破囊壶菌生物质用于维持肠道屏障功能的用途的制作方法

1.本发明属于营养领域，更特别是人类和动物营养。它涉及破囊壶菌生物质用于维持个体肠道屏障功能的用途。


背景技术：

2.在动物生产中，饲养期间的几个因素可能会影响动物健康和生产力的保持。已经确定了各种各样的非生物应激源，例如社会交往或粗暴对待、常见的农场实践(例如阉割、脱毛、牙齿修剪、修蹄、断奶逼迫等)、不当喂养、暴露于不利的气候条件、锻炼、工作和运输。在这些因素中的任何失衡都会首先诱导动物的适应和耐受，这可能导致行为、生物和身体反应。如果不适应的情况没有迅速纠正，可能会超过耐受阈值，动物会通过应激将失衡外化。应激是一种反射反应，表现为动物无法应对环境，这可能导致许多不利的后果，从不适到死亡。引发应激的刺激不一定是痛苦的，但可能会激活生理反应，动物可能会产生行为、自主、内分泌或免疫反应来维持体内平衡。如果动物无法承受应激，后果将是生物功能异常，这可能导致心身疾病的发展、免疫抑制、生产和繁殖效率降低。应激会影响行为能力，并可能使动物更容易受到生理病理病症的影响。所有这些有害的动物反应尤其(至少部分)与受损的肠道生理功能有关。
3.肠上皮形成的屏障将外部环境(即肠腔的内容物)与身体隔开。肠上皮由单层上皮细胞组成，具有两种重要的功能，这两种功能似乎是相互冲突的。一方面，它必须充当屏障，防止栖息在胃肠道中的微生物以及肠食糜中可能存在的不良成分进入。另一方面，它必须促进从肠腔中摄取膳食营养、电解质、水和各种其他有益物质。
4.肠上皮通过形成复杂的蛋白质
‑
蛋白质网络来保持其选择性屏障功能，该网络机械地连接相邻细胞并密封细胞间隙，特别是通过紧密连接的参与。动物的每一次应激反应都将挑战粘膜屏障的完整性，并且肠上皮需要适应多种信号，以便执行维持和恢复其屏障功能的复杂过程。功能良好的上皮对于优化饮食营养的吸收也是至关重要的，这些营养对于有效的代谢过程是必不可少的。能够帮助动物维持其肠道屏障完整性的条件是面对不利饲养条件所需的稳定生理状态的试金石。
5.为了克服应激条件对肠道生理功能和动物生产力的影响，已经提出了许多不同的策略。目前的解决方案通常是预防性的，使用饮食抗生素生长促进剂(agp)和生物安全措施来控制环境参数。由于对抗生素耐药性的担忧以及与确定适当管理实践/生物安全措施及其相互作用相关的困难，已经开发了替代预防方法，以便为农场层面的综合方法提供补充解决方案。联合饲料添加剂以支持宿主消化过程和肠道生理功能是世界各地许多研究团队的特别关注焦点。这些包括益生菌、益生元、短链和中链脂肪酸、草药化合物等分子(van immerseel et al.(2017),microb.biotechnol.,10(5):1008
‑
1011)。由于生产动物的一个关键问题是营养物质的可消化性和从饮食中获得的能量，补充消化促进剂(如酶)也有助于控制饮食应激。然而，除了复杂的饮食配方和相关的成本，补充不同的饲料添加剂引起的相互作用并不总是被充分描述和众所周知的。
6.因此，人们希望开发功能性成分，既能提供蛋白质和氨基酸等必需营养，又能提供对多因素应激的保护，同时保持肠道屏障的完整性，防止不需要的化合物转移到体内，以降低饮食和兽医成本，同时确保饲养实践。
7.破囊壶菌微藻以其在生物燃料生产中的用途和作为多不饱和脂肪酸的来源而闻名。在wo2017/012931中还表明，对于接受基于玉米和豆粕的标准起始饮食(这对于鸡的新陈代谢是最佳的)并且没有经受应激条件(例如营养/饮食应激源)的动物而言，破囊壶菌的富含蛋白质的生物质可以提高动物性能。wo2004/080196公开了包含较低真菌生物质(例如来自破囊壶菌微藻)的动物饲料，其可以具有广泛的效果，包括改善肠道功能、刺激益生菌定植和改善食物转化。类似地，这里的动物没有被置于应激条件下(无论是环境条件，如放养密度，还是饮食)。
