一种氨氧化复合菌剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于微生物菌剂技术领域，特别涉及一种氨氧化复合菌剂及其制备方法和其应用。


背景技术：

2.近年来，煤制氢技术广泛运用，缓解了我国能源紧张的局面，与此同时大量的煤制氢废水的产生限制了煤制氢行业的进一步发展。这些煤制氢废水具有排放量大、氨氮浓度高及成分复杂难处理等特点。大量的氨氮排放引起河流污染，导致湖泊水不能饮用。不仅如此，氨氮污染还可引发我国附近海域的赤潮现象。因此，快速经济的降解高氨氮废水成为了众多石油化工行业的迫切需求。利用物化法处理高氨氮废水虽然操作简单效果稳定，但该技术所需费用较高，其造成的二次污染也较为严重；目前广泛使用的传统生物脱氮技术，由于自养氨氧化细菌的生长周期较长，导致其反应慢且脱氮速率低，需氧量大的特点，往往难以有效的处理煤制氢高氨氮废水。
3.随着技术的不断发展，异养氨氧化菌凭借其自身独特的优势，使得硝化过程更加简单快捷，抗环境干扰能力出众，大大提高了氨氮脱除速率。但是，煤制氢废水成分复杂，氨氮和cod浓度分别可达800mg/l和1000mg/l以上，同时还具有较高的钙镁离子浓度，这使得煤制氢废水成分波动性大。在污水处理厂对煤制氢废水进行脱氮净化处理时发现，由于煤制氢废水的成分变化波动大，使得硝化池和生化处理池中的活性污泥不稳定，运行一段时间后，处理速率降低。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提供了一种氨氧化复合菌剂及其制备方法和应用。所述复合菌剂具有种类多样、搭配合理、功能性强及抗环境干扰能力强的特点，不会对水域及周围的环境造成破坏，使用方便，并在实际的污水处理中，可以吸附于活性污泥中稳定存活，成为优势菌种，氨氮降解效果稳定，减少投资成本。
5.本发明是采用以下技术方案实现的：
6.一种新型高效氨氧化复合菌剂，包括三株高效氨氧化细菌，一株为脱氮副球菌属(paracoccus sp.)，该菌株分类学命名为副球菌paracoccus sp.td
‑
10，保藏号为cgmcc no.19059；一株为戈登氏菌属(gordonia sp.)，该菌株分类学命名为戈登氏菌gordonia sp.td
‑
46，保藏号为cgmcc no.19057；一株为粪产碱杆菌属(alcaligenes sp.)，该菌株分类学命名为产碱杆菌alcaligenes sp.td
‑
94，保藏号为cgmcc no.19058，三株菌都已于2019年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。
7.一种高效氨氧化复合菌剂的制备方法，具体步骤如下：
8.(1)复配菌剂初步构建
9.将筛选得到的五株高效氨氧化菌株分别转入种子培养基中。28℃，160rpm 活化
24h。在各菌株对数生长期时将各菌株分别两两复配，复配比为1：1，接种量为6％，然后转入优化基础培养基中培养。5天后测每组筛选培养基的氨氮含量和亚硝酸盐氮含量，分析各种组合的氨氮降解速率，挑选出拮抗作用最小的复配组合。
10.种子培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，nacl 10g，蒸馏水1l，ph 7.0
‑
7.4；优化基础培养基：nh4cl 0.382g，ch3coona 2g，mgso4·
7h2o 0.05g，k2hpo
4 0.2g，nacl 0.12g，mnso4·
4h2o 0.01g，feso4·
7h2o 0.01g，蒸馏水1 l，ph 7.0
‑
7.4。
11.(2)复配表构建复配菌剂
12.具体为：将三株高效氨氧化细菌在种子培养基中活化24h后，以各菌株1％、 2％和4％的接种量为变量，设计复配比例表，按照复配比例表制备复配菌剂并转接到优化基础培养基中，28℃，160rpm摇瓶培养2天后，测其培养基中的氨氮含量，选择氨氮剩余含量最低的组合，确定最佳复配。
13.种子培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，nacl 10g，蒸馏水1l，ph 7.0
‑
7.4；优化基础培养基：nh4cl 0.382g，ch3coona 2g，mgso4·
