一种从福尔马林固定石蜡包埋样本提取蛋白质的方法与流程

1.本发明属于生化分析技术领域，具体涉及一种从福尔马林固定石蜡包埋样本提取蛋白质的方法。


背景技术：

2.福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed and paraffin-embedded,ffpe)技术是保存活检和手术标本的一种常用方式。ffpe标本可以在室温下保存，可以避免冷冻保存的复杂性和风险性。后续需要对ffpe标本进行分析时，可以从ffpe标本获取ffpe样本，例如包含核酸和/或蛋白质的样本，通过核酸分析方法或蛋白质分析方法进行所需的分析。不过，虽然福尔马林固定液中的主要组分甲醛能使样本更稳定而有利于保存，但是也导致样本内部的核酸、蛋白质和其他生物分子形成广泛的交联和加合物，影响后续的分析工作。因此，对从ffpe标本获取的样本进行分析之前，需要对样本进行处理，以便进行感兴趣的分析操作。例如，在通过蛋白质谱分析方法对ffpe标本中的蛋白质进行分析的情况下，需要先使发生交联的蛋白质的解交联和变性，然后酶切成肽段，以便进行蛋白质谱分析。
3.通常，从ffpe标本获取获取少量的ffpe样本即可满足分析的需要。可以采用刀片等工具从ffpe标本切取少量ffpe样本。更先进的手段是采用激光捕获显微切割(laser capture microdissection,lcm)技术。该技术能在不破坏组织结构、能保存要捕获的细胞及其周围组织形态完整的前提下，在显微镜下从组织切片或细胞涂片中选择性地捕获、分离、纯化单一类型目标细胞群或单个目标细胞。lcm技术成功地解决了组织中的细胞异质性问题，是分子病理学和肿瘤基因组学研究的一项革命性技术。蛋白质组分析已被广泛应用于疾病研究的各个方面，但组织异质性却困扰研究结果的分析。由于lcm技术可以从组织切片(如石蜡包埋切片和冰冻切片)直接获得目标细胞，已成为蛋白质组研究的重要工具。用lcm技术对ffpe标本进行切割，可以获得包含感兴趣的细胞或细胞群的ffpe-lcm样本，进而对ffpe-lcm样本进行核酸或蛋白提取，可以用于进行基因组学或蛋白质组学研究。对于ffpe-lcm样本的蛋白提取，为提取足量的蛋白质以便分析，之前是通过增加样本量，比如采用多张ffpe-lcm样本
1.或者采用更厚的组织切片
2.来进行蛋白提取。随着对样本更精细的需求，ffpe-lcm样本面积越来越小，最少仅包含约2500个细胞，因此对微量蛋白的提取效果提出了更高的要求。
4.文献
[1-5]
报道了通过筛选已有的几种常用蛋白变性提取试剂，然后对ffpe-lcm样本进行缩小体系的蛋白提取而进行的比较实验。rapigest sf是目前比较实验发现的对微量蛋白样本提取效果最好的变性剂
[3]
。采用rapigest sf提取蛋白的实验技术流程涉及对样本进行热处理以使蛋白解交联，然后加入rapigest sf使蛋白变性，然后需要调至ph 2以下去除rapigest sf，再需要调至ph 7.4进行还原/烷基化/还原，再加入胰蛋白酶处理，后续需要对微量肽段进行沉淀离心和除盐，制得蛋白肽段样本，以供进行蛋白质谱分析等分析。由于使用了rapigest sf，上述实验技术流程需要对微量体积样本进行ph校正，不利于批量样品操作，而且后续还需要对微量的肽段进行沉淀离心和除盐，这对微量样品来说会
造成损失率过高。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提出一种新的蛋白质提取方法，适用于从福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)样本提取蛋白质，尤其适用于从ffpe-lcm样本提取蛋白质，可以解决现有技术存在的ph校正不利于批量样品操作及微量肽段进行沉淀离心和除盐造成损失的问题。
[0006]
具体地，本发明的目的通过以下技术方案来实现：
[0007]
一种从ffpe样本提取蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：
[0008]
(1)将ffpe样本在弱碱性ph值下在90-100℃的温度下加热10-60分钟；
[0009]
(2)向所得的加热处理液加入蛋白酶，在该蛋白酶的适宜作用温度范围下酶解处理2-8小时；
[0010]
(3)将所得的酶解液进行离心，得到包含蛋白质的酶解肽段的上清液。
[0011]
在该方法中，该ffpe样本为从ffpe标本获取的样本。优选地，该ffpe样本为通过激光捕获显微切割(lcm)技术从ffpe标本获得的样本，简称ffpe-lcm样本。
[0012]
进一步地，在步骤(1)中，该弱碱性ph值为ph 7.0-8.5。优选地，该弱碱性ph值处于所述蛋白酶的适宜作用ph范围内。
