一种提高细胞扩增倍数的NK细胞体外培养方法与流程

一种提高细胞扩增倍数的nk细胞体外培养方法
技术领域
1.本发明涉及nk细胞培养技术领域，具体为一种提高细胞扩增倍数的nk细胞体外培养方法。


背景技术：

2.自然杀伤细胞，即nk细胞（natural killer cell），是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染有关，同时对人体内的t淋巴细胞及b淋巴细胞具有一定的调节作用。nk细胞是与特异性免疫应答无关的一类免疫细胞，它所介导的细胞裂解不受主要组织相溶性复合体（mhc）的影响，故也称其为机体天然免疫系统的“心脏”。nk细胞不仅可以清除人体内寄生菌、病毒及老化变异细胞，对癌细胞也具有极强的清除作用，目前在临床上利用nk细胞过继性免疫治疗成为了肿瘤细胞免疫治疗的重要手段。nk细胞数量与nk细胞对肿瘤细胞的杀伤效果有关，因此，如何优化nk细胞体外培养工艺、提高nk细胞比例以及nk细胞扩增倍数，是nk细胞过继性免疫治疗研究的重点。
3.右旋糖酐(dextran)也叫葡聚糖、右聚糖，是葡萄糖的聚合物，可以由蔗糖经肠膜状明串珠菌发酵后生成。右旋糖酐根据分子量可分为高分子右旋糖酐(平均分子量mw=100000
‑
200000）、中分子右旋糖酐（平均分子量mw=60000
‑
80000）、低分子右旋糖酐（平均分子量mw=10000
‑
40000）小分子右旋糖酐（平均分子量mw=1000
‑
10000）。右旋糖酐常被用作药用注射级原材料，副作用小，对人体安全，是非常适合体外培养免疫细胞的原材料。
4.基于上述情况，本技术公开了一种提高细胞扩增倍数的nk细胞体外培养方法，以在nk细胞体外培养过程中提高nk细胞比例。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种提高细胞扩增倍数的nk细胞体外培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
6.为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种提高细胞扩增倍数的nk细胞体外培养方法，包括以下步骤：（1）分离pbmc细胞；（2）取分离的pbmc细胞悬液，在d0天转移至包被有cd16抗体的培养瓶中，加入培养基，在37℃、5%二氧化碳培养条件下进行细胞激活培养，激活培养3d；（3）在d3天将细胞转移至新的培养瓶中，加入培养基，补液维持细胞密度为1
‑
1.5
×
106个/ml，培养4d，在d7天将热灭活自体血浆比例降为1%，继续培养10d，在d17天离心收获细胞。
7.较优化的方案，在d0天添加50
‑
150μg/ml的右旋糖酐，右旋糖酐的平均分子量为mw=20000。
8.较优化的方案，在d0天添加100μg/ml的右旋糖酐。
9.较优化的方案，从d3天开始，补液添加浓度为50
‑
200μg/ml的右旋糖酐，右旋糖酐
的平均分子量为mw=9000。
10.较优化的方案，从d3天开始，补液添加浓度为100μg/ml的右旋糖酐。
11.较优化的方案，所述培养基为含有il
‑
2、il
‑
15、il
‑
12、il
‑
21、热灭活自体血浆的nk培养基。
12.较优化的方案，所述il
‑
2的终浓度为1000iu/ml，il
‑
15的终浓度为50ng/ml，il
‑
12的终浓度为10ng/ml，il
‑
21的终浓度为10ng/ml，热灭活自体血浆的添加比例为10%。
13.较优化的方案，所述nk培养基为scgm nk培养基、康宁nk培养基、xvivo15培养基中的任意一种。
14.较优化的方案，步骤（2）中，培养瓶中细胞密度为2
×
106个/ml。
15.较优化的方案，步骤（1）中，采用密度离心法从人全血中新鲜分离pbmc细胞。
