一种提高光异养体系微藻产油率的方法与流程

1.本发明属于微藻生物技术领域，涉及一种提高光异养条件下微藻产油率的方法。


背景技术：

2.生物柴油即脂肪酸甲酯，是一种生物质能源，具有可再生的特点。它主要来源于产油作物，如大豆、葵花籽等，但产量低、成本高、与其他农作物争夺土地等缺点限制了其进一步发展。一部分微藻富含油脂，由于其生长周期短且无需占用耕地，成为生物柴油的新来源。在微藻产油的商业化过程中，高昂的生产成本是微藻生产生物柴油所面临的首要瓶颈问题,。如何减少藻类产油商业化成本成为一个极富有研究价值的课题，其中提高微藻的产油率是一种有效的解决途径。
3.现今，关于微藻产油的研究多数是采用光自养培养方式。但是由于光自养培养细胞密度低，而光异养培养则可以克服这一缺点。光异养培养还可以吸收废水中的有机碳进行生长并积累油脂，达到处理废水和产油的双赢。
4.但是，在光异养条件下单独对微藻进行培养，微藻的产油率较低。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种提高光异养条件下微藻产油率的方法，通过将微藻与荚膜红细菌在光异养培养基中进行共生培养来提高微藻产油率。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
7.一种提高光异养体系微藻产油率的方法，所述方法包括以下步骤：
8.(1)将微藻在自养培养基中扩大培养，离心后悬浮于光异养培养基中得到微藻液；
9.(2)将荚膜红细菌在光合细菌培养基中扩大培养，离心后悬浮于光异养培养基中得到荚膜红细菌菌液；
10.(3)将所述微藻液、所述荚膜红细菌菌液接种到光异养培养基中，进行光异养培养。
11.所述微藻液中的生物量为1.0
‑
1.5g/l；所述荚膜红细菌菌液中的生物量为1.0
‑
1.5g/l。
12.步骤(3)中，所述微藻液、荚膜红细菌菌液的重量比为10:1～10:3；接种后，所述光异养培养基中的初始生物量为400～500mg/l。
13.步骤(3)中，所述光异养培养的条件为：在22～26℃、6000～10000lux的光照强度下搅拌培养6天。
14.所述光照强度优选为7000至9000lux，再优选7500至8500lux，最优选8000lux。
15.所述微藻为绿藻门小球藻属。
16.所述微藻为普通小球藻或蛋白核小球藻。
17.所述自养培养基为改良c培养基。
18.所述光合细菌培养基为112van niel’s yeat agar培养基。
19.所述光异养培养基为添加了乙酸钠的改良c培养基。
20.所述光异养培养基包括以下原料：乙酸钠、ca(no3)2·
4h2o、kno3、c3h7na2o6p
·
5h2o、mgso4·
7h2o、维生素b
12
、生物素、盐酸硫胺素、三(羟甲基)氨基甲烷、na2edta
·
2h2o、fecl3·
6h2o、mncl2·
4h2o、zncl2、cocl2·
6h2o和na2moo4·
2h2o。
21.所述光异养培养基中的各原料含量如下：乙酸钠2～10g/l、ca(no3)2·
4h2o 100～200mg/l、kno
3 500～1500mg/l、c3h7na2o6p
·
5h2o 25～75mg/l、mgso4·
7h2o 20～60mg/l、维生素b
12 0.05～0.15μg/l、生物素0.05～0.15μg/l、盐酸硫胺素5～15μg/l、三(羟甲基)氨基甲烷250～750mg/l、na2edta
·
2h2o 2～5mg/l、fecl3·
6h2o 500～700μg/l、mncl2·
4h2o 100～120μg/l、zncl
2 25～35μg/l、cocl2·
6h2o 10～15μg/l和na2moo4·
2h2o 5～10μg/l，ph 6.0～8.0。
22.所述乙酸钠的含量优选2g/l至8g/l，再优选4g/l至6g/l，最优选5g/l。
23.所述ca(no3)2·
4h2o的含量优选125mg/l至175mg/l，再优选140mg/l至160mg/l，最优选150mg/l。
