中和1型干扰素的FC融合蛋白及其用途的制作方法

中和1型干扰素的fc融合蛋白及其用途
技术领域
1.本技术要求于2018年12月24日提交的韩国专利申请第10
‑
2018
‑
0168801号的优先权，其说明书通过引用将它们全部并入本文。
2.本发明涉及中和1型干扰素的fc融合蛋白及其用途，更具体地，涉及一种包含干扰素受体片段或抗体fc片段的单体在其中结合的二聚体多肽及其制备方法，以及一种包含所述二聚体多肽的用于预防或治疗与1型干扰素或干扰素诱导基因异常表达有关的疾病的组合物。


背景技术：

3.i型干扰素(ifn)(ifn
‑
α、ifn
‑
β、ifn
‑
ω、ifn
‑
τ)是一组结构相关的细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。人ifna基因座有两个亚组。第一个亚组有14个非等位基因和4个具有至少80％同一性的假基因。第二个亚组，αii或omega(ω)，有1个功能基因和5个与ifnα基因具有70％同一性的假基因。ifnα的亚型具有不同的比活度，但表现出相同的生物学谱和相同的细胞受体。干扰素β(ifnβ)由单个基因编码，与ifnα基因具有近50％的同一性。由活化的淋巴细胞产生的干扰素γ与α/β干扰素没有同一性，并且不与其受体发生反应。
4.所有人类i型ifn都与细胞表面受体(ifnα受体，ifnar)结合，该受体由两种跨膜蛋白ifnar
‑
1和ifnar
‑
2组成。ifnar
‑
1对于ifnar复合物的高亲和力结合和不同的特异性是必不可少的。虽然每种i型ifn亚型的功能差异尚未阐明，但据认为，每种亚型对ifnar受体成分表现出不同的作用，可能导致多种信号传导。
5.对i型ifn功能的早期研究集中在对病毒感染的先天防御。然而，最近的研究将i型ifn作为适应性免疫反应中的有效免疫调节细胞因子。特别是，i型ifn已被证明可以促进th1通路中原生t细胞的突变，增加抗体的产生，并支持记忆t细胞的功能活性和存活。
6.最近的几组研究表明，ifn
‑
α可以增强树突细胞(dc)的成熟或活化。此外，在许多自身免疫疾病相关文献中已经描述了i型干扰素表达的增加。
7.对此研究最多的例子是胰岛素依赖型糖尿病(iddm)(paulis等(1987)lancet 2:1423)、系统性红斑狼疮(sle)(hooks等(1982)arthritis rheum 25:396)、干燥综合征(lee hong
‑
yau等(2013)autoimmun rev 12(5):558
‑
66)、炎性肌炎(beckler等(2007)mol med13(1
‑
2):59
–
68.)和类风湿性关节炎(ra)，其中ifn
‑
β发挥更重要的作用(herzzog等人(1988)clin immunol immunopathol 48:192，hopkins和meggle(1988)clin exp immunol73:88，alvin和miller(1984)arthritis rheum 27:582)，这都与ifnα水平升高有关。
8.此外，据报道，作为1型干扰素的代表类型，干扰素α的给药会加剧银屑病和多发性硬化症患者的基础疾病，并在没有自身免疫疾病经验的患者中诱发sle样症状。干扰素α也已显示出在正常小鼠中诱发肾小球肾炎，并加速nzb/w小鼠伴随性自身免疫疾病的发展。此外，在某些情况下，ifn
‑
α疗法已被证明会引起不良副作用，包括发烧和神经紊乱。
9.虽然1型ifn具有多样性，而且在最近对sle患者的研究中，不仅是ifn
‑
α，而且ifn
‑
β也是粘膜皮肤病的病因，但存在的问题在于对1型干扰素介导的疾病的治疗仅集中于单独的ifn
‑
α，如疫苗(ifn
‑
kinoid)或抗ifn
‑
α单克隆中和抗体(sifalimumab、rontalizumab、ags
‑
009)治疗。此外，此类中和抗体的问题在于它们不能中和与干扰素的两种不同受体结合的所有部分，并且仅对ifnar1或ifnar2具有结合能力。为了弥补这个问题，阿尼鲁单抗(mabs.2015mar
‑
apr；7(2):428
‑
439.)正在被开发，其与i型ifn受体ifnar1特异性结合并具有中和能力。然而，这些中和抗体疗法在1型干扰素的多种信号传导机制中的特点预计将无法从体内清除1型干扰素和复杂的信号传导机制，例如由ifnar1(nat immunol.2013sep；14(9):901
‑
7.)或ifnar2(sci signal.2014may 27；7(327):ra50.；plos one.2017；12(8):e0182866.)介导的非经典途径，而不是由ifnar1和ifnar2介导的经典途径。
10.发明详述
11.技术问题
12.本发明的发明人在开发1型干扰素介导疾病的治疗的同时完成了本发明，因为证实了包含干扰素受体1片段和干扰素受体2片段的二聚体型多肽不仅结合1型干扰素，还显著抑制治疗过程中信号传导机制启动和生物活性的抑制作用。
13.因此，本发明的目的在于提供
14.一种二聚体多肽，其中包含干扰素受体片段或抗体fc片段的单体在所述二聚体多肽中结合，
15.其中该单体是选自(i)、(ii)和(iii)的多肽：
16.(i)包含干扰素受体1(ifnar1)片段和抗体fc片段的单体；
17.(ii)包含干扰素受体2(ifnar2)片段和抗体fc片段的单体；及
18.(iii)抗体fc片段。
19.本发明的另一个目的是提供一种编码所述多肽的多核苷酸。
20.本发明的另一个目的是提供一种包含所述多核苷酸的载体。
21.本发明的另一目的是提供一种用所述载体转化的宿主细胞。
22.本发明的另一个目的是提供一种制备该多肽的方法，包括：
23.(a)提供宿主细胞；
24.(b)培养所提供的细胞；以及
25.(c)通过从细胞或培养基中回收多肽来制备多肽。
26.本发明的另一目的是，
27.提供一种用于预防或治疗1型干扰素介导的疾病或病症的药物组合物，其包括作为活性成分的多肽。
28.还提供一种用于预防或治疗1型干扰素介导的疾病或病症的药物组合物，其由作为活性成分的多肽组成。
29.还提供一种用于预防或治疗1型干扰素介导的疾病或病症的药物组合物，其主要由作为活性成分的多肽组成。
30.本发明的另一个目的是提供该多肽在制备用于预防或治疗1型干扰素介导的疾病或病症的药剂中的用途。