16.与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：右旋糖酐具有激活自然杀伤细胞、巨噬细胞、促进免疫细胞扩增等作用，近年来被用作健康营养补充剂、功能口服液等产品的原料。不同分子量的右旋糖酐对免疫细胞生长的辅助作用也不同，低分子右旋糖酐可提高培养基渗透压以模拟血浆作用以辅助激活nk细胞，小分子右旋糖酐可通过提高细胞内游离钙离子与camp含量以及减少细胞聚团促进nk细胞扩增。本发明提出一种提高细胞扩增倍数的nk细胞体外培养方法，在nk细胞体外培养过程中可将细胞扩增倍数提高60%以上，将nk细胞比例提高10%以上。
17.本发明涉及一种提高细胞扩增倍数的nk细胞体外培养方法，所述添加右旋糖酐的方法为激活nk细胞期间添加平均分子量mw=20000的右旋糖酐、nk细胞激活后培养过程中添加平均分子量mw=9000的右旋糖酐，所述平均分子量mw=20000的右旋糖酐添加浓度为50
‑
150μg/ml、平均分子量mw=9000的右旋糖酐添加浓度为50
‑
200μg/ml，更为优选地，所述平均分子量mw=20000的右旋糖酐添加浓度为100μg/ml、平均分子量mw=9000的右旋糖酐添加浓度为100μg/ml。
18.本发明创造性地引入了右旋糖酐，并公开了一种右旋糖酐的添加方法，并限定了右旋糖酐的用量，在nk细胞体外培养过程中可将细胞扩增倍数提高60%以上，将nk细胞比例提高10%以上；同时，本技术采用的右旋糖酐来源明确，无动物源成分，对细胞无毒性，使用方法简单，性能优异，可广泛应用于实际生产，具有较高的实用性。
附图说明
19.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：图1是本发明实施例1的实验组
‑
对照组三的细胞活率曲线图；图2是本发明实施例1的对照组四
‑
对照组七的细胞活率曲线图；图3是本发明实施例1的实验组
‑
对照组三的细胞扩增倍数曲线图；图4是本发明实施例1的对照组四
‑
对照组七的细胞扩增倍数曲线图；图5是本发明实施例1的实验组的流式检测结果示意图；图6是本发明实施例1的对照组七的流式检测结果示意图；图7是本发明实施例2的实验组
‑
对照组三的细胞活率曲线图；图8是本发明实施例2的对照组四
‑
对照组七的细胞活率曲线图；
图9是本发明实施例2的实验组
‑
对照组三的细胞扩增倍数曲线图；图10是本发明实施例2的对照组四
‑
对照组七的细胞扩增倍数曲线图；图11是本发明实施例2的实验组的流式检测结果示意图；图12是本发明实施例2的对照组七的流式检测结果示意图；图13是本发明实施例3的实验组
‑
对照组三的细胞活率曲线图；图14是本发明实施例3的对照组四
‑
对照组七的细胞活率曲线图；图15是本发明实施例3的实验组
‑
对照组三的细胞扩增倍数曲线图；图16是本发明实施例3的对照组四
‑
对照组七的细胞扩增倍数曲线图；图17是本发明实施例3的实验组的流式检测结果示意图；图18是本发明实施例3的对照组七的流式检测结果示意图。
具体实施方式
20.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.本技术以下所述实施例，所采用的培养基如下：cellgenix品牌 scgm nk培养基（简称scgm nk培养基），货号20802
‑
0500，基础培养方法为nk细胞通用的使用cd16/il
‑
2/il
‑
15/il
‑
12/il
‑
21细胞因子激活、扩增方法；corning（康宁）品牌 nk细胞活化/扩增培养基套装（简称康宁nk培养基），货号88
‑
570
‑
kit，基础培养方法为套装附带的标准操作方法；lonza（龙沙）品牌 xvivo 15 免疫细胞无血清培养基（简称xvivo 15培养基），货号be02
‑
060f，基础培养方法为nk细胞通用的使用cd16/il
‑
2/il
‑
15/il
‑
12/il
‑
21细胞因子激活、扩增方法。
22.实施例中使用的材料与耗材来源为本领域常用材料与耗材来源。
23.实施例1：一种提高细胞扩增倍数的nk细胞体外培养方法，包括以下步骤：（1）采用密度离心法从人全血中新鲜分离pbmc细胞，以用于nk细胞的激活扩增；（2）取分离的pbmc细胞悬液，在d0天转移至包被有cd16抗体的t75培养瓶中，加入含有il
‑
2、il
‑
15、il
‑
12、il
‑
21、热灭活自体血浆的nk培养基，所述il
‑
