一种控制大豆叶色相关基因紧密连锁标记与应用的制作方法

id no.3所示。
11.本发明还提供了上述连锁标记或上述的引物对在大豆育种中的应用。
12.本发明还提供了上述的引物对在制备控制大豆叶色相关基因检测试剂盒中的应用。
13.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种控制大豆叶色相关基因紧密连锁标记与应用，取得的技术效果在于：本发明利用ems诱变zp661筛选获得的大豆黄化突变体h745为材料，通过叶绿素含量测定及叶绿体超微结构观察进行表型鉴定；并利用zp661
×
h745(f2)分离群体中的黄、绿个体构池进行bsa
‑
seq测序，并结合分离群体进行连锁分析确认区间；针对候选基因的变异位点开发dcaps标记h745
‑
5，利用开发的dcaps标记鉴定zp661
×
h745(f2)群体获得基因型数据，鉴定了标记的准确性及可靠性。
附图说明
14.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
15.图1附图为本发明提供的zp661、h745花期植株表型图。
16.图2附图为本发明提供的zp661、h745花期植株上部表型图。
17.图3附图自左至右为本发明提供的zp661、h745花期植株上部、中部、下部叶片叶绿素含量示意图。
18.图4附图为本发明提供的zp661、h745花期植株中部叶片叶绿体超微结构图。
19.图5附图为本发明提供的叶片黄化突变体h745的农艺性状分析图。
20.图6附图为本发明提供的ed法关联分析图，其中，横坐标：染色体名称，彩色的点代表每个snp位点的ed值，黑色的线为拟合后的ed值，红色的虚线代表显著性关联阈值，纵坐标：ed值。
21.图7附图为本发明提供的ed法关联分析图，横坐标为染色体名称，彩色的点代表计算出来的snp
‑
index(或δsnp
‑
index)值，黑色的线为拟合后的snp
‑
index(或δsnp
‑
index)值。由上至下依次为隐性混池的snp
‑
index值的分布图、显性混池的snp
‑
index值的分布图、δsnp
‑
index值的分布图，其中红色的线代表99百分位数的阈值线。
22.图8附图为本发明提供的位点鉴定及caps/dcaps开发图。
23.图9附图为本发明提供的连锁标记h745
‑
5鉴定zp661
×
h745(f2:3)电泳图，其中泳道1：marker，泳道2：母本zp661(a)，泳道3：父本h745(b)；其他：zp661
×
h745(f2:3)群体中的黄绿叶单株(h)。
具体实施方式
24.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.本发明实施例公开了一种控制大豆叶色相关基因紧密连锁标记与应用。
26.实施例中，野生型大豆种质zp661(zp661)由中国农业科学院作物科学研究所提供。叶片黄化突变体h745来源于中国农业科学院作物科学研究所大豆基因资源挖掘与利用课题组构建的zp661突变体库。
27.实施例1
28.1.野生型、突变体材料的表型鉴定参照邱丽娟等编著的《大豆种质资源描述规范和数据标准》。2016～2018年，在中国农业科学院作物科学研究所北京顺义试验站分别对叶片黄化突变体h745及野生型大豆品种zp661进行整个生育期，尤其盛花期及成熟期田间表型观察、鉴定，与盛花期进行叶绿素含量鉴定，成熟期分别选取zp661和h745各10株考种，进行株高、底荚高度、节数、分枝数、单株荚数、百粒重等主要农艺性状测定并照相。
29.2.光合色素含量测定
30.盛花期时(r2)，选取长势一致的野生型zp661及叶片黄化突变体h745，测定植株上中下部叶片的色素含量。操作方法：称取0.1g左右叶片剪碎置于5ml 95％乙醇中，混匀后封口避光处理24～48h，期间多次振荡混匀，至叶片完全失绿，变为白色，重复10次。采用du800uv/vis紫外分光光度计(beckman cloulter)测定665nm、649nm和470nm波长下的吸光值。