[0013]
进一步地，该弱碱性ph值通过向该ffpe样本中加入弱碱性溶液来实现。优选地，该ffpe样本的重量与该弱碱性溶液的体积的重量-体积比例为1:(5-50)。
[0014]
进一步地，该弱碱性溶液为碳酸氢铵溶液或四乙基溴化铵(teab)溶液。还进一步地，弱碱性溶液的浓度为25-500mm。
[0015]
进一步地，在步骤(1)中，加热的时间为20分钟。
[0016]
进一步地，在步骤(2)中，该加热处理液的重量与蛋白酶的重量的比例为1:(0.1-0.5)。
[0017]
进一步地，在步骤(2)中，酶解处理的时间为2小时。
[0018]
进一步地，在步骤(2)中，该蛋白酶为胰蛋白酶或rlysc蛋白酶(其是一种赖氨酸蛋白酶)。优选地，该蛋白酶为胰蛋白酶。
[0019]
进一步地，在步骤(2)中，可选择加入有机溶剂促进酶解处理。优选地，有机溶剂为乙腈或甲醇。通常，有机溶剂的加入量占该加热处理液的比例为5-30％。
[0020]
优选地，该方法采用ffpe-lcm样本，包括以下步骤：
[0021]
(1)向微量的ffpe-lcm样本中加入10μl ph 8.1的50mm氢氧化铵溶液，然后在95℃下加热处理20分钟；
[0022]
(2)向所得的加热处理液加入0.1μg胰蛋白酶在37℃下酶解处理2小时；
[0023]
(3)将所得的酶解液在常温下12000-30000g离心5-10分钟，得到包含所述蛋白质的酶解肽段的上清液。
[0024]
还更优选地，在上述步骤(2)中，加入终浓度为5-30％的乙腈来促进酶解。
[0025]
在步骤(3)中得到的包含蛋白质的酶解肽段的上清液可用于蛋白质谱检测，或者通过其他方式检测。
[0026]
本发明的有益效果：
[0027]
本发明的方法通过加热处理同时实现蛋白质的解交联和变性，可以不添加化学变
性剂(如rapigest sf试剂)使蛋白质变性，可以省去校正ph以去除化学变性剂的操作，并且可以省去后续的沉淀和除盐操作，有利于简化实验操作，尤其是批量样品操作，减少所需的肽段样品的损失。
附图说明
[0028]
图1显示本发明实施例1中的第一份人肾脏ffpe-lcm蛋白的上清液的1小时质谱分析图；
[0029]
图2显示本发明实施例1中的第一份人肾脏ffpe-lcm蛋白的上清液的1小时质谱分析图；
[0030]
图3显示本发明实施例2中的第一份小鼠肝脏ffpe蛋白的上清液的2小时质谱分析图；
[0031]
图4显示本发明实施例2中的第一份小鼠肝脏ffpe蛋白的上清液的2小时质谱分析图。
具体实施方式
[0032]
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。本文中所使用的所有科学用语与专业术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同，除非另有定义。
[0033]
如上所述，本发明提供了一种从福尔马林固定石蜡包埋样本提取蛋白质的方法。
[0034]
本文所使用的术语“福尔马林固定石蜡包埋标本”简称ffpe标本，是指用福尔马林进行固定并用石蜡进行包埋的生物标本，包括但不限于细胞标本、组织标本、器官标本。ffpe标本可以实现生物样本在常温下的长期保存。
[0035]
本文所使用的术语“福尔马林固定石蜡包埋样本”简称ffpe样本，是指从保存的ffpe标本获取的用于进行检测分析的样本，通常是少量的、足够进行检测分析的样本。通常，可以用刀片等工具从ffpe标本切取ffpe样本。更先进的手段是用激光捕获显微切割(lcm)技术从ffpe标本切割ffpe样本，此时获得的样本简称“ffpe-lcm样本”。
[0036]
ffpe样本因为经过了甲醛交联，样本中的蛋白质能够被蛋白酶切开的位置处的氨基酸发生共价修饰，影响蛋白酶的切割。因此需要先使蛋白质的解交联，再进行蛋白酶解。而且通常还使用蛋白变性剂进一步打开蛋白结构，以便酶解处理。然而常规的化学变性剂会干扰蛋白质谱检测，因此在实验中增加额外的处理步骤，导致实验操作繁琐。
[0037]
以目前对微量蛋白样本提取效果最好的变性剂rapigest sf为例对现有技术存在的问题进行进一步的说明。rapigest sf是一种蛋白质变性剂，可以打开蛋白结构并暴露酶切位点，以便后续蛋白酶切。rapigest sf在化学上为一种酸性不稳定表面活性剂，在酸性条件下极易水解，可利用这种独特的性质，在需要的时候将其从溶液中清除。采用rapigest sf进行的蛋白质提取实验技术流程
[3]