8.us 2017/0369681中公开的发明在于微藻(包括破囊壶菌微藻)和可溶性难消化纤维的组合，对肠道菌群的细菌刺激、它们的酶产生以及通过从溶解的微藻中释放活性剂来保护肠道健康具有协同作用(而这种作用在单独的微藻中没有观察到)。此外，在该文献中公开了微藻(更具体地，小球藻、嗜糖小球藻、栅藻、莱茵衣藻或杜氏盐藻)可以在其细胞壁上吸附由肠道致病菌合成的毒素(这些毒素中的一些与许多肠道疾病包括炎症疾病有关)。然而，众所周知，不同微藻之间的细胞壁组成可能会有显著差异，特别是破囊壶菌的细胞壁组成与小球藻的细胞壁组成非常不同(domozych et al(2012),frontiers in plant science,3:82；gerken et al(2013),planta,237(1):239
‑
253；darley et al(1973),arch.mikrobiol.,90:89
‑
106)。在bedirli et al(2009),clinical nutrition 28:674
‑
678中，也显示了不同的微藻可以有不同的效果；特别是小球藻微藻，而不是螺旋藻微藻，可以减少梗阻性黄疸时细菌和内毒素的肠道易位。
9.发明人现已完全出乎意料地发现，破囊壶菌微藻既能带来必需的营养物质(如蛋白质和氨基酸)，又能提供对多因素应激的保护，同时保持肠道屏障的完整性，并防止不良化合物转移到体内。


技术实现要素：

10.因此，本发明涉及破囊壶菌生物质用于维持个体肠道屏障功能的用途。
11.在本发明的上下文中：
12.‑
术语“破囊壶菌”是指破囊壶菌科的微藻或单细胞原生生物。该科属于破囊壶菌目和网粘菌纲；
13.‑
术语“生物质”是指一组细胞，它们是通过培养所述细胞(通常在发酵罐中)产生的，并且其中所述细胞可以保持或不保持其物理完整性。生物质可以包含一定量的降解的细胞，范围从0％到100％。术语“降解的”是指所述细胞的结构可能已被修饰。例如，它们可能经受了裂解步骤、发酵转化步骤和/或干燥步骤；
14.‑
术语“维持肠道屏障功能”应理解为意指肠道的屏障功能维持在功能或生理状态。肠道的屏障功能是选择性过滤某些营养物质通过肠道，并被有效消化吸收，同时防止一些其他不良成分通过肠道。更具体地说，当个体经受应激源(例如在不利的饲养条件下可能发生的)或挑战(即破坏肠道屏障功能的因素，例如影响肠道通透性的因素)时，根据本发明的破囊壶菌生物质允许避免或限制与这种应激源或挑战相关的对肠道屏障功能的影响。优
选地，在这种应激或挑战条件下，当使用根据本发明的破囊壶菌生物质时，与没有应激源或挑战时的肠道屏障功能在统计学上没有区别。肠道屏障功能可以例如通过测量肠道通透性或通过测量营养吸收(如实施例2所述)来评估。可以使用本领域技术人员熟知的方法来测量肠道通透性，例如跨上皮电阻(ter)测量，或者评估fitc
‑
葡聚糖通过肠道隔室的渗透。特别是，通过在置于细胞单层两侧的电极上施加交流电信号，并测量电压和电流来计算屏障的电阻，ter可以给出肠细胞单层膜完整性的指示。ter值越高，肠屏障越紧密，通透性越低；
15.‑
术语“个体”指人或动物；
16.‑
术语“家畜动物”是指在农业环境中饲养的用于生产劳动和各种商品的驯养动物；更具体地说，畜牧动物(特别是为了肉、奶、奶酪和皮革而饲养的牛；为了肉、羊毛和奶酪而饲养的羊；山羊)、猪、兔、家禽(鸡(chicken)、鸡(hen)、火鸡、鸭、鹅等)、马家族成员(小马、马、马驹)、旨在支持人类活动或为其提供食物的动物、水生动物(例如鱼、虾、牡蛎和贻贝)。
17.‑“
宠物”或“休闲动物”指的是作为伴侣养在家里的动物。它们包括哺乳动物，特别是狗和猫，但也包括观赏鱼或鸟舍或笼中鸟。
18.优选地，所述破囊壶菌生物质用于维持个体(优选动物)的肠道屏障功能，所述个体经受应激性或挑战性条件，特别是可能损害其生理功能的应激源或挑战。在动物生产中，已经确定了各种各样的非生物应激源，这些应激源尤其可能与以下方面有关：
19.‑
社交活动(如摘羽毛、咬尾巴等)，
20.‑
常见的农场实践(如粗暴对待、阉割、脱毛、牙齿修剪、修蹄、断奶、拥挤、高放养密度、运输、取暖、通风、空气调节等)，
21.‑
营养条件(例如饲料竞争、替代性较难消化的成分等)，以及
