实时荧光定量检测猪全血弓形体和附红细胞体的PCR引物探针组、试剂盒及其检测方法与流程

实时荧光定量检测猪全血弓形体和附红细胞体的pcr引物探针组、试剂盒及其检测方法
技术领域
1.本发明涉及pcr检测技术领域，尤其涉及一种实时荧光定量检测猪全血弓形体和附红细胞体的双重pcr引物探针组与试剂盒，以及pcr试剂盒的检测方法。


背景技术：

2.弓形体病是由刚第弓形虫引起的一种人畜共患寄生虫病，可通过口、眼、鼻、呼吸道、肠道、皮肤等途径侵入猪体。病猪会出现高热、淋巴结肿大、头、耳、下腹部有淤血斑或发绀等症状；怀孕母猪则出现流产、死胎和畸胎等症状。附红细胞体病是附红细胞体寄生在猪或人红细胞内并通过媒介传播的人兽共患病，可造成猪发热、贫血、黄疸以及耳尖、四肢和腹下出血等临床症状。不同品种和日龄猪对弓形虫和附红细胞体均易感，其中以仔猪和怀孕母猪受到的危害最严重，可导致猪只死亡。猪弓形体病和附红细胞体病在临床上常呈混合感染，不仅导致畜产品质量和产量降低，动物生育能力下降，而且增加了治疗成本，给我国养猪业造成了严重的经济损失。因此除了对猪群加强程序化免疫外，在发病前早期诊断，早期用药显得十分必要。
3.猪弓形体病的诊断方法有直接涂片或组织切片法、动物试验法、elisa 等，这些方法在检测操作与检测结果方面都或多或少存在不足，无法有效做到疾病爆发前的早期诊断。随着生物技术的发展，应用荧光定量pcr和核酸分子杂交技术对弓形体病进行诊断越来越受到科学家的重视，且荧光定量 pcr检测方法可弥补免疫学方法因抗体滴度低而无法检出的不足。
4.附红细胞体病的诊断方法可通过直接镜检进行诊断，但假阳性率高；动物试验法耗时较长、费用高；血清学方法因附红细胞体的抗体变化起伏较大而不适用；普通pcr法在实际应用中会出现非特异和稳定性差的现象；随着核酸技术的发展，荧光定量pcr法则具有实时、灵敏和安全等优点，且准确性高。
5.目前已存在一些利用荧光定量pcr方法对这两种病原进行检测的报道和一些检测试剂盒，但都是对单一病原的检测，因此亟待建立一种可以同时并快速检测猪全血中弓形体和附红细胞体的方法及检测产品。


技术实现要素：

6.为解决现有技术存在的不足，本发明设计了一组实时荧光定量检测猪全血弓形体和附红细胞体的pcr引物探针组，利用该引物探针组对猪弓形体病和附红细胞体病同时进行荧光定量检测，具备高灵敏性、高特异性，高准确度且快速的优势，为一线猪场临床弓形虫病和附红细胞体病的早期诊断和防控监测工作提供可靠的技术和产品。
7.为实现上述目的，本发明提供的实时荧光定量检测猪全血弓形体和附红细胞体的pcr引物探针组，包括弓形体529基因的上游引物tg
‑
529
‑
f、下游引物tg
‑
529
‑
r和弓形体特异性荧光探针tg
‑
529
‑
p，附红细胞体16srrna的上游引物es
‑
f、下游引物es
‑
r和附红细胞体
特异性荧光探针es
‑
p；
8.上游引物tg
‑
529
‑
f:5
’‑
gccacagaagggacagaagtc
‑3’
，其为seqidno:1序列；
9.下游引物tg
‑
529
‑
r：5
’‑
gaaaagcagccaagccggaaa
‑3’
，其为seqidno:2序列；
10.弓形体特异性荧光探针tg
‑
529
‑
p:fam
‑5’‑
cgcttcccaaccacgccaccctctcat
‑3’‑
bhq1，其为seqidno:3序列，其中5’端标记有fam荧光报告基因，3’端标记有bhq1荧光淬灭基因；
11.上游引物es
‑
f:5
’‑
atatgactgaatcgtaagatctagg
‑3’
，其为seqidno:4序列；
12.下游引物es
‑
r:5
’‑
gtgagatagactttaggtgattaac
‑3’
，其为seqidno:5序列；
13.附红细胞体特异性荧光探针es
‑
p:hex
‑5’‑
caagtcaagtcatcatgccccttatgcc
‑3’‑
bhq1，其为seqidno:6序列，其中5’端标记有hex荧光报告基因，3’端标记有bhq1荧光淬灭基因；
14.采用实时荧光定量pcr技术同时检测弓形体和附红细胞体，建立两个病原体的扩增引物和特异性荧光探针是保证检测结果的核心，本发明根据genbank中登录的弓形体529序列和附红细胞体16srrna序列，使用primerpremier5.0软件针对弓形体、附红细胞体相关基因设计了特异性引物和探针。上述引物探针组对弓形体病和附红细胞体病的检测敏感性显著高于常规pcr，保证了双重检测的高灵敏性、高特异性、准确性和稳定性，满足一线猪场临床应用需求，为疫病的早期诊断和防控监测提供可靠的技术。