31.本发明的另一目的在于提供用于治疗1型干扰素介导的疾病或病症的方法，包括给有需要的对象施用有效量的组合物，该组合物包含作为活性成分的所述多肽。
32.技术方案
33.因此，为了实现本发明的目的，本发明提供了
34.一种二聚体多肽，其中包含干扰素受体片段或抗体fc片段的单体在所述二聚体多肽中结合，
35.其中该单体是选自(i)、(ii)和(iii)的多肽：
36.(ii)包含干扰素受体1(ifnar1)片段和抗体fc片段的单体；
37.(ii)包含干扰素受体2(ifnar2)片段和抗体fc片段的单体；及
38.(iii)抗体fc片段。
39.为了实现本发明的另一个目的，本发明提供了一种编码该多肽的多核苷酸。
40.为了实现本发明的另一个目的，本发明提供了包含该多核苷酸的载体。
41.为了实现本发明的另一个目的，本发明提供了用该载体转化的宿主细胞。
42.为了实现本发明的另一个目的，本发明提供了一种制备该多肽的方法，包括：
43.(a)提供宿主细胞；
44.(b)培养所提供的细胞；及
45.(c)通过从细胞或培养基中回收多肽来制备多肽。
46.为了实现本发明的另一个目的，本发明
47.提供了一种用于预防或治疗1型干扰素介导的疾病或病症的药物组合物，其包括作为活性成分的所述多肽。
48.还提供了一种用于预防或治疗1型干扰素介导的疾病或病症的药物组合物，其由作为活性成分的多肽组成。
49.还提供了一种用于预防或治疗1型干扰素介导的疾病或病症的药物组合物，其主要由作为活性成分的多肽组成。
50.为了实现本发明的另一个目的，本发明提供了该多肽在制备用于预防或治疗1型干扰素介导的疾病或病症的药剂中的用途。
51.为了实现本发明的另一个目的，本发明提供了治疗1型干扰素介导的疾病或病症的方法，包括给有需要的对象施用有效量的组合物，该组合物包含作为活性成分的所述多肽。
52.下面将对本发明进行详细的描述。
53.因此，本发明是一种二聚体多肽，其中包含干扰素受体片段或抗体fc片段的单体在所述二聚体多肽中结合，
54.其中该单体提供了选自(i)、(ii)和(iii)的多肽：
55.(ii)包含干扰素受体1(ifnar1)片段和抗体fc片段的单体；
56.(ii)包含干扰素受体2(ifnar2)片段和抗体fc片段的单体；及
57.(iii)抗体fc片段。
58.在包括权利要求的本说明书中，术语“干扰素受体片段”意在包括具有人体干扰素受体活性同时具有全部或部分衍生自天然人体干扰素受体的氨基酸序列的所有多肽。
59.术语“干扰素受体1”、“ifnar 1”和“ifnar
‑
1抗原”可互换使用，并且包括人ifnar 1的变体、同种型、物种同种型和具有至少一个ifnar 1共同表位的类似物。因此，本发明的多肽在某些情况下可与来自其他非人物种的ifnar 1或结构上与人ifnar 1相关的其他蛋
白质(例如，人ifnar
‑
1同源物)发生交叉反应。在其他情况下，多肽可能对人ifnar
‑
1具有完全的特异性并且不代表物种或其他类型的交叉反应性。人ifnar 1的完整cdna序列的基因库登录号为xm_005260964.2、nm_000629.2或xm_011529552.2。
60.本发明中使用的核苷酸序列可包括ifnar 1同种型1(基因库登录号：nm_000629.2)的序列的胞外结构域(28
‑
436a.a.；p17181
‑
1)，并且可以包括该核苷酸序列的一部分。本发明的ifnar 1片段可以优选为包含seq id no：4表示的氨基酸序列的干扰素受体1，更优选为由seq id no：4表示的氨基酸序列组成的干扰素受体1。
61.在本发明的一个实施方案中，该多肽是使用干扰素受体1制备的，所述干扰素受体1包含由seq id no:4表示的氨基酸序列(多核苷酸序列由seq id no：3表示
‑
多核苷酸序列可以包括终止密码子。以下所有dna序列均相同)。
62.术语“干扰素受体2”、“ifnar 2”和“ifnar
‑
2抗原”可互换使用，并且包括人ifnar 2的变体、同种型、物种同种型和具有至少一个ifnar 2共同表位的类似物。因此，本发明的多肽在某些情况下可与来自其他非人物种的ifnar 2或结构上与人ifnar 2相关的其他蛋白质(例如，人ifnar
‑
2同源物)发生交叉反应。在其他情况下，该多肽可能对人ifnar
‑
2具有完全的特异性并且不代表物种或其他类型的交叉反应性。人ifnar 2的完整cdna序列的基因库登录号为nm_000874.4、nm_001289125.1或nm_001289126.1。本发明中使用的核苷酸序列可包括ifnar 2同种型1(基因库登录号：nm_001289125.1)的序列的胞外结构域(27
‑
243a.a.；p48551
‑
1)，并且可以包括该核苷酸序列的一部分。本发明的ifnar 2片段可以优选为包含seq id no：6表示的氨基酸序列的干扰素受体2，更优选为由seq id no：6表示的氨基酸序列组成的干扰素受体2。
63.在本发明的一个实施方案中，该多肽是使用干扰素受体2制备的，所述干扰素受体2包含由seq id no:46表示的氨基酸序列(多核苷酸序列由seq id no：5表示)。
64.此外，术语“具有衍生自干扰素受体片段的全部或部分氨基酸序列的多肽”意在包括含有seq id no：4或seq id no：6的氨基酸序列的全部或大部分的多肽，它是天然干扰素受体片段或与此类多肽基本相似的多肽的氨基酸序列。
65.此处，“包含seq id no：4或seq id no：6的整个氨基酸序列的主要部分的多肽”定义为包含具有等于或高于具有seq id no:4或seq id no:6的氨基酸序列的天然干扰素受体的活性的多肽，或seq id no:4或seq id no:6的氨基酸序列的一部分，其包含一个或多个取代的氨基酸，同时仍保留干扰素受体的活性，虽然活性低。此外，“与seq id no：4或seq id no：6表示的氨基酸序列的全部或大部分基本相似的多肽”定义为包含具有等于或高于seq id no:4或seq id no:6干扰素受体活性的多肽，或seq id no:4或seq id no:6的氨基酸序列的全部或主要部分，其包含一个或多个取代的氨基酸，同时仍保留干扰素受体的活性，虽然活性低。