22.‑
环境条件(例如湿垃圾、过量氨产生、暴露于不利的气候条件等)。
23.应激源尤其可能发生在密集的动物饲养/家畜操作和不利的饲养条件下。
24.优选地，根据本发明使用的破囊壶菌选自由如下组成的组：
25.‑
不动壶菌属(aplanochytrium)的破囊壶菌；更优选不动壶菌未定种(aplanochytrium sp.)、aplanochytrium kerguelense、小不动壶菌(aplanochytrium minuta)、aplanochytrium stocchinoi种的破囊壶菌；甚至更优选不动壶菌未定种pr24
‑
1株的破囊壶菌；
26.‑
橙黄壶菌属(aurantiochytrium)的破囊壶菌；更优选橙黄壶菌未定种、蛞蝓橙黄壶菌(aurantiochytrium limacinum)、红树橙黄壶菌(aurantiochytrium mangrovei)种的破囊壶菌；甚至更优选橙黄壶菌未定种ab052555、橙黄壶菌未定种ab073308、橙黄壶菌未定种atcc pra276 dq836628、橙黄壶菌未定种bl10 fj821477、橙黄壶菌未定种ly 2012 pku mn5 jx847361、橙黄壶菌未定种ly2012 jx847370、橙黄壶菌未定种n1
‑
27、橙黄壶菌未定种sd116、橙黄壶菌未定种sek209 ab290574、橙黄壶菌未定种sek217 ab290572、橙黄壶菌未定种sek 218 ab290573、橙黄壶菌未定种18w
‑
13a、蛞蝓橙黄壶菌ab022107、蛞蝓橙黄壶菌hm042909、蛞蝓橙黄壶菌jn986842、蛞蝓橙黄壶菌sl1101、红树橙黄壶菌dq323157、红树橙黄壶菌dq356659、红树橙黄壶菌dq367049、红树橙黄壶菌ccap 4062/1、红树橙黄壶菌ccap 4062/2、红树橙黄壶菌ccap 4062/3、红树橙黄壶菌ccap 4062/4、红树橙黄壶菌ccap 4062/5、红树橙黄壶菌ccap 4062/6株的破囊壶菌；
27.‑
葡萄壶菌属(botryochytrium)的破囊壶菌；更优选葡萄壶菌未定种、botryochytrium radiatum种的破囊壶菌；甚至更优选葡萄壶菌未定种butrbc 143、葡萄壶菌未定种raghukumar 29、botryochytrium radiatum raghukumar 16、botryochytrium radiatum sek353株的破囊壶菌；
28.‑
日本壶菌属(japonochytrium)的破囊壶菌；
29.‑
矩圆壶菌属(oblongichytrium)的破囊壶菌；更优选矩圆壶菌未定种、小矩圆壶菌(oblongichytrium minutum)、oblongichytrium multirudimentalis种的破囊壶菌；甚至更优选矩圆壶菌未定种sek347株的破囊壶菌；
30.‑
帕里蒂氏壶菌属(parieticytrium)的破囊壶菌；更优选帕里蒂氏壶菌未定种、parieticytrium sarkarianum种的破囊壶菌；甚至更优选帕里蒂氏壶菌未定种f3
‑
1、帕里蒂氏壶菌未定种h1
‑
14、帕里蒂氏壶菌未定种nbrc102984、parieticytrium sarkarianum sek351、parieticytrium sarkarianum sek364株的破囊壶菌；
31.‑
疫霉属(phytophthora)属的破囊壶菌；更优选致病疫霉(phytophthorainfestans)种的破囊壶菌；
32.‑