31.叶绿素a浓度ca＝13.95
×
d665～6.88
×
d649
32.叶绿素b浓度cb＝24.96
×
d649～7.32
×
d665
33.类胡萝卜素浓度cx＝(1000
×
d470～2.05
×
ca
‑
114
×
cb)/245
34.叶绿体色素含量(mg/g)＝色素浓度(c)
×
提取液体积(ml)/样品鲜重或干重(g)
35.3.叶绿体超薄切片制备及透射电镜观察
36.固定：取新鲜大豆叶片，用超薄刀片切割，取0.5～1mm3方块，置于1.5ml戊二醛固定液中，真空泵抽真空，直到叶片方块沉降至离心管底部，置于4℃冰箱固定。脱水：室温下，用0.1mol pbs(ph＝7.2)清洗3次，每次清洗15min；然后用锇酸处理1.5h，再用0.1mol pbs(ph＝7.2)清洗3次，每次15min；随后分别利用30％、40％、50％、60％、70％、85％、95％乙醇逐级脱水，每次15min。最终用无水乙醇(100％)完成脱水，两次重复，每次15min。渗透：将脱水后的叶片置于100％丙酮中进行渗透，2次重复，每次渗透15min。随后将叶片置于树脂混合液(丙酮：树脂＝1：1)中渗透2.5h。再将样品置于树脂混合液(丙酮：树脂＝1：3)中渗透3h。最后进入纯树脂中，4℃过夜。包埋：将用于包埋的叶片样品加入树脂，并用牙签将完成处理的叶片挪至包埋块中并沉入底部，调整叶片方向以便入刀切割，完成后置于65℃恒温箱固定24h。制片：将做好的树脂包埋块固定在leica em uc7型超薄切片机上，切片后用铜网直接捞取；先将超薄切片用柠檬酸铅(现用现配)染色15min，再用去二氧化碳双蒸水清洗3次；用醋酸双氧铀染色30min，最后再用去二氧化碳双蒸水清洗3次后超净台中放置干燥。观察：样品切片干燥后，置于分析型透射电子显微镜(日立ht7700)下观察，并拍照保存。
37.结果表明：
38.黄化突变体h745表型为叶片黄化，该植株从苗期起即可显现叶片黄化表型，盛花期(r2)植株株高较野生型植株矮小、叶片小，茎秆细(图1、图2)；叶绿素含量测定结果表明，h745植株上中下部叶片叶绿素含量均显著低于野生型zp661(图3)；叶绿体超微结构观察发现，与野生型相比，h745叶绿体基粒堆叠显著低于zp661(图4)，可能是产生该黄化表型的原
因。
39.实施例2
40.1.遗传群体构建
41.在中国农业科学研究所北京顺义试验基地，以zp661为母本，以黄化突变体h745为父本，配置杂交组合并获得杂交籽粒。2017年夏在同一地点进行f1代植株繁殖并收获籽粒，2018年在同一地点种植f2代群体，并于2019年继续种植f3代群体并进行表型鉴定，以验证f2群体基因型。
42.2.基因组dna提取
43.样品准备：称取大豆幼嫩叶片0.1g～0.5g置于2ml离心管中，并在管盖和管壁上标记样品编号，加钢珠后在液氮中速冻，然后在振荡器上振荡，直至将叶片研磨为粉末状。裂解：加入600℃的2％的ctab(添加1/1000体积β
‑
巯基乙醇)提取液，震荡混匀后用磁铁吸去钢珠后置于65℃水浴50min。抽提：加等体积600μl苯酚/氯仿(1:1)抽提，轻摇震荡混匀，12000r/min离心10min。分离：取上清于做好样品标记的新的1.5ml离心管中，向其中加入2倍体积的异丙醇，
‑
20℃中放置5min以保证dna充分沉淀，取出后10000r/min离心8min。洗涤：弃上清，加入500μl 70％乙醇清洗，10000r/min离心5min；重复洗涤。溶解：加入200μl ddh2o充分溶解，于
‑
20℃保存。
44.3.bsa
‑
seq分析
45.实验流程为北京百迈克生物科技有限公司参照illumina公司的标准方法执行，主要包括dna样品检测、文库构建、文库质量检测及上机测序。样品检测合格后，利用超声破碎将基因组dna随机打断为350bp片段，经末端修复、3’端加a、添加测序接头、纯化、pcr扩增后完成测序文库的构建。经质检合格后利用illumina hiseq测序。测序数据的信息分析的内容包括：数据质控、与参考基因组比对、变异检测及注释。
