一种四环素新型tet34抗性基因及其应用的制作方法

1.本发明涉及环境和生物检测技术领域，尤其是涉及一种四环素新型tet34抗性基因及其应用。


背景技术：

2.四环素是一种广谱抗生素，通过与30s核糖体结合并抑制氨酰trna进入mrna的核糖体复合物的受体位点，从而最终抑制微生物体内蛋白质的合成，对革兰氏阳性和阴性菌都具有较好的抑制作用，因此被广泛用于治疗细菌感染和畜牧业中作为添加剂促进动物生长。
3.近年来，随着抗生素的大量使用，不可避免地造成了大量抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,args)和抗性菌株的形成。四环素抗性菌株和抗性基因的出现，导致药物治疗效益显著下降，使得四环素乃至整个四环素抗生素家族的临床疗效降低甚至消失，对人类和动物健康构成严重威胁。因此，新型四环素抗性基因的发现对临床治疗以及风险评估具有重要的现实意义。目前所采用的新型抗生素抗性基因的鉴别方法主要基于纯培养和分子生物学手段，该方法鉴定周期较长，且操作复杂，效率较低，不利于大范围的实施检测。


技术实现要素：

4.为了解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的目的在于提供一种四环素新型tet34抗性基因及其应用，申请人基于nanopore和illumina测序技术，并通过异源表达进行功能验证，发现了一个潜在的四环素抗性基因tet34，补充了四环素抗性基因的数据库，对了解四环素的抗性机制提供了帮助，也为后续四环素作用靶点研究提供理论支持。发现新基因的方法操作简单易行，可对新型四环素抗性基因进行预测筛选，在保证预测结果准确性的基础上大大缩短了检测周期。
5.为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：一方面，本发明提供了一种四环素新型tet34抗性基因，其核苷酸序列如seq id no：1所示。
6.另一方面，本发明提供了一种发现四环素新型tet34抗性基因的方法，包括以下步骤：
7.(1)菌株的收集；
8.(2)基因组dna提取；
9.(3)基因组的测序；
10.(4)基因组的组装；
11.(5)基因组的开放阅读框预测；
12.(6)将预测的开放阅读框与数据库的比对；
13.(7)开放阅读框的扩增和异源表达。
14.进一步地，所述菌株为具有四环素抗性的抗性菌株escherichia coli tet。
15.进一步地，步骤(1)中所述菌株菌体的收集为：将过夜培养的菌液通过6000
‑
8000rpm，4℃离心5
‑
10分钟，弃上清后收集沉淀。
16.进一步地，步骤(3)中所述基因组测序采用的平台为nanopore promethion和illumina novaseq 6000。
17.进一步地，步骤(4)中所述基因组的组装为通过采用unicycler软件对样品质控后的测序数据进行混合组装，获得菌株的完整基因组数据；
18.优选地，所述unicycler软件的具体参数如下：unicycler
‑
1tet_1.fq
‑
2tet_2.fq
‑
l tet.nano.fq
‑
o tet
‑
t 46
‑‑
mode normal
–
min_polish_size 2000；其中tet_1.fq和tet_2.fq为illlumina测序的双端数据，tet.nano.fq为nanopore测序数据。
19.进一步地，步骤(5)中所述基因组的开放阅读框预测为经过prodigal软件对获得的完整基因组数据进行开放阅读框(open reading frame,orf)预测；
20.优选地，所述prodigal软件的具体参数如下：prodigal
‑
i tet.fa
‑
m
‑
o tet_temp.txt
‑
a tet_orf.aa
‑
d tet_orf.fa；其中tet.fa为unicycler混合组装获得的基因组，tet_orf.aa和tet_orf.fa分别为预测得到的orf的氨基酸和核酸序列。
21.进一步地，步骤(6)中所述将预测的开放阅读框与数据库的比对包括使用diamond软件将预测得到的orf与sarg数据库进行比对，提取比对结果；采用hmmer软件将比对相似性较低的orf与sargfam数据库进行比对，得到基于模型比对的orf注释结果。
22.进一步地，所述diamond软件的具体参数如下：diamond blastp
‑‑
query tet_orf.aa
‑‑
db sarg.2.2.fasta
‑‑
threads 46
‑‑
outfmt 5
‑‑
evalue 1e
‑5‑‑
max
‑
target
‑
seqs 1
‑‑
out tet_sarg_blastp_out
‑‑
query
‑
cover 70；其中tet_orf.aa为预测得到的orf的氨基酸序列，sarg.2.2.fasta为抗性基因数据库；
23.优选的，所述的hmmer软件的具体参数如下：hmmscan
‑‑
tblout hmm_out.txt
‑‑
cut_ga sargfam.hmm tet_orf.aa；sargfam.hmm为sargfam数据库，tet_orf.aa为预测得到的orf的氨基酸序列，hmm_out.txt为结果输出文件。
24.进一步地，步骤(7)中所述开放阅读框的扩增和异源表达为采用primer premier 5.0软件设计扩增该orf的特异性引物对如下：
25.p1
‑
f:5
’‑
atgaaacatactgtagaag
‑3’
seq id no：2
26.p1
‑
r:5
’‑
ttactcgtccagcagaatc
‑3’
seq id no：3
27.以步骤(2)中得到的e.coli tet基因组dna为模板进行目的基因pcr扩增，并将该目的基因片段e.coli bl21进行异源表达，同时测定四环素对异源表达菌株e.coli bl21的最小抑制浓度。
28.另一方面，本发明提供了一种四环素新型tet34抗性基因的应用，用于补充四环素抗性基因的数据库。
29.本发明的有益效果是：本技术发现了一个潜在的四环素抗性基因tet34，补充了四环素抗性基因的数据库，对了解四环素的抗性机制提供了帮助，也为后续四环素作用靶点研究提供理论支持。该基因的发现方法基于nanopore和illumina测序技术获得完整的细菌基因组图谱，测序通量更高、读长更长、精确度更高，组装过程中可对数据进行自我校准，获得的基因组准确度更高，与现有的数据库进行比较，初步筛选相应的抗性基因，进而采用hmm模型进行扫描，对新型抗性基因进一步确定，操作简便快捷，大大缩减了检测周期。