如下。首先，将样本超声处理10分钟，以去除样本中的气泡。将样本在99℃,800rpm下振摇1小时。冷却到室温，加入0.1％rapigest sf至终浓度为0.01％，继续在800rpm下振摇10分钟，然后超声处理10分钟以去除气泡。然后，调至ph 7.4，进行还原/烷基化/还原，控制ph为7.4。然后，用60μg/ml胰蛋白酶在50mm nh4hco3中处理16小时，接着用30μg/ml胰蛋白酶在80％乙腈(acn)中处理3小时。加入0.5％三氟乙酸(tfa)终止反应，在37℃,600rpm下振摇45分钟。然后，以16000rcf(相对离心力)离心10分钟，收集上
清液，快速真空蒸发。用ziptip吸管尖浓缩2μg蛋白，然后用9μl 100mm nh4hco2重构，加入mdps mix，制得蛋白肽段样本，可供进行蛋白质谱分析。
[0038]
在上述实验技术流程中，采用rapigest sf使蛋白变性后，然后需要调至ph7.4进行还原/烷基化/还原，再加入胰蛋白酶处理，后续还需要对微量肽段进行沉淀离心和除盐，以制备供进行蛋白质谱分析的蛋白肽段样本。对微量体积样本进行ph校正，不利于批量样品操作；而对微量的肽段进行沉淀离心和除盐，对微量样品来说会造成损失率过高。
[0039]
针对上述技术问题，本发明人经过深入研究，认识到蛋白质的解交联本质上是通过加热来破坏交联的共价键，而加热是蛋白变性的一种方式。因此，本发明人创新性地提出，可以不添加化学试剂来使蛋白质变性，而是直接通过加热来实现蛋白解交联和变性，这样可以省去后续需要去除化学试剂的步骤。由此，本发明人开发了本发明。
[0040]
具体地，本发明提供了一种从ffpe样本提取蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：
[0041]
(1)将ffpe样本在弱碱性ph值下在90-100℃的温度下加热10-60分钟；
[0042]
(2)向所得的加热处理液加入蛋白酶，在该蛋白酶的适宜作用温度范围下酶解处理2-8小时；
[0043]
(3)将所得的酶解液进行离心，得到包含蛋白质的酶解肽段的上清液。
[0044]
在本发明的具体实施方案中，该ffpe样本为从ffpe标本获取的样本。在本发明的优选实施方案中，该ffpe样本为通过激光捕获显微切割(lcm)技术获得的样本，简称ffpe-lcm样本。
[0045]
本文所用的术语“弱碱性ph值”是指ph 7.0-8.5范围的碱性ph值条件，例如ph 7.1、ph 7.2、ph 7.3、ph 7.4、ph 7.5、ph 7.6、ph 7.7、ph 7.8、ph 7.9、ph 8.0、ph 8.1、ph 8.2、ph 8.3、ph 8.4、ph 8.5的ph值。
[0046]
在本发明的具体实施方案中，在步骤(1)中，弱碱性ph值通过向ffpe样本中加入弱碱性溶液来实现。
[0047]
在本发明的优选实施方案中，该弱碱性溶液的ph值处于该蛋白酶的适宜作用ph范围内，便于在步骤(2)中不用调节ph值，直接加入蛋白酶就可以进行酶解处理。
[0048]
在本发明的具体实施方案中，如果步骤(1)中加入的弱碱性溶液的ph值不处于该蛋白酶的适宜作用ph范围内，在步骤(2)中可以通过加入酸或碱将所得的加热处理液调至该蛋白酶的适宜作用ph范围内。
[0049]
在本发明的具体实施方案中，ffpe样本的重量与弱碱性溶液的体积的重量-体积比例为1:(5-50)，例如1:5、1:10、1:20、1:30、1:40或1:50。通常，ffpe样本的厚度在5-10μm之间。如果ffpe样本为面积0.01-1cm2的切片，则弱碱性溶液的体积取10-50μl。为便于操作，面积0.1cm2以下切片都用10μl的弱碱性溶液。如果ffpe样本是ffpe-lcm样本，则一般采用10μl的弱碱性溶液。
[0050]
其ph值处于该蛋白酶的适宜作用ph范围内的弱碱性溶液是本领域公知的或者本领域技术人员容易确定的。在本发明的具体实施方案中，该弱碱性溶液为碳酸氢铵溶液或四乙基溴化铵(teab)。还进一步地，弱碱性溶液的浓度为25-500mm。
[0051]
在本发明的具体实施方案中，在步骤(1)中，可以用水浴或金属浴进行加热处理。
[0052]
在本发明的具体实施方案中，在步骤(1)中，加热时间为10-60分钟，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25分钟，优选20分钟。
[0053]
在本发明的具体实施方案中，在步骤(2)中，该加热处理液的重量与蛋白酶的重量的比例为1:(0.1-0.5)，例如1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4和1:0.5。通常，如果ffpe样本是面积0.01-1cm2的切片，加入0.1-0.5μg胰蛋白酶，如果是面积在0.1cm2以下的切片，则加入0.1μg胰蛋白酶。
[0054]