66.作为包含seq id no:4或seq id no:6表示的整个氨基酸序列的主要部分的多肽，在包含seq id no:4或seq id no:6表示的氨基酸序列的多肽中，可能存在n末端部分和/或c末端部分缺失的情况，并且即使替换一个或多个氨基酸，如果替换前的氨基酸在化学上与替换的氨基酸相同，例如，当作为疏水性氨基酸的丙氨酸被另一种疏水性氨基酸替换时，可能会出现这样的情况，特别地，作为与seq id no:4或seq id no:6表示的氨基酸序列的全部或主要部分基本相似的多肽，其被疏水性更强的氨基酸取代，如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨
酸。
67.在本发明中，“融合”是指将具有不同或相同功能或结构的两个分子整合在一起，可以通过任何能够将抗体fc部分或各个单体与干扰素受体结合的物理、化学或生物方法进行融合。
68.融合优选通过连接子(linker)肽进行，该连接子肽可以结合至例如抗体的fc片段的c
‑
末端。
[0069]“抗体fc片段”可以是iga、igm、ige、igd或igg抗体的fc片段，或其修饰物。在一个实施方案中，该片段是igg抗体的fc片段(例如，igg1、igg2a、igg2b、igg3或igg4抗体的fc片段)。此外，包含本发明的fc片段的多肽可以是部分或完全糖基化的或非糖基化的。此外，除了fc片段之外，多肽可以包括一个或多个源自抗体的区域。此外，多肽可以包括抗体衍生的抗原结合结构域，并且多个多肽可以形成抗体或抗体样蛋白。
[0070]
在本说明书中，抗体fc片段的氨基酸残基编号是根据本领域常用的kabat编号系统(kabat等的欧盟索引号：proteins of immunological interest 5th ed.,u.s.department of health and human services，nih出版物第91
‑
3242号，1991年)编号的。
[0071]
根据本发明的一个实施方案，它可以包括本发明的野生型fc片段以及经取代的fc变体。
[0072]
本发明的野生型fc片段序列可以包含seq id no：8表示的氨基酸，优选可以由seq id no：8表示的氨基酸组成。
[0073]
根据kabat编号系统，本发明的经取代的fc片段包含一个或多个选自q347r、k360e、d399v、f405t和k409w的氨基酸取代。
[0074]
本发明的经取代的fc片段可以是包含k360e和k409w氨基酸取代的片段，优选地，它可以包含seq id no:12表示的氨基酸序列，更优选地，它可以由seq id no:12表示的氨基酸序列组成。
[0075]
本发明的经取代的fc片段可以是包含q347r、d399v和f405t氨基酸取代的片段，优选地，它可以由seq id no:14表示的氨基酸序列组成，更优选地，它可以由seq id no:14组成。
[0076]
此外，作为形成二聚体的单体的抗体fc片段包含seq id no:8、seq id no:12或seq id no:14，并且连接子或其他短片段肽可以连接到n
‑
末端或c
‑
末端。该连接子可以是包含选自seq id no:10、seq id no:34和seq id no:53至seq id no:76的氨基酸序列的接头。作为单体的抗体fc片段可由选自seq id no:8、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:36、seq id no:38和seq id no:40的氨基酸序列组成。
[0077]
本发明的“包含干扰素受体1(ifnar1)片段和抗体fc片段的单体“优选地可以包含i)包含由seq id no：4表示的氨基酸序列的干扰素受体1(ifnar1)和ii)包含选自seq id no:8、seq id no:12和seq id no:14的氨基酸序列的抗体fc片段，更优选地，它可以包含i)包含由seq id no:4表示的氨基酸序列的干扰素受体1(ifnar1)片段，ii)包含选自seq id no:10、seq id no:34和seq id no:53至seq id no:76的氨基酸序列的连接子，以及iii)包含选自seq id no:8、seq id no:12和seq id no:14的氨基酸序列的抗体fc片段，更优选
地，它可以是单体，其包含或由选自seq id no:22、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:42、seq id no:44和seq id no:46的氨基酸组成。
[0078]
本发明的“包含干扰素受体2(ifnar2)片段和抗体fc片段的单体“优选可以包含i)包含由seq id no：6表示的氨基酸序列的干扰素受体2(ifnar2)和ii)包含选自seq id no:8、seq id no:12和seq id no:14的氨基酸序列的抗体fc片段，更优选地，它可以包含i)包含由seq id no:6表示的氨基酸序列的干扰素受体2(ifnar2)片段，ii)包含选自seq id no:10、seq id no:34、seq id no:53至seq id no:76的氨基酸序列的连接子，以及iii)包含选自seq id no:8、seq id no:12和seq id no:14的氨基酸序列的抗体fc片段，更优选地，它可以是单体，其包含或由选自seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:48、seq id no:50和seq id no:52的氨基酸组成。
[0079]
本发明的多肽可以是中和i型干扰素的多肽，因此可以用作i型干扰素中和抗体。
[0080]
如本文所用，术语“i型干扰素”旨在指作为ifnar 1和ifnar 2配体的多个i类干扰素分子组(即，能够结合ifnar 1或ifnar 2的多个i型干扰素分子组)。i型干扰素配体的实例是干扰素α1、2a、2b、4、5、6、7、8、10、14、16、17、21、干扰素β、干扰素ω和干扰素ε。
[0081]
本领域技术人员在实施本发明时可以不受限制地使用上述多肽。
[0082]
本发明还提供了一种二聚体多肽，其中单体通过肽连接子与抗体或其片段连接。肽连接子是指将两种或多种单独物质彼此连接为氨基酸或氨基酸类似物的短片段的分子，其中氨基酸或氨基酸样物质通过肽键彼此连接。使用甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸作为主要组成氨基酸，因此可以使用甘氨酸