裂殖壶菌属(schizochytrium)的破囊壶菌；更优选裂殖壶菌未定种、聚合裂殖壶菌(schizochytrium aggregatum)、蛞蝓裂殖壶菌(schizochytrium limacinum)、红树裂殖壶菌(schizochytrium mangrovei)种的破囊壶菌；甚至更优选裂殖壶菌未定种atcc20888 dq367050、裂殖壶菌未定种kgs2 kc297137、裂殖壶菌未定种ska10 jq248009、裂殖壶菌未定种atcc 20111、裂殖壶菌未定种atcc 20888、裂殖壶菌未定种atcc 20111 dq323158*、裂殖壶菌未定种atcc 20888dq356660、裂殖壶菌未定种atcc 20889、裂殖壶菌未定种atcc 26185、裂殖壶菌未定种br2.1.2、裂殖壶菌未定种bucaaa 032、裂殖壶菌未定种bucaaa 093、裂殖壶菌未定种bucacd 152、裂殖壶菌未定种bucara 021、裂殖壶菌未定种buchao 113、裂殖壶菌未定种burabq 133、裂殖壶菌未定种burarm 801、裂殖壶菌未定种burarm 802、裂殖壶菌未定种ccap 4087/3、裂殖壶菌未定种ccap 4087/1、裂殖壶菌未定种ccap 4087/4、裂殖壶菌未定种ccap 4087/5、裂殖壶菌未定种fju
‑
512、裂殖壶菌未定种kh105、裂殖壶菌未定种kk17
‑
3、裂殖壶菌未定种kr
‑
5、裂殖壶菌未定种pj10.4、裂殖壶菌未定种sek 210、裂殖壶菌未定种sek 345、裂殖壶菌未定种sek 346、裂殖壶菌未定种sr21、裂殖壶菌未定种t1001、聚合裂殖壶菌dq323159、聚合裂殖壶菌dq356661、蛞蝓裂殖壶菌ouc166 hm042907、红树裂殖壶菌fb1、红树裂殖壶菌fb3、红树裂殖壶菌fbs株的破囊壶菌；
33.‑
葫芦状壶菌属(sicyoidochytrium)的破囊壶菌；更优选小葫芦状壶菌(sicyoidochytrium minutum)种的破囊壶菌；甚至更优选小葫芦状壶菌sek354、小葫芦状壶菌nbrc 102975、小葫芦状壶菌nbrc 102979株的破囊壶菌；
34.‑
破囊壶菌科(thraustochytriidae)属的破囊壶菌；更优选破囊壶菌科未定种的破囊壶菌；甚至更优选破囊壶菌科未定种burabg162 dq100295、破囊壶菌科未定种cg9、破囊壶菌科未定种ly2012 jx847378、破囊壶菌科未定种mbic11093 ab183664、破囊壶菌科未定种nios1 ay705769、破囊壶菌科未定种#32 dq323161、破囊壶菌科未定种#32 dq356663、破囊壶菌科未定种rt49 dq323167、破囊壶菌科未定种rt49 dq356669、破囊壶菌科未定种rt49、破囊壶菌科未定种thel2 dq323162、破囊壶菌科未定种thel2株的破囊壶菌；
35.‑
破囊壶菌属(thraustochytrium)的破囊壶菌；更优选破囊壶菌未定种、聚合破囊
壶菌(thraustochytrium aggregatum)、金黄色破囊壶菌(thraustochytrium aureum)、thraustochytrium caudivorum、thraustochytrium gaertnerium、金尼破囊壶菌(thraustochytrium kinnei)、动孢破囊壶菌(thraustochytrium motivum)、thraustochytrium multirudimentale、厚皮破囊壶菌(thraustochytrium pachydermum)、粉红破囊壶菌(thraustochytrium roseum)、纹带破囊壶菌(thraustochytrium striatum)、威瑟氏破囊壶菌(thraustochytrium visurgense)种的破囊壶菌；甚至更优选破囊壶菌未定种13a4.1、破囊壶菌未定种atcc 26185、破囊壶菌未定种bl13、破囊壶菌未定种bl14、破囊壶菌未定种bl2、破囊壶菌未定种bl3、破囊壶菌未定种bl4、破囊壶菌未定种bl5、破囊壶菌未定种bl6、破囊壶菌未定种bl7、破囊壶菌未定种bl8、破囊壶菌未定种bl9、破囊壶菌未定种bp3.2.2、破囊壶菌未定种bp3.3.3、破囊壶菌未定种chn
‑
