达西高血糖素肽序，逐一和保护氨基酸偶联；依次连接的保护氨基酸为：fmoc
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leu
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glu(otbu)
‑
oh、fmoc
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trp(boc)
‑
oh、 fmoc
‑
val
‑
lys(boc)
–
oh、fmoc
‑
phe
‑
oh、fmoc
‑
glu(otbu)
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
glu(otbu)
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
arg(pbf)
ꢀ‑
oh、fmoc
‑
aib
‑
oh、fmoc
‑
leu
‑
asp(otbu)
‑
oh，fmoc
‑
tyr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
lys(boc)
–
oh、fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
tyr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
asp(otbu)
‑
oh、fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
thr (tbu)
‑
oh、fmoc
‑
phe
‑
oh、fmoc
‑
gly
‑
thr(tbu)
‑
oh、boc
‑
1his(trt)
‑
ser(tbu)
‑
gln(trt)
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oh,得到达西高血糖素肽树脂158.2g。
[0034]
实施例12：达西高血糖素肽树脂的裂解将实施例10得到的378.0g利拉鲁肽肽树脂，加入到冷冻的3800ml裂解液(体积配比为tfa/tis/h20=95/2.5/2.5)中，室温下搅拌反应3h；裂解反应结束，过滤树脂，400mltfa洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，旋蒸浓缩至2000ml,倒入20l冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得粗肽168.6g,粗肽收率99.7%，纯度76.8%。
[0035]
实施例13：达西高血糖素肽树脂的裂解将实施例11得到的158.0g利拉鲁肽肽树脂，加入到冷冻的1600ml裂解液(体积配比为tfa/tis/h20=95/2.5/2.5)中，室温下搅拌反应3h；裂解反应结束，过滤树脂，150mltfa洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，旋蒸浓缩至1000ml,倒入10l冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得粗肽63.8g,粗肽收率94.7%，纯度78.2%。
[0036]
实施例14：达西高血糖素粗肽的纯化将实施例12所得粗肽168.0g用400ml醋酸溶解,待完全溶解后，加水稀释至10l;溶液用0.45um滤膜过滤备用。
[0037]
内径为150mm c18制备柱，流动相为50mm醋酸铵/水
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1.0%醋酸/乙腈体系，上样量为30g/次，流速500ml/min，梯度洗脱；峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度合格的精肽溶液，脱盐后冻干得精肽96.2g，总收率56.9%，纯度99.62%以上，单杂均小于0.2%.实施例15：达西高血糖素粗肽的纯化将实施例13所得粗肽60.0g用400ml醋酸溶解,待完全溶解后，加水稀释至10l;溶液用0.45um滤膜过滤备用。
[0038]
内径为150mm c18制备柱，流动相为50mm醋酸铵/水
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1.0%醋酸/乙腈体系，上样量为30g/次，流速500ml/min，梯度洗脱；峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度合格的精肽溶液，脱盐后冻干得精肽38.9g，总收率61.2%，纯度99.79%以上，单杂均小于0.2%。