‑
丝氨酸连接子、甘氨酸
‑
丝氨酸
‑
丙氨酸连接子等，并且根据本发明的优选实施方式，连接子可以包含或由seq id no:8和seq id no:10表示的氨基酸序列组成。
[0083]
本发明的多肽可优选包含插入在单体之间的柔性连接子序列。
[0084]
该连接子是指天然衍生的肽连接子或合成衍生的肽连接子。该肽连接子由直链氨基酸链组成，其中20个天然存在的氨基酸为单体结构单元。该连接子可以具有重复的氨基酸序列，或也可以具有天然多肽的序列，例如具有铰链功能的多肽。由于所有的肽连接子都可以被核酸分子编码，因此其可以在重组方法中进行表达。由于该连接子本身是一种肽，每个单体可以通过肽键与该连接子连接，以形成二聚体。
[0085]
该连接子由通过肽键连接在一起的氨基酸组成，优选由通过肽键连接在一起的1至20个氨基酸组成，在这一情况下，氨基酸优选选自20个天然氨基酸。这些氨基酸中的一种或多种为本领域的普通技术人员所理解的糖基化。优选但不限于，1至20个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。
[0086]
例如，合适的连接子包括可裂解连接子和不可裂解连接子。可裂解连接子通常在细胞内条件下容易发生裂解。例如，合适的可裂解连接子包括可以被细胞内蛋白酶(如溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶)裂解的肽连接子。
[0087]
例如，该连接子是一连接子，该连接子的n末端与干扰素受体的c末端相连。连接到干扰素受体的c末端优选可以直接与该表达载体所表达的抗体连接，因为编码连接序列的核苷酸序列与表达本发明蛋白的表达载体连接，以便蛋白表达框发生重合。此外，本发明抗体fc部分的n末端与该连接子的c末端连接。
[0088]
本发明的肽连接子可以是本领域已知的肽连接子，但优选甘氨酸
‑
丝氨酸连接子、
螺旋形成肽连接子，或包含或由seq id no:8或seq id no:10的氨基酸序列组成的肽连接子。
[0089]
该连接子优选是gly
‑
ser连接子，例如(gly
x
ser
y
)
z
型(x是1至5的整数，y是1至2的整数，z是1至6的整数)，例如(gly4ser1)3或(gly3ser2)3，在螺旋形成肽连接子(或刚性螺旋连接子)的情况下，其可以是a(eaaak)na(n＝2至5的整数)。
[0090]
优选地，本发明的肽连接子可以是ggggs、(ggggs)3、(ggggs)n(n＝1、2、4)、(gly)6、(gly)8、aeaaakeaaaka、a(eaaak)4alea(eaaak)4a、(eaaak)3、eaaak、(eaaak)2、(ala
‑
pro)
n
(n为5至17，长度为10至34aa)、papap，并且可以是由选自seq id no:10、seq id no:34和seq id no:53至seq id no:76的氨基酸序列组成的肽连接子。
[0091]
在本发明中，如有必要，该肽连接子可以通过重叠上述列举的肽连接子或与其他连接子结合进行适当地构建。
[0092]
对于本发明中fc的异源二聚化，可以使用本领域已知的fc异源二聚化技术。fc异源二聚化技术见下表1。
[0093]
表1
[0094][0095]
本发明还提供多肽，其分别包括seq id no:4或seq id no:6的氨基酸序列或全部多肽。
[0096]
此外，本发明还提供
[0097]
(a)包括由seq id no:4的氨基酸序列表示的干扰素受体1片段和抗体fc片段的单体；
[0098]
(b)包括单体的二聚体多肽，该单体包括由seq id no:6的氨基酸序列表示的干扰素受体2片段和抗体fc片段；
[0099]
该单体(a)包括由seq id no:4的氨基酸序列表示干扰素受体1片段和抗体fc片段，优选地，其可以包含或由选自seq id no:22、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:42、seq id no:44和seq id no:46的氨基酸序列组成。
[0100]
该单体(b)包括由seq id no:6的氨基酸序列表示的干扰素受体2片段和抗体fc片段，优选地，其可以包含或由选自seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:48、seq id no:50和seq id no:52的氨基酸序列组成。
[0101]
本发明的多肽优选可以是调节1型干扰素的抗体。
[0102]
本发明还提供了编码该多肽的多核苷酸。
[0103]
在本发明中，“多核苷酸”或“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)。除非另有限制，否则还包括以类似于天然核苷酸的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。
[0104]
包括由seq id no:4的氨基酸序列表示的干扰素受体1片段和抗体fc片段的单体，优选地，其可以包含或由选自seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25、seq id no:41、seq id no:43和seq id no:45的dna序列组成。
[0105]
包括由seq id no:6的氨基酸序列表示的干扰素受体2片段和抗体fc片段的单体，优选地，其可以包含或由选自seq id no:27、seq id no:29、seq id no:31、seq id no:47、seq id no:49和seq id no:51的dna序列组成。
[0106]
该多核苷酸可以不受限制地使用，只要它编码本发明的多肽并且包括所有dna、cdna和rna序列。它是指编码具有由该序列表示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列的肽的多核苷酸，它可以从自然界分离或通过本领域已知的基因工程方法来进行制备。
[0107]
本发明还提供了包括该多核苷酸的载体。
[0108]