1、破囊壶菌未定种fjn
‑
10、破囊壶菌未定种hk1、破囊壶菌未定种hk10、破囊壶菌未定种hk5、破囊壶菌未定种hk8、破囊壶菌未定种hk8a、破囊壶菌未定种kk17
‑
3、破囊壶菌未定种kl1、破囊壶菌未定种kl2、破囊壶菌未定种kl2a、破囊壶菌未定种onc
‑
t18、破囊壶菌未定种pja10.2、破囊壶菌未定种tr1.4、破囊壶菌未定种trr2、破囊壶菌dq356662、金黄色破囊壶菌dq356666、金尼破囊壶菌dq323165、纹带破囊壶菌atcc24473、纹带破囊壶菌dq323163、纹带破囊壶菌dq356665株的破囊壶菌；以及
36.‑
吾肯氏壶菌属(ulkenia)的破囊壶菌；更优选吾肯氏壶菌未定种、变形吾肯氏壶菌(ulkenia amoeboidea)、深海吾肯氏壶菌(ulkenia profunda)、威瑟氏吾肯氏壶菌(ulkenia visurgensis)种的破囊壶菌；甚至更优选吾肯氏壶菌未定种atcc 28207、变形吾肯氏壶菌sek 214、深海吾肯氏壶菌butrbg 111、威瑟氏吾肯氏壶菌buraaa 141、威瑟氏吾肯氏壶菌atcc 28208株的破囊壶菌。
37.还优选地，根据本发明使用的破囊壶菌选自由如下组成的组的属：橙黄壶菌属和裂殖壶菌属；更优选选自由如下组成的组的种：红树橙黄壶菌和裂殖壶菌未定种；甚至更优选选自由如下组成的组的株：2014年5月20日在ccap(culture collection of algae and protozoa,sams research services ltd.,scottish marine institute,oban,argyl pa37 1qa英国)保藏的红树橙黄壶菌ccap 4062/2，2014年5月20日在ccap保藏的红树橙黄壶菌ccap 4062/3，2014年5月20日在ccap保藏的红树橙黄壶菌ccap 4062/4，2014年5月20日在ccap保藏的红树橙黄壶菌ccap 4062/5，2014年5月20日在ccap保藏的红树橙黄壶菌ccap 4062/6，2013年6月21日在ccap保藏的橙黄壶菌ccap 4062/1，2014年5月20日在ccap保藏的裂殖壶菌未定种ccap 4087/3，2012年2月28日在ccap保藏的裂殖壶菌未定种ccap 4087/1，2014年5月20日在ccap保藏的裂殖壶菌未定种ccap 4087/4，2014年5月20日在ccap保藏的裂殖壶菌未定种ccap 4087/5。在一个优选的实施方案中，根据本发明使用的破囊壶菌是红树橙黄壶菌fcc1325(登记号ccap 4062/5)。
38.根据本发明使用的生物质可以以不同的形式使用。例如，它可以是新鲜生物质的形式(可以通过离心、过滤、倾析和/或本领域技术人员熟知的任何其他技术从培养基中分离)，或者它可以已经经受了一些改变；例如，它可能已经经受了裂解、发酵转化和/或干燥。特别地，干燥可以通过本领域技术人员熟知的任何技术进行，例如喷雾干燥、冻干、流化床、高真空蒸发或流化床造粒。
39.根据本发明使用的破囊壶菌生物质可以直接用作膳食补充剂，或者添加到或结合
到复合饲料/平衡膳食、食品或食品组合物中。在后者情况下，根据本发明使用的破囊壶菌生物质可以与用于人类或动物消费的食品或饲料领域的任何其他添加剂、载体或支持物混合，例如食品防腐剂、染料、风味增强剂或酸碱度调节剂。
40.优选地，根据本发明使用的破囊壶菌生物质是饲料成分(即，意在以1％至60％(w/w)、优选1％至20％(w/w)、更优选3％至8％(w/w)的包含水平掺入到复合饲料中)、饲料添加剂(即，意在以低于1％(w/w)的包含水平掺入到复合饲料中)，或者包含在复合饲料、食品或食品组合物中。
41.根据本发明使用的破囊壶菌生物质可用于动物或人类营养。优选地，它旨在用于动物营养，更优选用于家畜动物或休闲动物饲养。更优选地，它用于家畜饲养(尤其是在特别密集的家畜操作中)。