46.4.关联分析、候选snp及候选基因注释
47.根据测序材料与参考基因组比对，汇总样品间存在的差异变异位点。在关联分析前对snp进行过滤。利用欧式距离(euclidean distance，ed)算法及snp
‑
index法分析，从而获得混池间存在显著差异的位点。
48.ed法：从测序数据中寻找两个表型混池间具有显著差异的遗传标记，并以此评估并获得与目标表型关联的区域。理论上，用于bsa
‑
seq分析的混池间目标性状相关联的位点标记会存在差异，而其他位点应趋向于一致，表现为非目标位点的ed值接近0。ed法计算公式如下，ed值越大表明遗传标记在两表型池间差异越大。在分析时，利用两表型池间存在基因型差异的snp，并统计各碱基在各表型混池中的测序深度，计算每个位点的ed值，对原始ed值进行乘方处理并根据数据选择适宜的关联值以达到消除背景噪音的效果，进而利用distance法完成ed值的拟合。利用基因组上标记的位置，对同一染色体上标记ed值进行拟合以达到消除假阳性位点的目的，并选择关联阈值以上的区域作为与目标表型相关联的区域。
49.snp
‑
index法：通过表型混池间基因型频率差异进行标记关联分析，主要是寻找混池间存在基因型频率显著差异的位点，并用δ(snp
‑
index)统计。某snp与目标性状关联度越强，其δ(snp
‑
index)值越接近1。为消除假阳性位点影响，利用基因组上的标记位置对同一染色体标记的δsnp
‑
index值进行拟合，然后利用distance法对δsnp
‑
index进行拟合，
然后选择关联阈值以上的区域作为与目标表型相关联的区域。理论上，与目标性状连锁的位点及其附近的关联位点应趋近于该阈值，因此显著关联的区间处会出现一个较高的峰值。
50.结果表明：
51.2018年秋，于北京顺义，针对叶片黄化突变体h745及其野生型zp661进行成熟期时田间考种(图5)，与zp661(ck)相比，黄化突变体h745，除底荚高度及主茎节数外，株高、有效分枝数、单株荚数及百粒重均显著下降。
52.利用构建的zp661
×
h745(f2，418)进行遗传分析，结果表明，该叶片黄化表型受隐性单基因控制。
53.表1黄化突变体h745遗传分析
[0054][0055]
利用zp661
×
h745(f2)群体，选择黄化突变体h745植株10株混样用于构建突变型亲本池(r1)，利用f2群体中野生型绿色个体、黄化个体各51株，分别构建野生型后代混池(r2)及突变型后代混池(r3)。经琼脂糖凝胶电泳测定dna质量，将检测合格的基因组dna进行建库测序。
[0056]
分析时，利用两混池间基因型存在差异的snp位点，统计各个碱基在不同混池中的测序深度，并计算每个位点ed值，为消除背景噪音，对原始ed值进行乘方处理，本项目取原始ed的5次方作为关联值以达到消除背景噪音的功能，然后采用distance方法对ed值进行拟合(图6)，取所有位点拟合值的median 3sd作为分析的关联阈值[316]，计算得0.08。根据关联阈值判定，共得到位于11号染色体的2个区间，总长度为6.65mb，共包含1,355个基因(表2)。
[0057]
表2 ed关联分析、snp
‑
index关联区间
[0058][0059]
并采用distance方法对δsnp
‑
index进行拟合，然后根据关联阈值，选择阈值以上的区域作为与性状相关的区域(图7)。根据实施例群体的理论分离比，计算关联阈值为
0.667。理论上，目标位点及其附近的连锁位点应趋近于该阈值，因此显著关联的区域附近应该出现一个较高的峰值。但从结果上看，没有超过理论阈值的区域，说明本实验中没有发现显著的定位结果。为了充分利用数据，将阈值降低以寻找比较可能的定位区域，利用拟合后δsnp
‑
index的99百分位数，即0.24，共得到3个区域，总长度为9.56mb，共包含2,021个基因(表2)。
[0060]