该载体是指由本领域技术人员制备的表达载体，通过根据本领域已知的任何方法将本发明的多核苷酸插入载体中并使用适当的转录/翻译调控序列来表达本发明的多肽。
[0109]
根据本发明克隆的多核苷酸序列可以操作地连接于合适的表达调控序列，并且该可操作地连接的基因序列和表达调控序列可以包括在一个表达载体(包括选择标记和复制起点)中。“可操作地连接”是指该多核苷酸序列以能够进行基因表达的方式连接至表达调控序列。“表达调控序列”是指调控特定宿主细胞中可操作地连接多核苷酸序列的表达的dna序列。此类调控序列可以包括选自影响转录的启动子、调节转录的任选操纵子序列、编码合适mrna脂质体结合位点的序列、以及控制转录和翻译终止的序列等。
[0110]
用作表达载体的亲本载体的载体并不特别受限的，可以使用通常在本发明所属领域用作宿主细胞的微生物中所表达的所有质粒、病毒或其他介质。例如，质粒包括大肠杆菌来源的质粒(pbr322、pbr325、puc118和puc119、pet
‑
22b( ))、枯草杆菌来源的质粒(pub110和ptp5)和酵母来源的质粒(yep13、yep24和ycp50)等，病毒可以使用动物病毒(如逆转录病毒、腺病毒或痘苗病毒)，昆虫病毒(如杆状病毒等)，但不限于此。
[0111]
本发明还提供了用该载体转化的宿主细胞。
[0112]
该宿主细胞可以进行选择，以调节插入序列的表达或以所需的特定方式处理基因产物。不同的宿主细胞具有对蛋白的翻译和翻译后加工修饰的特征性和特异性机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统，以为表达的异源蛋白质提供所需的修饰和加工。在酵母中
的表达可以产生生物活性的产物。在真核细胞中的表达可以增加“天然”折叠的可能性。
[0113]
正如能够稳定和连续克隆并表达本发明载体的宿主细胞可以用于本领域已知的任何宿主细胞，例如，可以使用大肠杆菌jm109、大肠杆菌bl21de、大肠杆菌dh5、大肠杆菌rr1、大肠杆菌le392、大肠杆菌b、大肠杆菌x 1776和大肠杆菌w3110等，此外，可以使用农杆菌属的菌株(如农杆菌a4)，杆菌(如枯草杆菌)，另一种肠道细菌和假单胞菌属的各种菌株(如鼠伤寒沙门氏菌，或粘质沙雷氏菌)作为宿主细胞。
[0114]
此外，当本发明的载体转染真核细胞时，作为宿主细胞，可以使用酵母(酿酒酵母)、昆虫细胞和人细胞(例如，cho细胞系(中国仓鼠卵巢)、expi293、w138、bhk、cos
‑
7、293、hepg2、3t3、rin和mdck细胞系)等。
[0115]
在本发明中，该宿主细胞优选为expi293或cho细胞系。
[0116]
将该载体递送到宿主细胞中的转染宿主细胞的方法可以是任何已知的方法并不是特别受限的。例如，通过基因轰击、聚阳离子和使用磷酸钙沉淀的受体介导的转染、deae
‑
葡聚糖法、电穿孔法、直接显微注射法、dna负载脂质体法、脂质体
‑
dna复合物法、细胞超声法(细胞超声)，高速基因枪(high velocity microprojectile)，可以进行转染。这些技术中的一些可以改进以用于体内或离体使用。
[0117]
本发明还提供了二聚体多肽的生产方法，其包括(a)提供宿主细胞，(b)培养提供的细胞，和(c)通过从细胞或培养基中回收多肽来制备本发明的多肽。
[0118]
在允许表达融合蛋白(或融合多肽)的适当条件下，进行转化细胞的培养，这些条件可以根据本领域技术人员所熟知的方法进行。转化细胞可以通过常规培养方法大量培养。作为培养基，可以使用由碳源、氮源、维生素和矿物质组成的培养基，例如，可以使用2xyt培养基。可以在正常细胞培养条件下进行细胞培养，例如，可以在15℃至45℃温度范围内培养10小时至40小时。为了去除培养基中的细胞并仅回收培养基，可以进行离心或过滤。这些步骤可以由本领域的技术人员根据需要来执行。已去除细胞的培养基(滤液)可以根据常规方法进行冷藏和短时间的保存，以免失去活性。
[0119]
在转化细胞(或转化子)中表达的融合蛋白可以通过常规方式进行纯化，例如，本发明的融合蛋白可以通过如盐析(例如硫酸铵沉淀、磷酸钠沉淀)、柱层析和超滤(如溶剂沉淀(使用丙酮、乙醇等蛋白组分的沉淀)、透析、凝胶过滤、离子交换、反相柱层析、亲和色谱)的技术的单用或联用进行纯化。
[0120]
本发明的干扰素受体是在翻译后修饰过程中含有大量糖基化的高糖基化蛋白，而微生物培养可能不适合，因为相应的糖会引起结构稳定性的问题。因此，本发明的多肽可以优选为动物细胞的宿主细胞。
[0121]
因此，本发明提供了用于预防或治疗1型干扰素介导的疾病或病症的药物组合物，其包括作为活性成分的多肽。
[0122]
根据本发明的“1型干扰素介导的疾病”是指由1型干扰素介导的疾病或病症，或与干扰素诱导基因的异常表达(例如过表达或表达抑制)相关的疾病，示例包括但不限于系统性红斑狼疮(sle,j immunol.2014jun 15；192(12):5459
–
5468.)、干燥综合征(autoimmun rev.2013mar；12(5):558
‑
66.)、胰岛素依赖型糖尿病(iddm)、炎症性肠病(ibd，包括克罗恩病、溃疡性结肠炎和乳糜泻)、多发性硬化症(ms)、银屑病、自身免疫性甲状腺炎、类风湿性关节炎(ra,front immunol.2017；8:2007.)、炎性肌炎(arthritis rheum 2009；60:
181524.；mol med 2007；13:5968.)和肾小球肾炎。此外，本发明的组合物可以用于抑制或预防移植排斥反应或用于治疗移植物抗宿主反应(gvhd)或用于治疗hiv感染/aids。
[0123]
同时，通过以纯形式或与药学上可接受的载体的适当形式配制该多肽，可以提供根据本发明的药物组合物。“药学上可接受的”是指生理学上可接受的无毒组合物，并且当给予人类时，通常不会引起过敏反应，如胃肠道疾病、头晕或类似反应。该载体包括各种溶剂、分散介质、水包油或油包水乳剂、水性组合物、脂质体、微珠和微粒体。
[0124]
同时，依赖于给药途径使用适当的载体，可以配制根据本发明的药物组合物。根据本发明的药物组合物的给药途径不限于此，但可以口服或肠胃外给药。肠胃外给药途径包括多种途径，例如，如经皮、经鼻、腹膜内、肌内、皮下或静脉内。
[0125]