7h2o 0.05g， k2hpo
4 0.2g，nacl 0.12g，mnso4·
4h2o 0.01g，feso4·
7h2o 0.01g，蒸馏水1 l，ph 7.0
‑
7.4。
14.本发明的氨氧化复合菌剂是分别将三株高效氨氧化细菌通过种子培养基进行富集培养，得到三种菌种的种子液，按照td
‑
94：td
‑
10：td
‑
46＝4：1：4(体积比)混合，即得到复合菌剂cczu c6，该制备方法操作简单，过程易于控制。
15.(3)通过对复合菌剂的碳源、氮源、c/n比，初始ph、温度、转速等降解条件的优化，得到一种新型高效氨氧化复合菌剂cczu c6。
16.降解条件为：选取葡萄糖、蔗糖、乙酸钠、琥珀酸钠、柠檬酸钠及酒石酸钾钠作为备选碳源；选取100
‑
500mg/l浓度的氯化铵作为氮源；c/n比范围为 2
‑
18；初始ph值为5.2
‑
9.2；温度范围为24℃
‑
34℃；转速范围在140
‑
220rpm 之间。
17.进一步地，最佳降解条件为：选取乙酸钠作为唯一碳源，nh
4
‑
n浓度为300 mg/l，c/n比为8，初始ph值为7.2，培养温度为28℃，摇床转速为200rpm。
18.本发明的新型高效氨氧化复合菌剂用在煤制氢高氨氮废水中。
19.具体应用方法为：模拟工厂的废水进行实验室摇瓶小试，随后采集茂名石化a/o工艺池中的污泥和废水进行工厂中试。
20.本发明复合菌剂具有下述优点：
21.①
本发明的复合菌剂制备方法操作简单，过程易于控制，不会对水域及周围环境造成破坏；
22.②
本发明复合菌剂的三株菌种具有协同作用，投加入废水中使得细菌群落变得更加丰富，物种多样性得到提高，三种菌种成为优势菌株，其物种丰度不断提高，从而增强其生物脱氮的能力，使得废水中氨氮迅速降解。
23.③
本发明的复合菌剂，具有高效的脱氮性能，并可长期稳定的在活性污泥中存活，对活性污泥进行生物强化，进一步提高其处理煤制氢废水的速率。
24.④
本发明的复合菌剂具有脱氮速率高、抗环境能力强等优点，可广泛应用于煤化工污水、发酵污水、化工与制药类生产污水等高氨氮污水处理。
25.本发明的有益效果是：通过将三株高效氨氧化细菌进行复合配伍，获得一种新型高效氨氧化复合菌剂cczu c6，投加该复合菌剂48小时后，氨氮由初始的155.8mg/l降至
0.9mg/l，氨氮降解速率达到了77.4mg/l
·
d
‑1，氨氮去除率达到了99％。本发明的复合菌剂具有脱氮速率高、抗环境能力强等优点，可广泛应用于煤化工污水、发酵污水、化工与制药类生产污水等高氨氮污水处理，同时该制备方法操作简单，过程易于控制，因此具有良好的工业化应用前景。
26.以下结合说明书附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明，这些实施例仅用于解释说明的目的，并不对本发明做任何形式的限定。
附图说明
27.图1为单株菌及各复配组合氨氮含量、亚硝酸盐氮含量；
28.图2为不同碳源对复合菌剂cczu c6降解氨氮的影响；
29.图3为不同氮源浓度对复合菌剂cczu c6降解氨氮的影响；
30.图4为c/n比对复合菌剂cczu c6降解氨氮的影响；
31.图5为初始ph对复合菌剂cczu c6降解氨氮的影响；
32.图6为培养温度对复合菌剂cczu c6降解氨氮的影响；
33.图7为溶氧对复合菌剂cczu c6降解氨氮的影响；
34.图8为摇瓶试验结果；
35.图9为茂名石化中试结果。
具体实施方式
36.本发明采用的试剂均为市售分析纯及以上，试验所用菌株为常州大学实验室保藏菌株。本发明中测定氨氮和亚硝酸盐氮的方法：采用中华人民共和国国家环境保护标准水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法(hj 35
‑
2009)和水质亚硝酸盐氮的测定分光光度法(gb/t 7493
‑
1987)。
37.实施例1
38.(1)复配菌剂初步构建
39.将筛选得到的五株高效氨氧化菌株分别转入种子培养基中。28℃，160rpm 活化24h。在各菌株对数生长期时将各菌株分别两两复配，复配比为1：1，接种量为6％，转入优化基础培养基(初始氨氮含量100mg/l)中培养。5天后测每组筛选培养基的氨氮含量和亚硝酸盐氮含量，分析各种组合的氨氮降解速率，挑选出拮抗作用最小的复配组合，结果如图1所示。
