一种提高5-羟基色氨酸产量的发酵工艺的制作方法

一种提高5
‑
羟基色氨酸产量的发酵工艺
技术领域
1.本发明涉及氨基酸衍生物生产领域，尤其是一种提高5
‑
羟基色氨酸产量的发酵工艺。


背景技术：

[0002]5‑
羟基色氨酸(5
‑
hydroxytryptophan,5
‑
htp)，化学名称为5
‑
羟基
‑3‑
吲哚基
‑
a氨基丙酸，能在体内维生素b6的帮助下通过脱羧基转化为5
‑
羟色胺(5
‑
ht)，又被称为血清素。5
‑
羟基色氨酸是神经递质5
‑
羟色胺(5
‑
ht)的前体，该物及其代谢产物具有生物学活性，参与细胞间的信号传递，参与体内的多种活动，人类的抑郁、睡眠、食欲以及疼痛均与之有关。研究表明，5
‑
羟基色氨酸可抑制食欲，减少脂肪摄取，减少焦虑，控制情绪，促进睡眠。也可作为食品成分，在许多饮食所含的蛋白质中可以找到。由于血清素是褪黑素的前身，因此当血清素的含量提高时，褪黑素的含量也就增加，使得睡眠更为香甜。
[0003]
目前医药业所用的5
‑
羟基色氨酸多从加纳籽中提取，此前多为水热法、醇法及超声法提取，刘岱琳等人采用树脂吸附的方法从加纳籽中分离5
‑
羟基色氨酸，提取率为原料中单位含量的7倍左右。但随着人类对环境的过度开发与污染，非洲加纳树的存在也越来越稀少，这对于5
‑
羟基色氨酸的生产行业无疑是难以解决的困难。


技术实现要素：

[0004]
本发明所要解决的技术问题在于提供一种提高5
‑
羟基色氨酸产量的发酵工艺。
[0005]
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0006]
一种提高5
‑
羟基色氨酸产量的发酵工艺，一方面将金属离子螯合氨基酸添加到发酵培养基中，另一方面在发酵2h流加复合辅料，所述金属离子螯合氨基酸由蛋氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锰和谷氨酸螯合铜组成，其中，蛋氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锰和谷氨酸螯合铜的重量比为4
‑
5：4
‑
5：1；所述复合辅料为色氨酸、谷氨酰胺和α
‑
酮戊二酸的混合液，色氨酸、谷氨酰胺和α
‑
酮戊二酸的重量比为1
‑
2：4
‑
6：1
‑
2。
[0007]
优选的，上述提高5
‑
羟基色氨酸产量的发酵工艺，具体步骤如下：
[0008]
(1)活化培养：从
‑
80℃冰箱中取出5
‑
羟基色氨酸生产菌e.coli htp10保菌管，传两代斜面，活化培养，采用的斜面培养基为：蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，酵母粉5g/l，nacl 2.5g/l，琼脂粉25g/l，ph＝6.8
‑
7.0；
[0009]
(2)种子培养：将活化菌株全部接种到种子罐，得到种子液，采用的种子培养基为：葡萄糖20g/l，mgso
4 0.5g/l，kh2po
4 1.2g/l，(nh4)2so
4 5g/l，酵母浸粉10g/l，v
b1 0.3mg/l，v
h 0.2mg/l，消泡剂1g/l，并用氨水将培养基调节并维持ph到6.7
‑
7.0；
[0010]
(3)发酵培养：接种12
‑
16％的种子液到发酵罐，连续培养，发酵2h流加复合辅料混合液，菌种培养40h，得到发酵液，采用的发酵培养基为：蛋氨酸螯合铁200mg/l、丙氨酸螯合锰200mg/l、谷氨酸螯合铜50mg/l(蛋氨酸螯合铁200mg/l、丙氨酸螯合锰200mg/l、谷氨酸螯合铜50mg/l混合组成金属离子螯合氨基酸)、葡萄糖20g/l，酵母粉4g/l，mgso
4 1.2g/l，
kh2po