2的终浓度为1000iu/ml，il
‑
15的终浓度为50ng/ml，il
‑
12的终浓度为10ng/ml，il
‑
21的终浓度为10ng/ml，热灭活自体血浆的添加比例为10%，nk培养基为scgm nk培养基，培养瓶中细胞密度为2
×
106个/ml，在37℃、5%二氧化碳培养条件下进行细胞激活培养，激活培养3d；（3）在d3天将细胞转移至新的t75培养瓶中，加入含有il
‑
2、il
‑
15、il
‑
12、il
‑
21、热灭活自体血浆的nk培养基，具体添加组分及nk培养基选择如步骤（2）所述，每隔1天或2天进行细胞活率、密度测试，补液维持细胞密度为1.5
×
106个/ml，保持t75培养瓶最大容量40ml，弃掉多余细胞，培养4d，在d7天将热灭活自体血浆比例降为1%，继续培养10d，在d17天离心收获细胞，对细胞表面抗原cd3和cd56进行流式细胞仪检测，cd3
‑
cd56 为nk细胞的标志。
24.以实施例1公开的方法步骤为实验组（scgm nk培养基组），并进行以下对照实验：对照组一（scgm nk培养基 mw20000右旋糖酐最低值）：上述培养方法基础上，第0天（d0）向培养基中加入终浓度为50μg/ml平均分子量mw=20000的右旋糖酐；对照组二（scgm nk培养基 mw20000右旋糖酐最优值）：上述培养方法基础上，第0天（d0）向培养基中加入终浓度为100μg/ml平均分子量mw=20000的右旋糖酐；对照组三（scgm nk培养基 mw20000右旋糖酐最高值）：上述培养方法基础上，第0天（d0）向培养基中加入终浓度为150μg/ml平均分子量mw=20000的右旋糖酐；对照组四（scgm nk培养基 mw9000右旋糖酐最低值）：上述培养方法基础上，第3天（d3）开始每次补液都向培养基中加入终浓度为50μg/ml平均分子量mw=9000的右旋糖酐；对照组五（scgm nk培养基 mw9000右旋糖酐最优值）：上述培养方法基础上，第3天（d3）开始每次补液都向培养基中加入终浓度为100μg/ml平均分子量mw=9000的右旋糖酐；对照组六（scgm nk培养基 mw9000右旋糖酐最高值）：上述培养方法基础上，第3天（d3）开始每次补液都向培养基中加入终浓度为200μg/ml平均分子量mw=9000的右旋糖酐；对照组七（scgm nk培养基 本发明右旋糖酐添加方法）：上述培养方法基础上，第0天（d0）向培养基中加入终浓度为100μg/ml平均分子量mw=20000的右旋糖酐，第3天（d3）开始每次补液都向培养基中加入终浓度为100μg/ml平均分子量mw=9000的右旋糖酐。
25.结论：细胞活率数据如表一所示，细胞扩增倍数数据如表二所示：表一表二具体细胞活率曲线如图1、图2所示：本方案中添加了右旋糖酐不影响细胞活率，第17天实验组活率为91.6%，而对照组七（即本技术公开的方案）活率为92.9%。
26.具体细胞扩增曲线图3、图4所示：本方案中添加了右旋糖酐可以明显提高细胞扩
增倍数，第17天实验组细胞扩增倍数为529倍，对照组七（即本技术公开的方案）细胞扩增倍数为891倍，使用本发明右旋糖酐添加方法可将细胞扩增倍数提高68.4%。只添加平均分子量mw=20000的右旋糖酐或平均分子量mw=9000的右旋糖酐则无法达到此效果。
27.实验组的流式检测结果如图5所示，对照组七的流式检测结果如图6所示：本方案中添加右旋糖酐可以明显提高收获时nk细胞比例，第17天实验组nk细胞比例（cd3
‑
cd56 ）为69%，对照组七（即本技术公开的方案）nk细胞比例（cd3
‑
cd56 ）为82.5%，使用本发明右旋糖酐添加方法可将nk细胞比例提高19.6%。
28.实施例2：一种提高细胞扩增倍数的nk细胞体外培养方法，包括以下步骤：（1）采用密度离心法从人全血中新鲜分离pbmc细胞，以用于nk细胞的激活扩增；（2）取分离的pbmc细胞悬液，在d0天转移至包被有cd16抗体的t75培养瓶中，加入含有il
‑
2、il
‑
15、il
‑
12、il
‑
21、热灭活自体血浆的nk培养基，所述il
‑
2的终浓度为1000iu/ml，il
‑
15的终浓度为50ng/ml，il