42.这些饲料通常以粉状、碎末、颗粒或浆料的形式出现，其中可以掺入根据本发明使用的破囊壶菌生物质。对于密集的动物饲养操作，除了破囊壶菌生物质之外，饲料还可以包括营养基础和营养添加剂。因此，动物饲料配给的主要部分通常由“营养基料”和破囊壶菌生物质组成。举例来说，这种基料可以由动物和/或植物来源的谷物、蛋白质和脂肪的混合物组成。动物的营养基料适应于这些动物的饲养，并且为技术人员所熟知。在本发明的上下文中，这些营养基料可以包括例如玉米、小麦、豌豆和大豆。这些营养基料适合它们所针对的各种动物物种的需要。这些营养基料可能已经含有营养添加剂，如维生素、矿物盐和氨基酸。可以添加动物饲料中使用的添加剂来改善饲料的某些特性，例如增强其风味，使饲料的原料对动物更易消化或保护动物。它们经常用于大规模的集约化养殖作业。动物饲料中使用的添加剂可分为：工艺添加剂(如防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、稳定剂、酸度调节剂和青贮饲料添加剂)、感官添加剂(如香料、染料)、营养添加剂(如维生素、氨基酸和微量元素)、动物工艺添加剂(如消化率增强剂、肠道菌群稳定剂)、抗球虫剂和组织抑菌剂(杀虫剂)。
43.更优选地，根据本发明使用的破囊壶菌生物质用于家畜饲养，其中家畜选自由牛、羊、猪、兔、家禽和马组成的组。
44.本发明的所有上述优选特征可以单独考虑或以任何组合考虑。
45.本发明的另一个目的涉及一种维持个体肠道屏障功能的方法，包括向所述个体施用如前所述的破囊壶菌生物质的步骤，并且优选地具有任何上述优先特征，单独或以任何组合考虑。
附图说明
46.图1：孵育48小时后，三种不同形式(新鲜、冻干或消化冻干)的红树橙黄壶菌的生物质对caco
‑
2细胞的ter的影响。
47.图2：孵育72小时后，三种不同形式(新鲜、冻干或消化冻干)的红树橙黄壶菌的生物质对caco
‑
2细胞的ter的影响。
48.图3：
49.上图：16日龄鸡的结肠长度(单位为cm/kg体重(bw))。**p<0.05。
50.下图：结肠粘膜的视面。a：对照组接受基础饮食，不施用dss。b：对照组接受基础饮食，并施用dss。c：实验组接受含5％的红树橙黄壶菌的饮食，并施用dss。
51.图4：口服fitc
‑
葡聚糖1小时后测定的16日龄雏鸡血浆中fitc
‑
葡聚糖浓度(单位
为ng/ml)。**p<0.05。
具体实施方式
52.实施例
53.通过以下实施例非穷尽地说明本发明。这些实施例仅仅是为了说明的目的，而不是为了限制本发明的范围。
54.实施例1：破囊壶菌生物质对caco
‑
2上皮细胞ter的影响
55.材料和方法：
56.caco
‑
2细胞被用作肠上皮细胞的模型。细胞在补充有10％胎牛血清和1％抗生素(链霉素青霉素溶液)的培养基(dmem)中常规生长。细胞在5％co2培养箱中保持在37℃的75cm2通风烧瓶中生长。使用胰蛋白酶
‑
edta溶液对细胞进行常规传代。对于该试验，细胞以200,000个细胞/cm2的初始密度接种到12孔插入式细胞培养器(thincert，greiner，孔径0.4μm)上，并在使用前在接种后分化10
‑
14天，每两天更换培养基。在实验开始时，当ter值达到600ohm/cm2时，使用伏特/欧姆表(millipore)通过读取ter来确认细胞分化。
57.脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)被用于增加通透性，并且测试了各种形式的微藻(红树橙黄壶菌fcc1325)制剂降低don影响的能力：
58.‑
新鲜微藻“mf”(即未经进一步加工的来自发酵罐的培养物)；
59.‑
冻干微藻“ml”(即从发酵罐中离心培养液并冻干沉淀细胞后的微藻生物质)，和
60.‑
消化的冻干微藻“mld”(即在模拟猪肠道的两步体外酶促试验中消化的冻干微藻)。消化方法有两个阶段：在第一阶段，将基于干物质(dm)的150mg冻干微藻称重到12ml试管中，管中含有7ml 0.04m hcl，调节至ph 2。将溶解在软化水中的0.1ml胃蛋白酶(700fip