4 2g/l，(nh4)2so
4 5g/l，玉米浆20ml/l，v
b mix 2mg/l,用氨水将发酵罐培养调节并维持ph到6.7
‑
7.0。
[0011]
优选的，上述提高5
‑
羟基色氨酸产量的发酵工艺，所述金属离子螯合氨基酸配制方法是将蛋氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锰和谷氨酸螯合铜混合物按比例添加后，研磨、混匀，在干燥的条件下封存，留备后用。
[0012]
优选的，上述提高5
‑
羟基色氨酸产量的发酵工艺，所述金属离子螯合氨基酸为固体混合物，和其他培养基一起配成发酵培养基。
[0013]
优选的，上述提高5
‑
羟基色氨酸产量的发酵工艺，所述发酵前期流加复合辅料，是将三种辅料加无菌水按照比例配成一定浓度复合辅料液体混合液，115℃，灭菌15分钟，在发酵刚开始就通过蠕动泵缓慢的流加到发酵液中，其流加速率为到发酵结束刚好流加完。
[0014]
优选的，上述提高5
‑
羟基色氨酸产量的发酵工艺，所述蛋氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锰和谷氨酸螯合铜在发酵培养基中的含量分别为200
‑
250mg/l、200
‑
250mg/l、40
‑
62.5mg/l。
[0015]
优选的，上述提高5
‑
羟基色氨酸产量的发酵工艺，所述金属离子螯合氨基酸混合物中蛋氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锰和谷氨酸螯合铜在发酵培养基中的含量分别为200mg/l、200mg/l、50mg/l。
[0016]
优选的，上述提高5
‑
羟基色氨酸产量的发酵工艺，所述复合辅料混合液中色氨酸、谷氨酰胺和α
‑
酮戊二酸流加含量分别为1
‑
2g/l、4
‑
6g/l、1
‑
2g/l。
[0017]
优选的，上述提高5
‑
羟基色氨酸产量的发酵工艺，所述色氨酸为5
‑
羟基色氨酸前体物(具体合成路线见图1，由色氨酸(l
‑
trp)到5
‑
羟基色氨酸(5
‑
htp))；谷氨酰胺为邻氨基苯甲酸的合成提供氨基(具体合成路线见图1，由分支酸(cho)到5
‑
羟基色氨酸(atn)中加入了谷氨酰胺(gln))；α
‑
酮戊二酸，加强tca循环途径，促进辅酶fadh2、nadh的生成。
[0018]
优选的，上述提高5
‑
羟基色氨酸产量的发酵工艺，所述α
‑
酮戊二酸(α
‑
kg)生产辅酶fadh2、nadh的公式为α
‑
kg h2o fad 2nad adp＝oaa fadh2 2nadh co2 atp，此反应在三羧酸循环(tca)中。
[0019]
优选的，上述提高5
‑
羟基色氨酸产量的发酵工艺，所述色氨酸、谷氨酰胺和α
‑
酮戊二酸流加含量分别为2g/l、4g/l、2g/l。
[0020]
优选的，上述提高5
‑
羟基色氨酸产量的发酵工艺，流加的所述复合辅料混合液用无菌水提前溶解，不调ph。
[0021]
优选的，上述提高5
‑
羟基色氨酸产量的发酵工艺，所述v
b mix
为v
b1
、v
b3
、v
b5
、v
b12
的等质量混合液。
[0022]
有益效果：
[0023]
上述提高5
‑
羟基色氨酸产量的发酵工艺，采用金属离子螯合氨基酸，一方面补充了发酵培养基中有效氨基酸的营养成分，另一方面增加了菌体对于微量元素的吸收效果，提高了菌体的生长活力和生产性能；同时谷氨酰胺的添加为5
‑
羟基色氨酸中间物邻氨基苯甲酸的合成提供氨基，提高了合成5
‑
羟基色氨酸的转氨效率；α
‑
酮戊二酸满足了合成5
‑
羟基色氨酸能量供应，前体物色氨酸促进了5
‑
羟基色氨酸的合成能力，流加α
‑
酮戊二酸，能够加强tca循环途径，促进辅酶fadh2、nadh的生成，为5