24.所述kno3的含量优选750mg/l至1250mg/l，再优选900mg/l至1100mg/l，最优选1000mg/l。
25.所述c3h7na2o6p
·
5h2o的含量优选40mg/l至60mg/l，再优选45mg/l至55mg/l，最优选50mg/l。
26.所述mgso4·
7h2o的含量优选30mg/l至50mg/l，再优选35mg/l至45mg/l，最优选40mg/l。
27.所述维生素b
12
的含量优选0.07μg/l至0.13μg/l，再优选0.09μg/l至0.11μg/l，最优选0.1μg/l。
28.所述生物素的含量优选0.07μg/l至0.13μg/l，再优选0.09μg/l至0.11μg/l，最优选0.1μg/l。
29.所述盐酸硫胺素的含量优选7μg/l至13μg/l，再优选9μg/l至11μg/l，最优选10μg/l。
30.所述三(羟甲基)氨基甲烷的含量优选400mg/l至600mg/l，再优选450mg/l至550mg/l，最优选500mg/l。
31.所述na2edta
·
2h2o的含量优选2mg/l至4mg/l，再优选2.5mg/l至3.5mg/l，最优选3mg/l。
32.所述fecl3·
6h2o的含量优选550μg/l至650μg/l，再优选550μg/l至600μg/l，最优选588μg/l。
33.所述mncl2·
4h2o的含量优选100μg/l至115μg/l，再优选105μg/l至110μg/l，最优选108μg/l。
34.所述zncl2的含量优选28μg/l至32μg/l，再优选30μg/l至32μg/l，最优选31.2μg/l。
35.所述cocl2·
6h2o的含量优选11μg/l至14μg/l，再优选11μg/l至13μg/l，最优选12μg/l。
36.所述na2moo4·
2h2o的含量优选6μg/l至9μg/l，再优选7μg/l至8μg/l，最优选7.5μg/l。
37.所述光异养培养基的ph优选为6.5至7.5，再优选6.8至7.2，最优选7.0。
38.相对于现有技术中的方案，本发明具有以下优点：
39.(1)本发明通过将微藻与荚膜红细菌在光异养培养基中进行共生培养来提高光异养培养微藻的产油率，培养体系的生物量产率相比较于纯微藻体系可提高65％以上，脂肪酸产率相比较于纯微藻体系可增加30％；
40.(2)在微藻液、荚膜红细菌菌液的重量比为10:1～10:3时，荚膜红细菌的加入可显著提高微藻的产油率。
附图说明
41.图1为实施例1生物量的变化情况；
42.图2为实施例1脂肪酸含量和产率情况；
43.图3为实施例2生物量的变化情况；
44.图4为实施例2脂肪酸含量和产率情况。
具体实施方式
45.下面结合实施例对本发明进行详细说明。
46.本发明各实施例中的微藻均为绿藻门小球藻属，购于日本nies藻种库；
47.本发明各实施例中的荚膜红细菌为红细菌属，购于广东省微生物菌种保藏中心。
48.本发明各实施例中所使用的改良c培养基、112van niel’s yeat agar培养基、光异养培养基的成分分别为：
49.改良c培养基：ca(no3)2·
4h2o 150mg/l、kno
3 1000mg/l、c3h7na2o6p
·
5h2o 50mg/l、mgso4·
7h2o 40mg/l、维生素b
12 0.1μg/l、生物素0.1μg/l、盐酸硫胺素10μg/l、三(羟甲基)氨基甲烷500mg/l、na2edta
·
2h2o 3mg/l、fecl3·
6h2o 588μg/l、mncl2·
4h2o 108μg/l、zncl
2 31.2μg/l、cocl2·
6h2o 12μg/l和na2moo4·
2h2o 7.5μg/l，ph 7.0，溶剂为蒸馏水；
50.112van niel’s yeat agar培养基：k2hpo
4 1g/l、mgso
4 0.5g/l和yeast extract 10g/l，ph 7.0，溶剂为蒸馏水。
51.光异养培养基：乙酸钠5g/l，ca(no3)2·