当本发明的药物组合物为口服给药时，本发明的药物组合物可以根据本发明已知的方法与适合口服给药的载体一起配制为粉剂、颗粒剂、片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、混悬剂、薄片等形式。合适载体的示例包括在以下中：糖(包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇和麦芽糖醇等)、淀粉(包括玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉和马铃薯淀粉等)、纤维素(包括纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基甲基纤维素等)、填料(如明胶、聚乙烯吡咯烷酮等)等。此外，如果需要，可以加入交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸或海藻酸钠作为崩解剂。此外，该药物组合物还可以包括抗聚集剂、润滑剂、润湿剂、矫味剂、乳化剂和防腐剂等。
[0126]
此外，当肠胃外给药时，本发明的药物组合物可以根据现有技术中已知的方法与适合肠胃外的载体一起配制为注射剂、经皮给药和鼻吸入剂的形式。在注射剂的情况下，必须对其进行灭菌，并防止微生物(如细菌和真菌)的污染。对于注射剂，合适载体的示例可以包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其混合物和/或含有植物油的溶剂或分散介质。更优选地，作为合适的载体，可以使用汉克斯溶液、林格氏溶液、等渗溶液(如磷酸盐缓冲盐水(pbs)或无菌注射用水)、含三乙醇胺的10％乙醇、40％丙二醇和5％葡萄糖等。为了防止注射剂受到微生物的污染，其还可以包括各种抗菌和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。此外，在大多数情况下，注射剂还可以含有等渗剂，如糖或氯化钠。
[0127]
在经皮给药的情况下，包括软膏、乳膏、洗剂、凝胶、外用溶液、面食、搽剂和空气等形式。正如本文中使用的，“经皮给药”是指通过将该药物组合物局部给予皮肤，将药物组合物中所含有效量的活性成分递送至皮肤中。这些制剂在药物化学中常见的配方手册中得到了描述。
[0128]
对于吸入给药，根据本发明使用的化合物可以使用适当的推进剂(例如二氯氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适当的气体)以气溶胶喷雾的形式从加压包装或雾化器方便地进行递送。在加压气雾剂的情况下，可以通过提供递送定量的阀门来确定剂量单位。例如，可以将吸入器或气腹器中使用的明胶胶囊和弹丸配制成含有该化合物的粉末混合物和合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)。作为其他药学上可接受的载体，可以参考本领域已知的载体。
[0129]
此外，根据本发明的药物组合物还可以包括一种或多种缓冲液(例如，盐水或pbs)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐)、稳定剂(亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸)、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂(例如，edta或谷胱甘肽)、佐剂(例如，氢氧化铝)、
悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂(苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇)。
[0130]
此外，本发明的药物组合物可以使用本领域已知的方法进行配制，以便在给予哺乳动物后快速、持续或延迟释放活性成分。
[0131]
以上述方式配制的药物组合物可以通过各种途径(包括口服、经皮、皮下、静脉内或肌内)以有效量来给予。正如本文使用的，术语“有效量”是指当给予患者时能够追踪诊断或治疗效果的化合物或提取物的量。根据给药途径、给药目标、目标疾病及其严重程度、年龄、性别、体重、个体差异和疾病状态，可以适当选择根据本发明的药物组合物的剂量。优选地，包括本发明多肽的药物组合物可以依赖于疾病的严重程度改变活性成分的含量，但是，一般而言，基于成人，当给药一次时，可以以10μg至10mg的有效剂量每天多次重复给药。
[0132]
此外，本发明提供了包括作为活性成分的多肽的疫苗，并且根据本发明的疫苗是用于预防或治疗1型干扰素介导的疾病或病症的疫苗。
[0133]
正如本文中使用的，术语“疫苗”是指通过注射或经口给予人或动物在活体中诱导免疫力以用于预防感染的免疫原或抗原物质，该免疫原或抗原物质作为含有赋予活体免疫力的抗原的生物制剂。体内免疫在很大程度上分为自动免疫(感染病原体后自动获得)和被动免疫(通过外部注射疫苗获得)。而自身免疫的特征是产生与免疫有关的抗体时间长，免疫力持续，疫苗的被动免疫对感染的治疗立即起作用，但缺点是持久性差。
[0134]
本发明的疫苗组合物可以包括药学上可接受的载体。它是指适合将抗原材料递送至体内某部位的任何组分，示例包括但不限于水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、含血清溶液、汉克斯溶液、其他生理平衡的水溶液、油、酯和乙二醇等。
[0135]
本发明的载体可以含有增强化学稳定性和等渗性的合适的辅助成分和防腐剂，可以包括稳定剂，如海藻糖、甘氨酸、山梨醇、乳糖或味精(msg)，以保护疫苗组合物免受温度变化或冻干。本发明的疫苗组合物可以含有混悬液，例如无菌水或盐水(优选缓冲盐水)。
[0136]
本发明的疫苗组合物可以含有足以增强对免疫原的免疫应答的任何佐剂。合适的佐剂在本领域是已知的，示例包括但不限于铝盐(磷酸铝或氢氧化铝)、角鲨烯混合物(saf
‑
1)、胞壁酰基肽、皂苷衍生物、分枝杆菌细胞壁制剂、单磷脂质a、霉菌酸衍生物、非离子嵌段共聚物表面活性剂、quil a、霍乱毒素b亚基、聚磷腈及其衍生物和免疫刺激复合物(iscom)。
[0137]
与所有其他疫苗组合物一样，必须根据经验确定免疫原的免疫有效量，在这种情况下，可考虑的因素包括免疫系统的免疫原性、给药途径和给药频率。此外，可以根据患者的疾病进展和转移状态、制剂类型、患者的年龄、性别、体重、健康状况、饮食、给药时间和给药方法进行调整。