‑
羟基色氨酸的合成提供大量的能量。由于色氨酸60元/
㎏
，5
‑
羟基色氨酸800元/
㎏
，廉价的色氨酸作为5
‑
羟基色氨酸的前体物，
少量的添加，可以提高价格昂贵的5
‑
羟基色氨酸的合成速率；同时5
‑
羟基色氨酸的合成需要大量的能量供应。
[0024]
本发明所述工艺的大肠杆菌e.coli htp10已经加入了色氨酸羧化酶基因，能够催化色氨酸生成5
‑
htp，具有生产周期短，可连续生产，反应条件温和等优势。同时大肠杆菌e.coli htp10为原核生物的模式菌株，其遗传信息清晰，发酵条件成熟，适合作为宿主细胞用于5
‑
htp生物合成的研宄工作。
附图说明
[0025]
图1为5
‑
羟基色氨酸的合成途径。
具体实施方式
[0026]
实施例1
[0027]
一种提高5
‑
羟基色氨酸产量的发酵工艺，具体步骤如下：
[0028]
(1)活化培养：从
‑
80℃冰箱中取出5
‑
羟基色氨酸生产菌e.coli htp10(由e.coli w3110(atcc 27325)经人工改造获得，购自天津科技大学)保菌管，传两代斜面，活化培养，采用的斜面培养基包括：蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，酵母粉5g/l，nacl 2.5g/l，琼脂粉25g/l，ph＝6.8
‑
7.0；
[0029]
(2)种子培养：将活化菌株全部接种到种子罐，得到种子液，采用的种子培养基为：葡萄糖20g/l，mgso
4 0.5g/l，kh2po
4 1.2g/l，(nh4)2so
4 5g/l，酵母浸粉10g/l，v
b1 0.3mg/l，v
h 0.2mg/l，消泡剂1g/l，并用氨水将培养基调节并维持ph到6.7
‑
7.0；
[0030]
(3)发酵培养：接种15％的种子液到发酵罐，连续培养，2h流加100ml复合辅料混合液，每升发酵液中流加复合辅料混合液成分为2g色氨酸、4g谷氨酰胺和2gα
‑
酮戊二酸，发酵34h得到发酵液。采用的发酵培养基为：葡萄糖20g/l，酵母粉4g/l，mgso
4 1.2g/l，kh2po
4 2g/l，(nh4)2so
4 5g/l，玉米浆20ml/l，v
b mix 2mg/l，用氨水将发酵罐培养调节并维持ph到6.7
‑
7.0之间。
[0031]
上述e.coli htp10由e.coli w3110(atcc 27325)经人工改造获得的具体方法为：由野生型大肠杆菌经下述方法改造得到的：敲除tnaa基因以阻止色氨酸及5
‑
羟基色氨酸的分解代谢；在其基因组的laciz位点上整合了由木糖启动子p
xylf
控制的t7rnap基因，在失活laci蛋白的同时使细胞可以利用木糖诱导产生rna聚合酶t7rnap；用解除反馈抑制的突变体trpe
fbr
基因替换大肠杆菌原有的trpe基因，并用p
trc
启动子引导色氨酸操纵子的表达，以强化分支酸途径；将解除反馈抑制的突变体arog
fbr
基因sera
fbr
基因串联整合至大肠杆菌基因组的yjiv位点，并用p
trc
启动子引导表达，以强化莽草酸途径和丝氨酸合成途径；敲除tyrr基因及trpr基因，以实现负转录调控蛋白tyrr和trpr的缺失；在其基因组mbha位点整合了由t7启动子引导表达的编码人源2型色氨酸羟基化酶短截突变体的tph150基因，以构建胞内色氨酸羟基化途径；将来源于枯草芽孢杆菌的mtra基因和来源于人类的ptps基因、spr基因、pcd基因和dhpr基因，串联整合至大肠杆菌基因组yghx位点处，以引入辅酶四氢蝶呤的合成途径与再生途径，其中mtra基因、ptps基因、spr基因由同一个p
trc
启动子引导表达，pcd基因、dhpr基因由同一个p
trc
启动子引导表达；其中，