4h2o 150mg/l、kno
3 1000mg/l、c3h7na2o6p
·
5h2o 50mg/l、mgso4·
7h2o 40mg/l、维生素b
12 0.1μg/l、生物素0.1μg/l、盐酸硫胺素10μg/l、三(羟甲基)氨基甲烷500mg/l、na2edta
·
2h2o 3mg/l、fecl3·
6h2o 588μg/l、mncl2·
4h2o 108μg/l、zncl
2 31.2μg/l、cocl2·
6h2o 12μg/l和na2moo4·
2h2o 7.5μg/l，ph 7.0，溶剂为蒸馏水。
52.实施例1
53.一种提高光异养体系微藻产油率的方法，包括以下步骤：
54.(1)将改良c培养基加入1l光合反应器中，每瓶分装0.6l，然后121℃高压蒸汽灭菌20分钟，当培养基降温至室温时，在超净工作台中接入普通小球藻开始自养扩大培养，co2与空气的混合气体在反应器顶端通过0.22μm的滤器除菌后进入反应器，曝气速率为0.5v/v/min，其中co2浓度为4％，温度控制在24
±
2℃，光照强度为8000lux；培养时间为7d，培养结束后6000转/分钟离心10分钟收集微藻，并将收集的微藻悬浮于光异养培养基中得到微藻液，微藻液中的生物量为10
‑
15g/l。
55.(2)将112van niel’s yeat agar培养基加入250ml螺口锥形瓶中，每瓶分装0.25l，然后121℃高压蒸汽灭菌20分钟，当培养基降温至室温时，在超净工作台中接入荚膜红细菌菌液开始扩大培养，在24
±
2℃温度、8000lux光照强度下培养7d；培养结束后8000转/分钟离心10分钟收集荚膜红细菌，并将收集的荚膜红细菌悬浮于光异养培养基中得到荚膜红细菌菌液，荚膜红细菌菌液中的生物量为1.0
‑
1.5g/l。
56.(3)将光异养培养基加入1l锥形瓶中，每瓶分装0.7l，然后121℃高压蒸汽灭菌20分钟，当培养基降温至室温时，将微藻液和荚膜红细菌菌液按照重量比10:1的比例进行接种，使体系初始生物量为330mg/l，在24℃、8000lux的光照强度下开始光异养培养，培养时间为6d，培养过程中的搅拌速率为200转每分钟。
57.经过六天光异养培养，藻菌混合体系的生物量产率为201mg/l/d，高于纯细菌体系(42mg/l/d)和纯微藻体系(121mg/l/d)生物量产率的加和。藻菌混合体系的最终脂肪酸产率为33mg/l/d，是纯微藻体系的脂肪酸产率(25mg/l/d)的1.32倍。
58.上述纯细菌体系、纯微藻体系的培养过程分别如下：
59.纯细菌体系的培养过程：将光异养培养基加入1l锥形瓶中，每瓶分装0.7l，然后121℃高压蒸汽灭菌20分钟，当培养基降温至室温时，将步骤(2)中的荚膜红细菌菌液进行接种，使体系初始生物量为30mg/l，在24℃、8000lux的光照强度下开始光异养培养，培养时间为6d，培养过程中的搅拌速率为200转每分钟。
60.纯微藻体系的培养过程：将光异养培养基加入1l锥形瓶中，每瓶分装0.7l，然后121℃高压蒸汽灭菌20分钟，当培养基降温至室温时，将步骤(1)中的微藻液进行接种，使体系初始生物量为300mg/l，在24℃、8000lux的光照强度下开始光异养培养，培养时间为6d，培养过程中的搅拌速率为200转每分钟。
61.实施例2
62.一种提高光异养体系微藻产油率的方法，包括以下步骤：
63.(1)将改良c培养基加入1l光合反应器中，每瓶分装0.6l，然后121℃高压蒸汽灭菌20分钟，当培养基降温至室温时，在超净工作台中接入蛋白核小球藻开始自养扩大培养，co2与空气的混合气体在反应器顶端通过0.22μm的滤器除菌后进入反应器，曝气速率为0.5v/v/min，其中co2浓度为4％，温度控制在24
±
2℃，光照强度为8000lux；培养时间为7d，培养结束后6000转/分钟离心10分钟收集蛋白核小球藻，并将收集的蛋白核小球藻悬浮于光异养培养基中得到微藻液，微藻液中的生物量为10
‑
15g/l。