在本发明的具体实施方案中，在步骤(2)中，酶解处理的时间为2-8小时，例如1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0小时，优选2小时。
[0055]
在本发明的具体实施方案中，在步骤(2)中，该蛋白酶为胰蛋白酶或rlysc蛋白酶(其是一种赖氨酸蛋白酶)。优选地，该蛋白酶为胰蛋白酶。该蛋白酶的适宜作用温度范围是本领域公知的，例如胰蛋白酶的适宜作用温度范围为35-40℃，最适作用温度为37℃。另外，胰蛋白酶的最适作用ph值为ph 8.1。
[0056]
在本发明的具体实施方案中，在步骤(2)中，还可加入有机溶剂促进酶解处理。优选地，有机溶剂为乙腈或甲醇。通常，有机溶剂的加入量占该加热处理液的比例为5-30％。
[0057]
在本发明的一个优选的具体实施方案中，该方法采用ffpe-lcm样本，包括以下步骤：
[0058]
(1)向微量的ffpe-lcm样本中加入10μl ph 8.1的50mm氢氧化铵溶液，然后在95℃下加热处理20分钟；
[0059]
(2)向所得的加热处理液加入0.1μg胰蛋白酶在37℃下酶解处理2小时；
[0060]
(3)将所得的酶解液在常温下12000-30000g离心5-10分钟，得到包含所述蛋白质的酶解肽段的上清液。
[0061]
还更优选地，在上述步骤(2)中，加入终浓度为5-30％的乙腈来促进酶解。
[0062]
应该说明的是，本发明方法的步骤(1)的实际操作通常是在密封容器如带盖的小试管(例如pcr小管)中进行。在加热的过程中，会有液体(如水)蒸发冷凝在该容器的盖和/或壁上。因此，如果加热的时间超过20分钟，则需要每20分钟取出该容器进行瞬时离心，以将蒸发冷凝在该容器的盖和/或壁上的液体离心下来，然后继续加热处理剩余的时间。这样可以避免样品失水干燥加热焦化，影响后续蛋白酶解。
[0063]
通过本发明的方法，在步骤(3)中得到的包含蛋白质的酶解肽段的上清液可用于蛋白质谱检测，或者通过其他方式检测。
[0064]
以下通过非限制性实施例对本发明作进一步的举例说明。应说明的是，这些实施例是示例性的，并不意在以任何方式限制本发明。
[0065]
实施例1：
[0066]
采用激光捕获显微切割(lcm)方法从人肾脏组织穿刺ffpe标本获得2块ffpe-lcm样本，细胞数约500-2000个，放置在0.2ml ep离心管的盖子上，肉眼不可见。将盖子盖上ep离心管，使样本转移到ep离心管底，然后将ep离心管放入掌上离心机中，在20000g离心10s。
[0067]
用10μl移液枪加入10μl 50mm ph 8.1碳酸氢铵溶液，直接将ep离心管放到95℃金属浴上加热20分钟。
[0068]
取出ep离心管，加入1μl浓度为0.1μg/μl的胰蛋白酶溶液，然后管口包一层保鲜膜，在eppendorf thermomixture中37℃,800rpm下震荡酶解2小时。
[0069]
取出ep离心管，20000g常温离心10分钟，取上清液，弃去沉淀。所得上清液含有ffpe-lcm样本蛋白，可用于蛋白质谱分析或者其他分析。
tissue microproteomics:important considerations for small sample processing.methods,104,154
–
162.
[0085]
4)azimi,a.,kaufman,k.l.,ali,m.,kossard,s.,&fernandez-penas,p.(2016).in silico analysis validates proteomic findings of formalin-fixed paraffin embedded cutaneous squamous cell carcinoma tissue.cancer genomics and proteomics,13(6),453
–
466.
[0086]
5)j.r.,ostasiewicz,p.,&mann,m.(2011).high recovery fasp applied to the proteomic analysis of microdissected formalin fixed paraffin embedded cancer tissues retrieves known colon cancer markers.journal of proteome research,10(7),3040
–
3049.
[0087]
以上应用了具体实例对本发明进行了阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。本发明所属技术领域的技术人员依据本发明的构思，还可以做出若干简单推演、变形或替换。这些推演、变形或替换方案也落入本发明的权利要求范围内。