具体实施方式
30.以下将结合实施例对本发明的实施方法及结果分析进行详细地描述，以充分地理解本发明的特点和效果。这里需指出的是，所描述的实施例是叙述性的，不限定全部实施例，不能以此限定本发明的保护范围。
31.实施例1：四环素抗性菌株基因组dna的提取和测序
32.这里以具有四环素抗性的抗性菌株escherichia coli tet为例。将2ml过夜培养的菌液通过6000rpm，4℃离心5分钟，弃上清后收集沉淀，使用bacteria dnakit试剂盒完成其基因组dna的提取，通过1％的琼脂糖凝胶电泳和nanodrop one超微量分光光度计(thermo fisher scientific,usa)检验基因组dna的完整性和浓度，随后将获得的基因组dna送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司利用nanopore promethion和illumina novaseq 6000平台对其进行测序。
33.实施例2：菌株基因组的组装与orf预测
34.对实施例1中获得的测序数据进行质控获得clean data，随后采用unicycler软件对样品的测序数据进行混合组装，获得菌株的完整基因组数据，所述unicycler软件的具体参数如下：
35.unicycler
‑
1tet_1.fq
‑
2tet_2.fq
‑
l tet.nano.fq
‑
o tet
‑
t 46
‑‑
mode normal
–
min_polish_size 2000
36.其中tet_1.fq和tet_2.fq为illlumina测序的双端数据，tet.nano.fq为nanopore测序数据。
37.再经过prodigal软件对获得的菌株的完整基因组数据进行开放阅读框(orf)预测，所述prodigal软件的具体参数如下：
38.prodigal
‑
i tet.fa
‑
m
‑
o tet_temp.txt
‑
a tet_orf.aa
‑
d tet_orf.fa
39.其中tet.fa为unicycler混合组装获得的基因组，tet_orf.aa和tet_orf.fa分别为预测得到的orf的氨基酸和核酸序列。
40.实施例3：orf与sarg数据库比对
41.采用diamond软件将实施例2中获得的orf氨基酸序列与sarg数据库进行比对，结果表明，有orf516的注释结果为四环素抗性基因，其与数据库中参考基因序列tet34的相似度为25.5％。
42.实施例4：通过隐马尔可夫模型(hidden markov model，hmm)比对获得潜在新型arg
43.将实施例3中得到的orf516定义为潜在的新型基因，采用hmm模型进行进一步确认，从hmm模型的比对结果中可以看出，该orf也被注释为tet34基因，因此该orf被认为是潜在的新型基因tet34_like。
44.实施例5：目的基因orf516(tet34)的异源表达
45.采用primer premier 5.0软件设计扩增该orf的特异性引物对如下：
46.p1
‑
f:5
’‑
atgaaacatactgtagaag
‑3’
seq id no：2
47.p1
‑
r:5
’‑
ttactcgtccagcagaatc
‑3’
seq id no：3
48.以实施例1中获得的基因组dna为模板进行目的基因pcr扩增，pcr扩增反应体系总体积为50μl，具体为25μl 2
×
premix，10μm p1
‑
f和p1
‑
r各2μl，dna模板1μl，ddh2o 20μl；反
应程序为：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min，16℃保温；pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后使用胶回收试剂盒将目的基因片段纯化回收，将纯化后的目的基因片段与peasy
‑
t1载体在37℃连接5分钟，随后将5μl连接产物加至50μl感受态细胞(e.coli dh5α)中，冰浴20分钟；42℃热激30秒，再冰浴2分钟，加入250μl lb液体培养基，37℃、150rpm条件下培养1小时后；吸取80μl培养物涂布于含有氨苄青霉素的lb平板上，用封口膜封口后于37℃倒置培养过夜；挑选单克隆使用通用引物对m13f/m13r进行菌落pcr验证阳性克隆；
49.将阳性克隆用lb液体培养基(含100mg/l氨苄青霉素)37℃，200rpm培养16h后用质粒提取试剂盒提取质粒(peasy
‑
t1
‑
tet34)，并用限制性内切酶bamh i和not i对质粒peasy
‑
t1
‑
tet34和pet28a进行双酶切，将质粒peasy
‑
t1
‑
tet34和pet28a的酶切产物分别回收，随后将其回收产物进行连接，构建重组质粒pet28a
‑
tet34，将重组质粒pet28a
‑
tet34转化至50μl感受态细胞(e.coli bl21)中冰浴20分钟；42℃热激30秒，再冰浴2分钟，加入250μl lb液体培养基，37℃、150rpm条件下培养1小时后；吸取80μl培养物涂布于含有氨苄青霉素的lb平板上，用封口膜封口后于37℃倒置培养过夜；挑选单克隆使用特异性引物对p1
‑
f/p1
‑
r验证阳性克隆。
50.实施例6：重组菌株e.coli bl21(pet28a
‑
tet34)四环素抗性的测定
51.以带空载体的克隆e.coli bl21(pet28a)作为对照，采用2倍稀释法测定四环素对菌株e.coli bl21(pet28a)和重组菌株e.coli bl21(pet28a
‑
tet34)的最小抑制浓度，结果表明重组菌株对四环素的抗性高于菌株e.coli bl21(pet28a)，表明tet34可使得菌株获得一定的四环素抗性，tet34是四环素的潜在耐药基因
52.上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所述技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。