64.(2)将112van niel’s yeat agar培养基加入250ml螺口锥形瓶中，每瓶分装0.25l，然后121℃高压蒸汽灭菌20分钟，当培养基降温至室温时，在超净工作台中接入荚膜红细菌菌液开始扩大培养，在24
±
2℃温度、8000lux光照强度下培养7d；培养结束后8000转/分钟离心10分钟收集荚膜红细菌，并将收集的荚膜红细菌悬浮于光异养培养基中得到荚膜红细菌菌液，荚膜红细菌菌液中的生物量为1.0
‑
1.5g/l。
65.(3)将光异养培养基加入1l锥形瓶中，每瓶分装0.7l，然后121℃高压蒸汽灭菌20分钟，当培养基降温至室温时，将微藻液和荚膜红细菌菌液按照重量比10:1的比例进行接种，体系初始生物量为330mg/l，在24℃、8000lux的光照强度下开始光异养培养，培养时间为6d，培养过程中的搅拌速率为200转每分钟。
66.经过六天光异养培养，藻菌混合体系的生物量产率为176mg/l/d，高于纯细菌体系
(42mg/l/d)和纯微藻体系(105mg/l/d)生物量产率的加和。藻菌混合体系的最终脂肪酸产率为35mg/l/d，是纯微藻体系的脂肪酸产率(27mg/l/d)的1.30倍。
67.上述纯细菌体系、纯微藻体系的培养过程分别如下：
68.纯细菌体系的培养过程：将光异养培养基加入1l锥形瓶中，每瓶分装0.7l，然后121℃高压蒸汽灭菌20分钟，当培养基降温至室温时，将步骤(1)中的荚膜红细菌菌液进行接种，使体系初始生物量为30mg/l，在24℃、8000lux的光照强度下开始光异养培养，培养时间为6d，培养过程中的搅拌速率为200转每分钟。
69.纯微藻体系的培养过程：将光异养培养基加入1l锥形瓶中，每瓶分装0.7l，然后121℃高压蒸汽灭菌20分钟，当培养基降温至室温时，将微藻液进行接种，使体系初始生物量为300mg/l，在24℃、8000lux的光照强度下开始光异养培养，培养时间为6d，培养过程中的搅拌速率为200转每分钟。
70.对比例1
71.对比例1相对于实施例1，将微藻液和荚膜红细菌菌液按照重量比10:5的比例进行接种，经过六天光异养培养，藻菌混合体系的生物量产率为152mg/l/d，低于纯细菌体系42mg/l/d和纯微藻体系121mg/l/d生物量产率的加和。藻菌混合体系的最终脂肪酸产率为23mg/l/d，是纯微藻体系的脂肪酸产率(25mg/l/d)的0.92倍。
72.对比例2
73.对比例2相对于实施例2，将微藻液和荚膜红细菌菌液按照重量比10:5的比例进行接种，经过六天光异养培养，藻菌混合体系的生物量产率为137mg/l/d，低于纯细菌体系42mg/l/d和纯微藻体系105mg/l/d生物量产率的加和。藻菌混合体系的最终脂肪酸产率为26mg/l/d，是纯微藻体系的脂肪酸产率(27mg/l/d)的0.96倍。
74.上述各实施例和对比例中涉及到的细胞干重、脂肪酸含量以及生物量产率的测定和计算方法如下：
75.细胞干重测定：先将0.45μm的醋酸纤维膜烘至恒重，记录质量为m0(g)在细胞培养过程中每24h取培养液v ml，将其抽滤过膜，再次烘至恒重，记录质量为m1(g)。干重c可根据下式计算：c(g/l)＝(m1‑
m0)*1000/v。
76.生物量产率＝细胞干重/取样时培养的天数。
77.含油量与组成测定：培养结束后收获藻菌，并将其冷冻干燥48h，称取25mg冷冻干燥后的藻菌粉于消解管中，加入2ml乙酰氯与甲醇按照1:9的体积比组成的酯化试剂，80℃水浴反应2.5小时。冷却至室温后加入1ml质量分数为0.58％nacl溶液停止酯化反应。紧接着再加入2ml正己烷(溶有苯甲酸甲酯作为标准物质，浓度为0.36mg/ml)，充分混匀后低转速离心，溶液分层之后取上清液进行气相分析，测试脂肪酸的含量(含油量)。
78.产油率：由生物量和含油量计算得出。
[0079][0080]
其中，生物量的单位为mg/l、含油量的单位为mg/l、产油率的单位为mg/l/d。
[0081]
上述参照实施例对一种提高光异养条件下微藻产油率的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。