经过ed、snp
‑
index两种方法关联分析结果联合分析，其中ed关联分析的区间包含在snp
‑
index关联分析的区间中，所以定位区间总长度为6.65mb。针对zp661(r4)、h745(r1)、野生型绿叶池(r2)、突变型黄叶池(r3)样品间候选区域内的snp注释结果进行统计，结果如表3所示。
[0061]
表3关联区间内snp、indel分类
[0062][0063]
参照bsa筛选标准，经过对bsa
‑
seq数据候选期间snp位点进行筛选鉴定，共筛选到19个符合bsa变异规律的变异位点，其中包括1个终止密码子获得snp，4个非同义编码snp，4个基因上游变异snp，一个基因下游snp，2个同义编码变异snp，7个内含子变异snp，1个基因间区变异snp位点。
[0064]
实施例3
[0065]
基于候选区间内测序数据，在关联区间内19个符合bsa构池规律的snp位点中选择9个位于基因上的位点(图8)，分别为进行snp验证及caps/dcaps开发(根据重测序数据中获
得的变异位点，然后从phytozome网站https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#中获得snp位点附件相关序列，设计引物进行鉴定)。经鉴定，9个位点中h745
‑
1位点snp为假，h745
‑
4扩增片段为同源序列、h745
‑
8扩增条带双峰；其他6个位点均为突变snp(即位点变异与测序结果一致)，成功开发为caps/dcaps标记，用于鉴定群体。
[0066]
通过6个caps/dcaps标记进行481个f2：3群体检测，将候选区间缩小至h745
‑
3、h745
‑
6之间，区间大小1.072m，其中标记h745
‑
5标记基因型与表型连锁(图9)。
[0067]
紧密连锁的连锁标记开发及引物序列
[0068]
根据测序数据及各个基因的序列信息，从phytozome网站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)中获得相关序列。利用dcaps finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)进行标记开发。与本研究中大豆叶色紧密连锁的分子标记，h745
‑
5的上游引物为5
′‑
atctggcgagggagattctg
‑3′
，如seq id no.2所示；下游引物5
′‑
actcgttggcaccaccgtccat
‑3′
，如seq id no.3所示,扩增条带大小201bp(atctggcgagggagattctgaaggtgacgccgaaggggaatccgatgcagttcggacgcaggattggactggaaggtgtgattagggttttggaaggggcagtgttcgagtacgcggaggtgcaggagattctggaacggagaggaaagggtgagaatttggagtatcttgtgcggtgg(a)atggacggtggtgccaacgagt，如seq id no.1所示)，内切酶为bcci(购自北京百灵克生物科技有限公司)，识别野生型反向序列ccatc。生成引物后，利用大豆phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)及soybase(https://www.soybase.org/)数据库对引物进行特异性分析，至少保证一条引物在基因组中特异存在。引物序列发公司合成后，首先溶解成100μm母液，使用时，稀释成10μm工作液。利用easy taq进行片段pcr扩增，经琼脂糖凝胶电泳成像鉴定条带大小正常后，利用sanger法检测目标条带序列以鉴定扩增产物准确性。
[0069]
pcr扩增
[0070]
反应体系(20μl)包括：1～2μl dna模板(80～150ng)，上游和下游引物各0.6μl，10
×
easy taq buffer(mg
2