40.由图1可见，复配组合td
‑
10 td
‑
94、td
‑
46 td
‑
94的效果较好。根据图1 (b)可得，td
‑
10及td
‑
46的亚硝酸盐氮的产量较低，而过高的亚硝酸盐氮可以抑制氨氧化菌的生长及氨氮降解速率。因此这两株菌和td
‑
94的复配效果较好。挑选td
‑
10、td
‑
46及td
‑
94号菌探究三株菌的最佳复配比。
41.(2)复配表构建复配菌剂
42.将三株氨氧化菌株分别接入种子培养基中。28℃，160rpm活化24h。在各菌株对数生长期时将菌株进行复配，以各菌株1％、2％和4％的接种量为变量，设计复配比例表(见表1)，按照复配比例表制备复配菌剂并转接到优化基础培养基(初始氨氮含量100mg/l)中，28℃，160rpm摇瓶培养两天后，测其培养基中的氨氮含量，选择氨氮剩余含量最低的组合，确
定最佳复配。
43.种子培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，nacl 10g，蒸馏水1l，ph 7.0
‑
7.4；优化基础培养基：nh4cl 0.382g，ch3coona 2g，mgso4·
7h2o 0.05g， k2hpo
4 0.2g，nacl 0.12g，mnso4·
4h2o 0.01g，feso4·
7h2o 0.01g，蒸馏水1 l，ph 7.0
‑
7.4。
44.表1 复配比例表
[0045][0046]
表1中结果显示，第六组复配比为td
‑
94：td
‑
10：td
‑
46＝4：1：4，氨氮剩余含量最低，氨氮降解速率最高，从而构建一种新型高效氨氧化复合菌剂，将其命名为复合菌剂cczu c6。在培养两天后，复合菌剂cczu c6的脱氮速率达到了41.74mg/l
·
d
‑1，48小时的氨氮去除率可达83.48％。
[0047]
实施例2
[0048]
考察不同碳源对复合菌剂cczu c6降解氨氮的影响，选取了葡萄糖、蔗糖、乙酸钠、琥珀酸钠、柠檬酸钠及酒石酸钾钠作为备选碳源，每组试验做3次对照，具体试验操作如下：
[0049]
将不同的碳源添加进优化基础培养基中，将复合菌剂cczu c6在种子培养基中活化24h，在其对数生长期用移液枪转移至优化基础培养基中，28℃，160 rpm摇瓶培养5天，每天检测培养基中nh
4
和no2‑
含量，结果如图2所示。
[0050]
本实施例说明，复合菌剂cczu c6以有机酸化合物作为碳源的培养基中的氨氮降解速率明显高于其他培养基，与之对应的有机酸为碳源的培养基中的亚硝酸盐氮含量相对较高，最终选择乙酸钠作为最佳碳源。
[0051]
实施例3
[0052]
考察不同的氨氮浓度下复合菌剂cczu c6降解氨氮的影响。选取氯化铵作为唯一碳源，设置氮源浓度分别为100mg/l、150mg/l、200mg/l、250mg/l、 300mg/l、350mg/l、400mg/l、450mg/l、500mg/l，每组试验做3次对照，具体试验操作见实施例2，结果如图3所示。
[0053]
本实施例说明，在不同氮源浓度的培养基中，当降解培养基中的氮源浓度从100mg/l逐渐增加到300mg/l时，氨氮的降解速率缓慢提升，亚硝酸盐生成率不断升高。当降解培养基中的氮源浓度继续提升到500mg/l时，氨氮的降解速率逐渐降低，亚硝酸盐的含量
不断降低。不断提高氮源浓度可以为微生物的生长提供充足的异养，可以提高复配菌剂的氨氮降解速率；而过高的氮源浓度限制了复配菌剂cczu c6的生长，使得氨氮无法降解，最终选择300mg/l作为最佳氨氮浓度。
[0054]
实施例4
[0055]
考察c/n比对复合菌剂cczu c6降解氨氮的影响。选取最佳碳源和氨氮浓度，设置c/n比分别为2、5、8、10、14、18，每组试验做3次对照，具体试验操作见实施例2，结果如图4所示。
[0056]
本实施例说明，由于碳源时微生物生长的必要因素，过低的碳源浓度使得微生物难以持续生长，而过高的碳源浓度使得微生物产生大量有害的代谢产物，同时还使得工厂成本增加。因此最终选取最佳c/n比为8。
[0057]
实施例5
[0058]
考察初始ph值对复合菌剂cczu c6降解氨氮的影响。设置培养基的初始 ph值为5.2、6.2、7.2、8.2、9.2，每组试验做3次对照，具体试验操作如下：