[0138]
本发明的疫苗组合物中的二聚体多肽在本发明组合物中可以以各种浓度存在，但是，通常情况下，抗原材料包含在诱导体内形成合适水平抗体所需的浓度中。
[0139]
在本发明中，所述术语“给药”是指通过任何合适的方法将预定量的物质注入患者体内，所述本发明疫苗的给药途径可以通过任何常规途径给药，只要它们能够到达目标组织。
[0140]
本发明的所述疫苗组合物可用于通过全身或粘膜途径给药治疗1型干扰素介导的疾病或病症。
[0141]
所述泌尿生殖道疫苗组合物的给药可以包括但不限于通过肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射、口服/膳食注射、呼吸道注射和粘膜注射到尿道。
[0142]
此外，为了提高所述疫苗的效力，在注射该疫苗时，可以与有助于激活t细胞的细胞因子如il
‑
12共同给药，或使用转染这些细胞因子基因的疫苗。
[0143]
含有所述二聚体型多肽的细胞，是产自本发明的疫苗的活性成分，也可以耗尽细胞增殖，以增加安全性，因为人体是作为治疗性疫苗接种的。例如，为了更安全地、选择性地用作细胞疫苗，可以通过热处理、放疗或丝裂霉素c(mmc)治疗，消除增殖，同时保留疫苗功能。例如，当使用x射线照射时，总辐射剂量可达1000至3300拉德。以丝裂霉素c处理方法为例，在多肽中加入25～50μg/ml丝裂霉素c，可在37℃下热处理30～60分钟。例如，在细胞加热处理方法中，热处理可以在50℃至65℃进行20分钟。
[0144]
在这里，“治疗”指的是一种临床过程，旨在改变被治疗对象或细胞的自然过程，它也可以用于预防临床病理。治疗的理想效果包括抑制疾病的发生或复发，减轻症状，减少疾病的任何直接或间接病理后果，降低疾病进展速度，缓解、改善、减轻或改善预后等。此外，所述术语“预防”是指任何抑制疾病发作或延缓疾病进展的任何行动。
[0145]
在本发明中，所述术语“包含”的含义与“包括”或“其特征在于”相同，在根据本发明的组合物或方法中，不排除该方法中未特别提到的附加组分或步骤。此外，所述术语“由......组成”是指不包括没有单独描述的额外元素、步骤或成分。所述术语“主要由
……
组成”是指，在所述组合物或方法的范围内，除了所描述的物质或步骤外，还可以包括对其基本性质没有实质影响的物质或步骤。
[0146]
本发明还提供了所述多肽在制备用于预防或治疗1型干扰素介导的疾病或病症的药剂中的用途。
[0147]
此外，本发明还提供一种用于治疗1型干扰素介导的疾病或病症的方法，包括给有需要的对象使用有效量的组合物，该组合物包含作为活性成分的多肽。
[0148]
本发明的所述“有效量”是指个体给药时时，表现出改善、治疗、预防、检测、诊断、抑制或减少1型干扰素介导的疾病或病症，或1型干扰素介导的疾病或病症的效果的量，而且“受试者”可以是动物，最好是动物，包括哺乳动物，特别是人类，以及从动物剥离出来的细胞、组织、器官或类似物。该受试者可能是有该需要的患者。
[0149]
本发明的所述“治疗”一般是指改善1型干扰素介导的疾病或病症，或1型干扰素介导的疾病或病症的症状，这可能包括治疗、充分预防或改善状况，并包括缓解、治疗或预防疾病引起的一个或大部分症状，但不限于此。
[0150]
有益效果
[0151]
本发明的中和1型干扰素的fc
‑
融合蛋白阻断1型干扰素与干扰素受体的结合，具有良好的对信号机制起始和生物活性的抑制，从而有效治疗1型干扰素介导的疾病。
附图说明
[0152]
附图1为1型干扰素fc融合受体蛋白表达载体的制备示意图。
[0153]
附图2a为通过大小排除色谱法比较每种蛋白质的大小的结果。
[0154]
附图2b为证实ifnar1/2异源fc融合蛋白在自然条件和还原条件下与人体ifnβ结合的结果。
id no:3)、ifnar2的胞外结构域(seq id no:5)、多肽接头(seq id no:33)和人体ighg的fc部分(seq id no:11)以及包含kozac序列和信号序列的变体(seq id no:13，seq id no:13，seq id no 15)的基因被密码子优化以合成该基因，从而制备图1的核苷酸序列片段e至g。在每个核苷酸序列片段的表达载体的限制性酶位点中，使用nhei和xho i之间的t4 dna连接酶(rbc)制备表达载体。
[0170]
实施例2:蛋白质表达纯化、结构确认和结合确认
[0171]
以下表述和提纯工艺，旨在使用插入了每种组合的核苷酸序列片段的表达载体生产具有附图2c所示结构的蛋白质。
[0172]
为了维持每种1型干扰素受体的天然翻译后修饰(ptm)，所有重组蛋白表达都使用根据细胞瞬时表达系统方案的300
‑
600毫升的expi293tm表达培养基，使用人类衍生的表达细胞expi293细胞系(thermo fisher scientific)。根据最终的蛋白质，将一个或两个表达载体转染到细胞中，然后根据制造商的方案加入增强子1和2。然后，将培养6天的培养基在6580转/分钟、20分钟和8℃下离心，然后用0.22微米聚乙烯过滤器(康宁)过滤。所有蛋白质都在akta前纯化系统(ge通用电气医疗生命科学)中纯化，用20mm磷酸钠、ph 7.2和150mm氯化钠缓冲液以5ml/min的速率填充mabselect sure(ge通用电气医疗生命科学)至柱平均最多为2cv，然后使培养液流动以结合到树脂上。
[0173]
然后，该重组蛋白在使用5cv的35mm磷酸钠、ph7.2、500mm尔氯化钠缓冲液和1cv的20mm磷酸钠、ph7.2缓冲液柱洗过程后，用100mm柠檬酸盐、ph3.5缓冲液进行洗脱，经过12小时透析并使用4l 1x pbs缓冲液(biosesang)进行3次透析，使用amicon ultra centrifugal过滤器(50k
‑
cut off，merck millipore公司生产)将洗脱的蛋白质浓缩至3毫升。使用用于透析的相同缓冲液在hiload superdex 200pg(ge医疗保健生命科学)柱上另行将浓缩的重组蛋白与目标蛋白分离。
[0174]
结果，如附图2a所示，通过大小排阻色谱法比较了每个fc融合蛋白的大小，预计其具有图2c所示的蛋白质结构。
[0175]
此外，如图2b所示，分别在天然条件(7.5％mini