15.同时，本发明还提供了实时荧光定量检测猪全血弓形体和附红细胞体的pcr试剂盒，包括如上所述的引物探针组、荧光pcr反应液、和阳性对照。
16.作为对上述技术方案的限定，所述阳性对照标准品包括弓形体529标准品和附红细胞体16srrna标准品；
17.所述弓形体529标准品为弓形体529基因片段的克隆质粒pucm
‑
tg，所述附红细胞体16srrna标准品为附红细胞体16srrna基因片段的克隆质粒pucm
‑
es。各阳性对照标准品的克隆质粒均通过提取病原rna，反转录成cdna，利用上述引物分别扩增得到两种病原体基因片段，利用ta克隆将基因片段连接至pucm
‑
t载体，转化后筛选阳性克隆的操作，得到测序正确的克隆质粒，两标准品的克隆质粒终浓度均为1.0
×
108copies/μl。
18.阴性对照标准品为rnase
‑
freeddh2o。
19.试剂盒中25mlfastfireqpcrpremix(probe)快速定量pcr反应体系为：2
×
fastfireqpcrpremix12.5μl，弓形体和附红细胞体上、下游引物各0.75μl，探针各0.5μl，dna模板3μl，加rnase
‑
freeddh2o至反应体系总体积为25μl。
20.将本发明设计的两病原体基因引物探针组开发成标准化实时荧光定量双重pcr试剂盒，为一线猪场临床腹泻病毒病的早期诊断和防控监测工作提供可靠的检测产品。
21.另外，本发明还提供了上述快速检测猪全血弓形体和附红细胞体双重荧光定量pcr试剂盒的检测方法，所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的，其中25μl定量pcr反应体系包括：弓形体和附红细胞体的上、下游引物各0.75μl，使用终浓度均为0.3μm；两种病毒的特异性探针各0.5μl，使用终浓度均为0.2μm；
22.检测方法中pcr反应条件为：95℃预变性1min；95℃变性5s，60℃退火15s，收集荧光信号，共40个循环，结束反应。
23.作为对上述技术方案的限定，判定检测结果有效的条件为：
24.(1)阴性对照fam通道和hex通道检测无ct值；
25.(2)阳性对照fam通道和hex通道检测ct值≤30。
26.作为对上述技术方案的限定，检测结果的判定标准为：
27.a、fam和hex通道均检测ct值≤40，判定样品为弓形体和附红细胞体混合感染；
28.b、fam通道ct值≤40，hex通道无ct值，判定样品为弓形体感染阳性，附红细胞体感染阴性；
29.c、fam通道无ct值，hex通道ct值≤40，判定样品为弓形体感染阴性，附红细胞体感染阳性；
30.d、fam通道和hex通道检测均无ct值，判定样品为弓形体和附红细胞体感染阴性。
31.进一步限定试剂盒检测使用中pcr反应条件与结果判定标准，确保获得准确的检测结果。
32.综上所述，本发明针对猪弓形体和附红细胞体两种病原，根据弓形虫529 保守基因和附红细胞体16srrna保守基因序列设计开发了一组具有高灵敏性和高特异性的引物探针组，并在该基础上组装成实时荧光定量双重pcr试剂盒，用于同时检测出全血样品中弓形体和附红细胞体，通过优化反应条件，建立实时荧光定量检测猪全血弓形体和附红细胞体的pcr反应体系，对同时、快速、准确地诊断两种疾病具有重要意义。
附图说明
33.图1为本发明双重实时荧光定量pcr试剂盒中阳性对照标准品的10倍稀释梯度标准曲线；
34.图2
‑
1为本发明双重实时荧光定量pcr试剂盒的特异性试验结果总图；
35.图2
‑
2为图2
‑
1总图中的fam通道(弓形体)特异性试验结果图；
36.图2
‑
3为图2
‑
1总图中的hex通道(附红细胞体)特异性试验结果图；
37.图3
‑
1为本发明双重实时荧光定量pcr试剂盒的稳定性试验结果总图；
38.图3
‑
2为图3
‑
1总图中的fam通道(弓形体)稳定性试验结果图；
39.图3
‑
3为图3
‑
1总图中的hex通道(附红细胞体)稳定性试验结果图；
40.图4
‑
1为本发明双重实时荧光定量pcr试剂盒的敏感性试验结果总图；
41.图4