[0032]
所述野生型大肠杆菌为e.coli w3110，保藏号atcc 27325；
[0033]
所述木糖启动子p
xylf
具有序列表seq id no.seq id no.1所示核苷酸序列；
[0034]
所述rna聚合酶t7rnap具有序列表seq id no.2所示核苷酸序列；
[0035]
所述trpe
fbr
基因具有序列表seq id no.3所示核苷酸序列；
[0036]
所述p
trc
启动子，具有序列表seq id no.4所示核苷酸序列；
[0037]
所述arog
fbr
基因具有序列表seq id no.5所示核苷酸序列；
[0038]
所述sera
fbr
基因具有序列表seq id no.6所示核苷酸序列；
[0039]
所述强启动子pt7启动子具有序列表seq id no.7所示核苷酸序列；
[0040]
所述编码人源2型色氨酸羟基化酶短截突变体的tph150基因具有序列表seq id no.8所示核苷酸序列；
[0041]
所述mtra基因来源于枯草芽孢杆菌，负责编码gtp环化水解酶ⅰ，具有序列表seq id no.9所示核苷酸序列；
[0042]
所述人源ptps基因，负责编码6
‑
丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶，具有序列表seq id no.10所示核苷酸序列；
[0043]
所述人源spr基因，负责编码鸟蝶呤还原酶，具有序列表seq id no.11所示核苷酸序列；
[0044]
所述人源pcd基因，负责编码蝶呤
‑
4α
‑
甲醇氨脱水酶，具有序列表seq id no.12所示核苷酸序列；
[0045]
所述人源dhpr基因，负责编码双氢蝶呤还原酶，具有序列表seq id no.13所示核苷酸序列。
[0046]
实施例2
[0047]
一种提高5
‑
羟基色氨酸产量的发酵工艺，参照实施例1，不同之处在于：不流加复合辅料混合液，同时在发酵培养基中加入金属离子螯合氨基酸，其成分蛋氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锰和谷氨酸螯合铜分别为200mg/l、200mg/l、50mg/l。
[0048]
实施例3
[0049]
一种提高5
‑
羟基色氨酸产量的发酵工艺，参照实施例1，不同之处在于：在发酵培养基中再加入金属离子螯合氨基酸，其成分蛋氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锰和谷氨酸螯合铜分别为200mg/l、200mg/l、50mg/l。
[0050]
实施例4
[0051]
一种提高5
‑
羟基色氨酸产量的发酵工艺，参照实施例1，不同之处在于：2h流加100ml复合辅料混合液，每升发酵液中流加复合辅料混合液成分为1g色氨酸、4g谷氨酰胺和1gα
‑
酮戊二酸；在发酵培养基中再加入金属离子螯合氨基酸，其成分蛋氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锰和谷氨酸螯合铜分别为250mg/l、250mg/l、60mg/l。
[0052][0053]
通过实施例1
‑
4分析可以得出，在
‑
羟基色氨酸发酵中，金属离子螯合氨基酸中蛋氨酸螯合铁、丙氨酸螯合锰和谷氨酸螯合铜最适添加量为200mg/l、200mg/l、50mg/l，流加复合辅料混合液最适成分为2g/l色氨酸、4g/l谷氨酰胺和2g/lα
‑
酮戊二酸，最终在5l发酵罐中，菌体生物量od
600
达到了126，5
‑
羟基色氨酸产量为2.6g/l。
[0054]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。