‑
12的终浓度为10ng/ml，il
‑
21的终浓度为10ng/ml，热灭活自体血浆的添加比例为10%，nk培养基为康宁nk培养基，培养瓶中细胞密度为2
×
106个/ml，在37℃、5%二氧化碳培养条件下进行细胞激活培养，激活培养3d；（3）在d3天将细胞转移至新的t75培养瓶中，加入含有il
‑
2、il
‑
15、il
‑
12、il
‑
21、热灭活自体血浆的nk培养基，具体添加组分及nk培养基选择如步骤（2）所述，每隔1天或2天进行细胞活率、密度测试，补液维持细胞密度为1.5
×
106个/ml，保持t75培养瓶最大容量40ml，弃掉多余细胞，培养4d，在d7天将热灭活自体血浆比例降为1%，继续培养10d，在d17天离心收获细胞，对细胞表面抗原cd3和cd56进行流式细胞仪检测，cd3
‑
cd56 为nk细胞的标志。
29.以实施例2公开的方法步骤为实验组（康宁nk培养基组），并进行以下对照实验：对照组一（康宁nk培养基 mw20000右旋糖酐最低值）：上述培养方法基础上，第0天（d0）向培养基中加入终浓度为50μg/ml平均分子量mw=20000的右旋糖酐；对照组二（康宁nk培养基 mw20000右旋糖酐最优值）：上述培养方法基础上，第0天（d0）向培养基中加入终浓度为100μg/ml平均分子量mw=20000的右旋糖酐；对照组三（康宁nk培养基 mw20000右旋糖酐最高值）：上述培养方法基础上，第0天（d0）向培养基中加入终浓度为150μg/ml平均分子量mw=20000的右旋糖酐；对照组四（康宁nk培养基 mw9000右旋糖酐最低值）：上述培养方法基础上，第3天（d3）开始每次补液都向培养基中加入终浓度为50μg/ml平均分子量mw=9000的右旋糖酐；对照组五（康宁nk培养基 mw9000右旋糖酐最优值）：上述培养方法基础上，第3天（d3）开始每次补液都向培养基中加入终浓度为100μg/ml平均分子量mw=9000的右旋糖酐；对照组六（康宁nk培养基 mw9000右旋糖酐最高值）：上述培养方法基础上，第3天（d3）开始每次补液都向培养基中加入终浓度为200μg/ml平均分子量mw=9000的右旋糖酐；对照组七（康宁nk培养基 本发明右旋糖酐添加方法）：上述培养方法基础上，第0天（d0）向培养基中加入终浓度为100μg/ml平均分子量mw=20000的右旋糖酐，第3天（d3）开始每次补液都向培养基中加入终浓度为100μg/ml平均分子量mw=9000的右旋糖酐。
30.结论：细胞活率数据如表三所示，细胞扩增倍数数据如表四所示：表三
表四具体细胞活率曲线如图7、图8所示：本方案中添加了右旋糖酐不影响细胞活率，第17天实验组活率为92%，对照组七（即本技术公开的方案）活率为95.2%。
31.具体细胞扩增曲线图9、图10所示：本方案中添加了右旋糖酐可以明显提高细胞扩增倍数，第17天实验组细胞扩增倍数为549倍，对照组七（即本技术公开的方案）细胞扩增倍数为944倍，使用本发明右旋糖酐添加方法可将细胞扩增倍数提高71.9%；只添加平均分子量mw=20000的右旋糖酐或平均分子量mw=9000的右旋糖酐则无法达到此效果。
32.实验组的流式检测结果如图11所示，对照组七的流式检测结果如图12所示：本方案中添加右旋糖酐可以明显提高收获时nk细胞比例，第17天实验组nk细胞比例（cd3
‑
cd56 ）为72.3%，对照组七（即本技术公开的方案）nk细胞比例（cd3
‑
cd56 ）为86.9%，使用本发明右旋糖酐添加方法可将nk细胞比例提高20.2%。
33.实施例3：一种提高细胞扩增倍数的nk细胞体外培养方法，包括以下步骤：（1）采用密度离心法从人全血中新鲜分离pbmc细胞，以用于nk细胞的激活扩增；（2）取分离的pbmc细胞悬液，在d0天转移至包被有cd16抗体的t75培养瓶中，加入含有il
‑
2、il
‑
15、il
‑
12、il
‑
21、热灭活自体血浆的nk培养基，所述il
‑
2的终浓度为1000iu/ml，il
‑
15的终浓度为50ng/ml，il
‑
12的终浓度为10ng/ml，il
‑