free)2μl，dntps(2.5mm)2μl，easy taq聚合酶(全式金，ap111)0.2μl，ddh2o补足至20μl。pcr反应程序：95℃预变性5min，95℃30s，(tm
‑
5)℃退火30s，72℃延伸(1min/kb)，35个循环，72℃延伸8min。
[0071]
其中，dna模板为亲本及群体的苗期叶片经ctab法提取的基因组dna。
[0072]
琼脂糖凝胶电泳
[0073]
pcr扩增产物采用0.8～2％的琼脂糖凝胶进行鉴定。制胶：称取0.8
‑
2g琼脂糖粉末，放入盛有100ml电泳缓冲液1
×
tae的三角瓶中，置于微波炉中加热至琼脂糖完全溶解；待液体温度降至50～60℃后，将其缓缓倒入已放置胶槽并插上梳子的制胶板中，去除气泡；待凝胶完全凝固后，缓慢垂直向上拔出梳子，然后轻轻取出放置凝胶的制胶板，将二者共同置于电泳槽中，向其中加入1
×
tae电泳缓冲液(添加1/30体积的eb溶液后混匀)至液面没过凝胶。电泳：取pcr扩增产物6μl样品，向其中加入1μl 6
×
loading buffer(含溴酚蓝指示剂)，混合后点样。点样完毕后调整电压至120v，电流调整为400ma，开始电泳后再确认开始(电极丝产生气泡)，电泳约30min后，在凝胶成像系统中观察并拍照保存。
[0074]
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0075]
向pcr产物中添加4μl 10
×
loading buffer，混合均匀后取1.5μl样品，用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(non
‑
denaturing polyacrylamide gel electrophoresis，non
‑
page)检测。制板：平板、凹板玻璃洗干净并直立晾于水平桌面上，用70％乙醇擦洗，保证板上无残胶，将两板对扣一起，凹板置于平板下，中间空腔用于灌充凝胶，两侧用夹子夹住，保证不漏液。灌胶：准备前期配好的凝胶30ml，加入1％体积的过硫酸铵(aps)和1
‰
体积的tmed，水平混匀并轻轻灌入两板之间。插入清洗干净的梳子，梳齿伸入凝胶内1.0cm左右；置于常温凝固30min～1h，随时观察，以防凝胶缩裂变形。上板：将凝固的凝胶去掉夹子并冲洗干净(去除残胶)，将梳子轻轻拔出，确保点样孔完整并无残胶；两板相对直立放置并用夹子固定于电泳槽上，并保证缓冲液不漏液；上下电泳槽内各添加入0.5
×
tbe缓冲液，使下边没过卡槽、上部没过点样孔。点样：用注射器清理点样孔，将气泡及碎胶等杂质吹出点样孔，用微量移液器将已加入少量溴酚蓝指示剂的1.0～1.5μl非变性pcr产物注入点样孔，并在点样孔两端点样孔注入d2000 dna marker作为条带标记。电泳：电压250v下运行30～40min，随时观察溴酚蓝指示带，跑胶时间依条带大小而定。银染：电泳完成后取下电泳槽夹子，卸下凝胶板并撬开平板、凹板，取出凝胶后缓缓放入已配好的1％的agno3水溶液中银染，轻轻摇动保证凝胶完全接触银染液，3～5min后取出，用去离子水清洗30秒。显影：将凝胶置于显影液(1l去离子水，加入1.5g naoh和5～10ml甲醛并混匀)中显影，随时观察直至凝胶上条带清晰后，将凝胶移至去离子水中清洗，以结束显影并洗去显影液。封胶：桌面洗净，铺上一层保鲜膜，洒上少许清水，将完成显影的凝胶平展的置于保鲜膜上，再淋上少许清水后用保鲜薄膜密封，用塑料板滤去保鲜膜中多余的水和空气，平行放置于通风橱一段时间以去除甲醛。
[0076]
读带：将凝胶条带中与野生型zp661一致的条带标记为“a”，与突变体h745一致的条带类型标记为“b”，包括野生型、突变型双亲本条带的杂合型标记为“h”。
[0077]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0078]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。