[0059]
将复合菌剂cczu c6在种子培养基中活化24h，在其对数生长期用移液枪转移至碳源、氮源浓度及c/n最佳选择的优化基础培养基中，并设置优化基础培养基的初始ph值为5.2、6.2、7.2、8.2、9.2，28℃，160rpm摇瓶培养5天，每天检测培养基中nh
4
和no2‑
含量，结果如图5所示。
[0060]
本实施例说明，当ph过低时，复合菌剂cczu c6的氨氮降解效果收到了明显的抑制，远大于ph过高所带来的抑制效果。当ph在7.2
‑
8.2之间时，复合菌剂cczu c6脱氮速率较高，因此选择ph为7.2，其脱氮速率最佳。
[0061]
实施例6
[0062]
考察培养温度对复合菌剂cczu c6降解氨氮的影响。设置培养基的培养温度为24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，每组试验做3次对照，具体试验操作见实施例5，结果如图6所示。
[0063]
本实施例说明，低温对氨氧化菌的抑制效果明显，复合菌剂cczu c6对温度提升的耐受力较好，因此最终选择28℃为最佳培养温度。
[0064]
实施例7
[0065]
考察溶氧对复合菌剂cczu c6降解氨氮的影响。设置摇床转速为140rpm、160rpm、180rpm、200rpm、220rpm，每组试验做3次对照，具体试验操作见实施例5，结果如图7所示。
[0066]
本实施例说明，过低或过高的转速都会降低其氨氮降解速率，但影响较小，当转速为200rpm时，其氨氮降解速率最高，因此最终选择200rpm为最佳摇床转速。
[0067]
实施例8
[0068]
新型高效氨氧化复合菌剂在煤制氢高氨氮废水中的应用一：模拟工厂的废水进行实验室摇瓶小试，具体试验操作如下：
[0069]
摇瓶小试是从中国石化茂名分公司采集污泥与废水，从而模拟工厂的废水进行实验室培养，以研究复合菌剂cczu c6的环境适应能力，从而为放大的工厂中试提供理论指导。设置六组不同的对照组试验，每组量取50ml废水(初始氨氮191mg/l、cod1400 mg/l)于250ml锥形瓶中，添加污泥，并投加乙酸钠，设置c/n为8，接种量10％，28℃，160rpm摇瓶培养，每天检测水中的氨氮和亚硝酸盐氮含量。每组试验做3次对照，结果如图8所示。
[0070]
本实施例说明，当复合菌剂和污泥中的其他菌株共同生长时，氨氮降解速率更加突出，说明了复合菌剂cczu c6和废水中的其他微生物可以共生，迅速成为优势菌株，从而更高效的进行脱氮反应。
[0071]
实施例9
[0072]
新型高效氨氧化复合菌剂在煤制氢高氨氮废水中的应用二：采集茂名石化 a/o工艺池中的污泥和废水进行工厂中试，具体试验操作如下：
[0073]
从茂名石化a/o工艺池采集20l高氨氮废水(cod 1321mg/l，氨氮155.8 mg/l，碱度821.11mg/l,ph 8.6)及20l活性污泥，投入装置中开启气泵曝气搅拌两小时以启动污泥。将复合菌剂通过种子液活化，取5l种子液8000rpm，离心10min后弃去上清液，将菌体投入装置中，每天添加12g乙酸钠作为碳源，设置曝气搅拌时间两小时一组(90min曝气，30min搅拌)，不断循环。每天测水样的氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、cod等。通过排水阀将降解达标的污水排出，重新加入高氨氮废水(不再投复合菌剂)，重复三次验证复合菌剂cczu c6 可在附着在污泥上持续生存并进行废水的氨氮降解。结果如图9所示。
[0074]
本实施例说明，投加该复合菌剂48小时后，氨氮由初始的155.8mg/l降至 0.9mg/l，氨氮降解速率达到了77.4mg/l
·
d
‑1，氨氮去除率达到了99％，远远高于实验摇瓶处理的氨氮降解速度。这可能是因为中试装置的放大效应，使得复合菌剂在污泥中和其他菌协同作用，加快了氨氮降解速率。亚硝酸盐在前两次的中试中未能积累，不断转化为硝酸盐氮，cod含量明显降低，装置中的细菌数大量增长。此次中试达到了理想目标，经过三次重复试验，结果表明复合菌剂cczu c6可以在a/o池活性污泥中可稳定存活，且氨氮降解率速率较稳定，具有较高的推广和实际应用价值。