‑
tgxtm precase蛋白凝胶)、还原条件(any kdtm mini
‑
protein tgxtm precase蛋白凝胶，bio
‑
rad)下，确认了ifnar1/2杂fc融合蛋白与人体ifnβ
‑
1a之间的结合
[0176]
本发明氨基酸序列的fc部分包括ighg1(100
‑
330a.a.)的hinge部分，以及由氨基酸109
‑
109和112
‑
112形成二硫键形成二聚体。更具体地说，由于fc的ch3部分的特定氨基酸序列的变化，异二聚体的形成主要是从同二聚体到异二聚体。
[0177]
实施例3:使用fc融合蛋白的spr分析
[0178]
通过附图1和hifnβ
‑
1a的表达载体组合表达/纯化，分析了i型干扰素中fc融合蛋白(ifnar2
‑
fc异二聚体、ifnar1/2
‑
fc异二聚体、ifnar1
‑
fc异二聚体)的结合亲和性和动力。
[0179]
本实验采用(ifnar1
‑
fc ew
‑
fc rvt)、(ifnar2
‑
fc ew
‑
fc rvt)和(ifnar1
‑
fc ew ifnar2fc rvt)分析结合强度和动力。在表达(ifnar1
‑
fc rvt ifnar2
‑
fc ew)时，由于确认了同二聚体形式出现多于(ifnar1
‑
fc ew ifnar2
‑
fc rvt)的问题，所以没有使用(ifnar1
‑
fc rvt ifnar2
‑
fc ew)。
[0180]
基于biacore t200(ge医疗生命科学)，使用25℃、30μl/min条件和0.005％dpbst
(dpbs/改良、hyclone和tween20，signal)运行缓冲液，所述金质传感器芯片与anti
‑
human fcγ经胺偶联捕获抗体(affinipure goat anti
‑
human igg，fcγ特异性片段，jackson immunoresearch)。在180秒、聚相和600秒、离相条件下测试每种分析物。
[0181]
如图3所示，根据hifnb
‑
1a
‑
ifnar2(1:1拟合模型)、hifnb
‑
1a
‑
ifnar1/2(异质配体模型)、hifnb
‑
1a
‑
ifnar1(双态结合模型)传感图形状和对接模型预测进行曲线拟合。特别是，ifnar1/2异源fc融合蛋白显示出低的kd值。(见表2和表3)
[0182]
表2
[0183][0184]
a
传感图用一对一结合模型拟合
[0185]
b
静态平衡分析使用179.04秒的各个参数进行估计
[0186]
c
传感图用异源配体模型拟合
[0187]
表3
[0188][0189]
a
传感图用双态结合模型拟合
[0190]
实施例4:通过fc融合蛋白的配体确认生物活性中和能力
[0191]
通过以下实验以证实fc融合蛋白由配体引起的生物活性的中和能力。与实施例3一样，在该实验中使用了(ifnar1
‑
fc ew
‑
fc rvt)、(ifnar2
‑
fc ew
‑
fc rvt)和(ifnar1
‑
fc ew ifnar2fc rvt)。
[0192]
所有实验都是基于hifn
‑
β在daudi细胞中使用ez
‑
cytox细胞活力测定试剂盒(deaillab)的抗增殖作用而设计的，其中每个受体的表达都很高。该试验方法显示了充分地反映配体生物物理特性的试验结果，类似于spr动力学分析的结果。
[0193]
具体而言，在96孔板(spl)中，3
×
103细胞的细胞中hifn
‑
β
‑
1a的含量来确定通过浓度(10nm的ifnar1
‑
fc异二聚体、ifnar2
‑
fc异二聚体、ifnar1/2
‑
fc异二聚体；ifnar1
‑
fc异二聚体的6pm；ifnar1/2
‑
fc异二聚体)，然后在37℃和5％co2的细胞培养箱中进行反应72小时。然后，在根据制造商的方案添加ex
‑
cytox试剂后，再额外反应3小时后，在450nm处用微孔板读数器(genios pro，tecan)测量，并使用非线性回归分析(graphpad prism7.0版软件，美国加利福尼亚州圣地亚哥)比较和分析ic
50
值。通过单向方差分析(one
‑
way anova)、bonferroni的多重比较事后检验，证实了本发明每种蛋白质的中和能力具有统计学意义。
scientific_#23227)测定。总蛋白通过十二烷基硫酸钠
‑
聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds
‑
page)在10％凝胶上分离，并转录到聚偏氟乙烯膜上(bio rad_#1620177)。在室温下用5％脱脂牛奶、3％牛血清白蛋白、10毫摩尔/升tris
‑
hcl(ph 8.0)、150毫摩尔/升nacl和0.05％吐温
‑
20封闭薄膜1小时。所述封闭的薄膜用stat1抗体(cell signallig_#06
‑
501)、pstat1抗体(cell signallig_#58d6)和β肌动蛋白抗体(santa cruz_#sc 47778)作为初级抗体(1:3000稀释)在4℃下处理并过夜。然后，在室温下处理二代酶标抗体、山羊对兔抗体(invitrogen_#31460)和山羊对鼠抗体(invitrogen_#g 21040)1小时。用ecl溶液(bio rad_#1705061)处理所述薄膜后，使用poohung公司的显影剂和定影液将其显现在胶片(agfa healthcare_#ea8ec)上。
[0205]
结果如附图6a和6b所示，证实了当用干扰素(ifn
‑
α1、ifn
‑
α2a、ifn
‑
α2b、ifn
‑
α5、ifn
‑
α8、ifn
‑
α10、ifn
‑
β1a)处理阻断ifnar1和ifnar2结合的ifnar1/2
‑
fc异二聚体(4gs*3)蛋白时，与仅用干扰素处理时pstat1蛋白的高磷酸化相比，pstat1蛋白的磷酸化显著降低。这表明ifnar1/2
‑
fc异二聚体蛋白与1型干扰素结合并表现出中和能力，表明细胞中与干扰素相关的信号传导受到抑制。
[0206]
工业实用性
[0207]
本发明的中和fc融合蛋白1型干扰素具有优异的工业实用性，当阻断1型干扰素与干扰素受体的结合时，具有优异的信号机制起始和生物活性抑制，因此它可以非常有效地用于开发用于预防或治疗1型干扰素介导的疾病治疗药剂。