‑
2为图4
‑
1总图中的fam通道(弓形体)敏感性试验结果图；
42.图4
‑
3为图4
‑
1总图中的hex通道(附红细胞体)敏感性试验结果图。
具体实施方式
43.下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
44.实施例
45.本实施例涉及实时荧光定量检测猪全血弓形体和附红细胞体的pcr引物探针组设计、双重实时荧光定量pcr试剂盒中阳性对照克隆质粒制备、试剂盒组装及该试剂盒的检测应用。
46.一、设计猪弓形体529基因、附红细胞体16srrna的引物探针组
47.(1)病原体阳性基因序列如下：
48.猪弓形体529基因扩增序列(177bp)
49.gccacagaagggacagaagtcgaaggggactacagacgcgatgcc gctcctccagccgtcttggaggagagatatcaggactgtagatggaggc gaggatgaggatgagagggtggcgtggttgggaagcgacgagagtcg gagagggagaagatgtttccggcttggctgcttttc，其为seq id no:7 序列；
50.猪附红细胞体16srrna扩增序列(147bp)
51.atatgactgaatcgtaagatctaggaaggatggggccaagtcaagt catcatgccccttatgccttgggctgcaaacgtgcttcaatggtagattc aatgtgtgacaatctagcgatagtgagttaatcacctaaagtctatctca c，其为seq id no:8序列；
52.(2)引物的设计与合成：根据genbank中登录的相关基因序列，用 primerpremier5.0软件设计如下表1所示的特异性引物和探针。
[0053][0054][0055]
在本发明中，猪弓形体检测引物对应的产物长度是177bp，附红细胞体检测引物对应的产物长度为147bp。
[0056]
二、制备pcr试剂盒中阳性对照标准品
[0057]
各阳性对照标准品的克隆质粒均通过天根fastking一步法除基因组cdna第一链合成预混试剂盒，反转录获得第一链cdna，利用引物分别扩增得到两种病原体基因片段，利用ta克隆将基因片段连接至pucm
‑
t载体，转化后筛选阳性克隆的操作，得到测序正确的克隆质粒。在筛选阳性克隆过程中，将测序正确的克隆质粒命名为pucm
‑
xxx，以此阳性质粒作为标准品，用于实时荧光定量pcr扩增。
[0058]
第一步：引物合成
[0059]
引物序列如表1，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0060]
第二步：总rna提取
[0061]
将含有弓形体和附红细胞体的已知阳性样品各取200μl混合置于1.5ml 离心管中，使用天根公司的高效血液总rna提取试剂盒提取，得到血液总 rna，并快速电泳检测rna
完整性，将其置于
‑
80℃保存备用。
[0062]
第三步：cdna第一链合成
[0063]
使用天根公司的fastking一步法除基因组cdna第一链合成预混试剂盒，按照操作说明书，反转录获得第一链cdna。
[0064]
第四步：pcr克隆
[0065]
按照天根公司2
×
taq pcr mastermixⅱ试剂盒的操作说明书，以第一链 cdna为模板，使用上述引物分别扩增得到两种病原体基因片段，利用ta克隆将基因片段连接至pucm
‑
t载体，转化后筛选阳性克隆，得到测序正确的克隆质粒。
[0066]
第五步：阳性对照标准品
[0067]
将生工生物工程(上海)股份有限公司测序正确的阳性对照利用 nanodrop2000定量质量浓度，按照公式6.02
×
10
23
×
(x ng/μl
×
10
‑9)/(dna 长度
×
660)换算为拷贝数，弓形体和附红细胞体阳性克隆质粒分别为 7
×
10
11
copies/μl和6
×
10
11
copies/μl，用rnase
‑
free ddh2o将重组质粒分别稀释到2.0
×
108copies/ul，然后两种阳性质粒按照1:1的比例混合制备成阳性对照标准品，使弓形体和附红细胞体阳性质粒在混合物中的终浓度分别为 1.0
×
108copies/ul。
[0068]
三、组装试剂盒
[0069]