21的终浓度为10ng/ml，热灭活自体血浆的添加比例为10%，nk培养基为xvivo15培养基，培养瓶中细胞密度为2
×
106个/ml，在37℃、5%二氧化碳培养条件下进行细胞激活培养，激活培养3d；（3）在d3天将细胞转移至新的t75培养瓶中，加入含有il
‑
2、il
‑
15、il
‑
12、il
‑
21、热灭活自体血浆的nk培养基，具体添加组分及nk培养基选择如步骤（2）所述，每隔1天或2天进行细胞活率、密度测试，补液维持细胞密度为1.5
×
106个/ml，保持t75培养瓶最大容量
40ml，弃掉多余细胞，培养4d，在d7天将热灭活自体血浆比例降为1%，继续培养10d，在d17天离心收获细胞，对细胞表面抗原cd3和cd56进行流式细胞仪检测，cd3
‑
cd56 为nk细胞的标志。
34.以实施例3公开的方法步骤为实验组（xvivo 15 培养基组），并进行以下对照实验：对照组一（xvivo 15 培养基 mw20000右旋糖酐最低值）：上述培养方法基础上，第0天（d0）向培养基中加入终浓度为50μg/ml平均分子量mw=20000的右旋糖酐；对照组二（xvivo 15 培养基 mw20000右旋糖酐最优值）：上述培养方法基础上，第0天（d0）向培养基中加入终浓度为100μg/ml平均分子量mw=20000的右旋糖酐；对照组三（xvivo 15 培养基 mw20000右旋糖酐最高值）：上述培养方法基础上，第0天（d0）向培养基中加入终浓度为150μg/ml平均分子量mw=20000的右旋糖酐；对照组四（xvivo 15 培养基 mw9000右旋糖酐最低值）：上述培养方法基础上，第3天（d3）开始每次补液都向培养基中加入终浓度为50μg/ml平均分子量mw=9000的右旋糖酐；对照组五（xvivo 15 培养基 mw9000右旋糖酐最优值）：上述培养方法基础上，第3天（d3）开始每次补液都向培养基中加入终浓度为100μg/ml平均分子量mw=9000的右旋糖酐；对照组六（xvivo 15 培养基 mw9000右旋糖酐最高值）：上述培养方法基础上，第3天（d3）开始每次补液都向培养基中加入终浓度为200μg/ml平均分子量mw=9000的右旋糖酐；对照组七（xvivo 15 培养基 本发明右旋糖酐添加方法）：上述培养方法基础上，第0天（d0）向培养基中加入终浓度为100μg/ml平均分子量mw=20000的右旋糖酐，第3天（d3）开始每次补液都向培养基中加入终浓度为100μg/ml平均分子量mw=9000的右旋糖酐。
35.结论：细胞活率数据如表五所示，细胞扩增倍数数据如表六所示：表五表六
具体细胞活率曲线如图13、图14所示：本方案添加了右旋糖酐不影响细胞活率，第17天实验组活率为90.1%，对照组七（即本技术公开的方案）活率为94.7%。
36.具体细胞扩增曲线图15、图16所示：本方案添加了右旋糖酐可以明显提高细胞扩增倍数，第17天实验组细胞扩增倍数为481倍，对照组七（即本技术公开的方案）细胞扩增倍数为813倍，使用本发明右旋糖酐添加方法可将细胞扩增倍数提高69%。只添加平均分子量mw=20000的右旋糖酐或平均分子量mw=9000的右旋糖酐则无法达到此效果。
37.实验组的流式检测结果如图17所示，对照组七的流式检测结果如图18所示：本方案添加右旋糖酐可以明显提高收获时nk细胞比例，第17天实验组nk细胞比例（cd3
‑
cd56 ）为75.8%，对照组七（即本技术公开的方案）nk细胞比例（cd3
‑
cd56 ）为86.1%，使用本发明右旋糖酐添加方法可将nk细胞比例提高13.6%。
38.由上数据可知：本发明创造性地引入了右旋糖酐，并公开了一种右旋糖酐的添加方法，并限定了右旋糖酐的用量，在nk细胞体外培养过程中可将细胞扩增倍数提高60%以上，将nk细胞比例提高10%以上；同时，本技术采用的右旋糖酐来源明确，无动物源成分，对细胞无毒性，使用方法简单，性能优异，可广泛应用于实际生产，具有较高的实用性。
39.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
40.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。