本发明的双重荧光定量pcr试剂盒，包括上述技术方案所述引物、探针和2
×
fastfire qpcr premix，本发明中所述水为rnase
‑
free ddh2o。本发明中，引物和探针序列(见表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所述2
×
fastfire qpcr premix优选购自天根公司的fastfire qpcr premix试剂盒(探针法)，预混液中含有热启动酶和独特的pcr缓冲液，利用序列特异性探针可对dna进行快速灵敏的荧光定量pcr检测，使用本制品进行双重荧光定量pcr反应可将运行时间缩短60％以上。
[0070]
fastfire快速定量pcr反应体系为：2
×
fastfire qpcr premix 12.5μl，弓形体和附红细胞体上、下游引物各0.75μl，探针各0.5μl，dna模板3μl，加rnase
‑
free ddh2o至反应体系总体积为25μl。弓形体和附红细胞体上游引物、下游引物在所述试剂盒中的使用终浓度均为0.3μm，各特异性荧光探针在试剂盒中的使用终浓度均为0.2μm。阴性对照选用rnase
‑
free ddh2o。
[0071]
上述试剂盒的pcr反应条件为：95℃预变性1min；95℃变性5s，60℃退火15s，收集荧光信号，循环95℃变性5s，60℃退火15s，收集荧光信号，共40个循环，结束反应；此反应程序可以使两种病原体的特异性引物在较短时间内对目的片段进行高效扩增，节约检测时间，确保了引物与模板特异性结合。
[0072]
使用上述试剂盒判定检测结果有效的条件需为：同时满足(1)阴性对照 fam通道和hex通道检测无ct值；(2)阳性对照fam通道和hex通道检测ct值≤30。
[0073]
四、试剂盒扩增效率验证
[0074]
将弓形体和附红细胞体阳性对照标准品进行10倍梯度稀释： 108～101copies/μl，每个梯度设2个重复，进行双重荧光定量pcr，根据扩增结果制作标准曲线。
[0075]
扩增效率验证结果显示：本发明阳性对照标准品10倍稀释的梯度扩增标准曲线(fam和hex通道)见附图图1，图中弓形体、附红细胞体标准曲线分别标注为a、b，各标准曲线参数数据见下表2所示。
[0076][0077]
五、检测弓形体和附红细胞体的特异性试验
[0078]
为了检测本发明试剂盒的特异性，利用本发明的试剂盒检测猪等孢球虫、滑膜支原体、微小隐孢子虫、田鼠巴贝斯虫、猪圆环病毒ⅱ型和猪蓝耳病毒等6种病原体。
[0079]
特异性试验结果显示：试剂盒仅对弓形体和附红细胞体进行扩增，表明其能特异性扩增，而不与猪等孢球虫、滑膜支原体、微小隐孢子虫、田鼠巴贝斯虫、猪圆环病毒ⅱ型和猪蓝耳病毒发生交叉反应，检测结果见附图图 2
‑
1～2
‑
3，其中图2
‑
1为特异性试验结果总图，图中弓形体和附红细胞体扩增曲线分别标注为a、b，而猪等孢球虫、滑膜支原体、微小隐孢子虫、田鼠巴贝斯虫、猪圆环病毒ⅱ型和猪蓝耳病毒等6种病原体未发生扩增，基本呈水平线；图2
‑
2为fam通道(弓形体)特异性试验结果图，图2
‑
3为hex通道 (附红细胞体)特异性试验结果图；可见本发明中构建的双重荧光定量pcr 反应体系特异性较好。
[0080]
六、检测弓形体和附红细胞体的稳定性试验
[0081]
选用弓形体和附红细胞体阳性对照标准品三个浓度108copies/μl、10
7 copies/μl、106copies/μl，分别进行批内、批间重复试验。批内重复试验是将阳性对照标准品在同一次双重荧光定量pcr中重复2次；批间重复试验是在2次不同时间的试验中进行双重荧光定量pcr试验。检测阳性对照标准品不同核酸浓度的变异系数(cv＝标准差/平均值*100％)均小于4％，说明本发明检测过程中具有较好的稳定性。检测结果见表3和附图图3
‑
1～3
‑
3，其中图 3
‑
1为稳定性试验结果总图，图3
‑
2为fam通道(弓形体)稳定性试验结果图，图3
‑
3为hex通道(附红细胞体)稳定性试验结果图。
[0082][0083]
七、检测弓形体和附红细胞体敏感性试验
[0084]
以10倍系列稀释的弓形体和附红细胞体阳性克隆质粒标准品(1.0
×
108～1.0
×
101copies/μl)作为模板，每个稀释度设立2个重复，进行双重荧光定量pcr检测敏感度。
[0085]
试验结果表明，本发明检测方法可检测出1.0
×
108～1.0
×
101copies/μl的拷贝量，见附图图4
‑
1～4
‑
3，其中图4
‑
1为敏感性试验结果总图，图4
‑
2为fam 通道(弓形体)敏感性试验结果图，图4
‑
3为hex通道(附红细胞体)敏感性试验结果图，图4
‑
1、4
‑
2、4
‑
3中各曲线从左至右对应的检测范围由 1.0
×
108～1.0
×
101copies/μl依次10倍递减。该方法的灵敏
度可以检测到最低 30个拷贝数核酸含量的样品。
[0086]
八、对弓形体和附红细胞体的双重实时荧光定量pcr检测实例
[0087]
第一步：引物合成
[0088]
引物序列如表1，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0089]
第二步：基因组dna提取
[0090]
将含有弓形体和附红细胞体的已知阳性样品(猪全血)各取200μl混合置于1.5ml离心管中，使用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组dna 提取试剂盒，按照产品使用说明书提取全血dna。
[0091]
第三步：双重荧光定量pcr扩增
[0092]
所述双重荧光定量pcr反应体系和反应程序同上述组装试剂盒操作。
[0093]
第四步：检测结果判定
[0094]
a、fam和hex通道均检测ct值≤40，则判定样品为弓形体和附红细胞体混合感染。
[0095]
b、fam通道ct值≤40，hex通道无ct值，则判定样品为弓形体感染阳性，附红细胞体感染阴性。
[0096]
c、fam通道无ct值，hex通道ct值≤40，则判定样品为弓形体感染阴性，附红细胞体感染阳性。
[0097]
d、fam通道和hex通道检测无ct值，则判定样品为弓形体或附红细胞体感染阴性。
[0098]
九、检测临床样品弓形体和附红细胞体的试验
[0099]
第一步：引物合成
[0100]
引物序列如表1，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0101]
第二步：样本采集
[0102]
采集京津冀地区猪场全血样本共计75份。
[0103]
第三步：基因组dna提取
[0104]
将含有弓形体和附红细胞体的已知阳性样品(猪全血)各取200μl混合置于1.5ml离心管中，使用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组dna 提取试剂盒，按照产品使用说明书提取全血样本的基因组dna。
[0105]
第四步：普通pcr检测和双重荧光定量pcr
[0106]
所述普通pcr检测利用天根公司2
×
taq plus pcr mix试剂盒。普通pcr 反应体系为：2
×
taq plus pcr mix 12.5μl，10μm上、下游引物(普通pcr上下游引物同荧光上下游引物)各1μl，dna模板3μl，加rnase
‑
free ddh2o 至反应体系总体积为25μl，分别进行pcr扩增。反应在pcr扩增仪进行，反应参数为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸 30s，30个循环，72℃再延伸5min。取5μl扩增产物进行1.5％的琼脂糖电泳检测。
[0107]
双重荧光定量pcr过程同上述组装试剂盒操作。
[0108]
75份待检样本的检测结果见下表4：
[0109][0110][0111]
以本行业所公认的检测精度最好的单重实时荧光定量pcr法的检测结果作为标准，可见本发明试剂盒检出的阳性样本数量与单重实时荧光定量pcr 法检测结果完全一致，且本发明试剂盒检测得到的混检结果与单重实时荧光定量pcr法检测结果完全一致。
[0112]
由上述结果可见：本发明的检测效果明显好于普通pcr检测效果，可以减少假阴性的发生，同时一次实验可以检测出混合感染，减少二次pcr验证及不需要pcr扩增后续处理，大大节约时间，提高工作效率。
[0113]
综上所述，本发明的基因引物探针组对于在同一pcr反应体系同时检测弓形体和附红细胞体两种病原体的目的片段，具有高特异性和高灵敏性，检测效果明显好于普通pcr，为一线猪场临床弓形体病和附红细胞体病的早期诊断和防控监测工作提供可靠的技术和产品。