‑
u/g的猪胃蛋白酶，merck)加入到每个试管中，以达到500u/g以dm为基础的测试微藻的最终活性。试管在37℃下以15转/分钟的速度振荡孵育2小时。在第一个孵育期结束时，通过向消化试管中加入3ml ph 7.2的磷酸盐缓冲液和胰腺溶液进行模拟胰腺消化的第二阶段。在软化水中以100mg/ml制备酶溶液(猪胰酶，品级iv
‑
sigma n
°
p
‑
1750,sigma
‑
aldrich)，并将0.1ml该溶液加入到每个试管中。然后将消化混合物在37℃下以15转/分钟的速度振荡孵育另外4小时。孵育后，将消化后剩余的微藻残渣收集在50μm过滤器上，然后首先用乙醇漂洗5
‑
10分钟，然后用丙酮漂洗5
‑
10分钟。消化的冻干微藻生物质最终在35
‑
40℃( /
‑
2℃)下烘箱干燥72小时。
61.冻干(ml)和消化的冻干(mld)微藻粉末最初以0.8mg/ml重悬于缓冲液(微藻的新鲜培养基)中。
62.分化后，caco
‑
2细胞在48或72小时内接触，有或没有不同浓度(0、6.25、12.5、25、50或100μm)的don，并以1％(w/v)的活化的木炭作为阳性对照，或有或没有不同浓度(1、5或20％v：v，最终稀释)的微藻制剂类型之一，每种制剂添加在顶端侧。在孵育时间结束时，使用伏特/欧姆表(millipore)测量ter，结果以与相同浓度的don接触但不与测试产品(微藻或木炭)接触的对照的百分比表示。每种情况分三次测试(n＝3)。
63.结果：
64.仅向细胞培养基中添加don导致ter降低(对应于增加的通透性)，随着don浓度的增加，这一点更加明显(见图1和图2中的“对照”条件)。木炭能够在所有培养时间和don浓度
下部分阻止don诱导的ter降低。类似地，所有三种测试形式(无论是新鲜培养物还是加工生物质)的微藻也在所有培养时间和don浓度下部分阻止don诱导的ter降低(见图1和2)。
65.半最大抑制浓度(ic50)是一种物质抑制特定生物或生化功能的能力的量度。这种定量测量，通常表示为摩尔浓度，表明需要多少特定物质(抑制剂)才能将给定的生物过程抑制一半。孵育48小时的ic50分析(表1)清楚地证实了微藻防止don对caco
‑
2 ter影响的能力。在浓度为1％和5％时，新鲜和冻干的微藻生物质似乎是最具保护性的(与对照相比，ic50值高3
‑
10倍)，而在浓度为20％时，消化的冻干微藻显示出比新鲜和冻干生物质更好的保护性。
66.表1.孵育48h的ic50
67.条件48h的ic50(μm)对照11μm木炭>100μm新鲜微藻1％57μm新鲜微藻5％51μm新鲜微藻20％>100μm冻干微藻ml 1％>100μm冻干微藻ml 5％52μm冻干微藻ml 20％>100μm消化的冻干微藻mld 1％100μm消化的冻干微藻mld 5％100μm消化的冻干微藻mld 20％39μm
68.培养72小时后，一些微藻显示出比木炭更高的预防效果，并且用20％的微藻获得最有效的预防(图2)。
69.实施例2：破囊壶菌生物质对caco
‑
2上皮细胞吸收营养的影响
70.材料和方法：
71.为了测试微藻减少/防止don对上皮细胞营养吸收的影响的能力，将caco
‑
2细胞暴露于代谢活性剂量的don，在不存在或存在红树橙黄壶菌fcc1325微藻(冻干微藻“ml”，或消化的冻干微藻“mld”)的情况下，剂量为1％或5％。考虑了两种主要类型的营养素(即葡萄糖和氨基酸，尤其是蛋氨酸、赖氨酸和苏氨酸)，并进行了以下测量：
72.‑
对于葡萄糖(d
‑
glc)：被动、主动(由钠依赖性sglt
‑
1转运蛋白调节)和总(主动 被动)吸收
73.‑
对于氨基酸(l
‑
甲硫氨酸、l
‑
赖氨酸和l
‑
苏氨酸)：被动、主动(由钠依赖性转运调节)和总(主动 被动)吸收
74.简言之，如实施例1所述，培养caco
‑
2细胞并接种到12孔插入式细胞培养器上，然后在使用前在接种后分化16
‑
21天，每两天更换培养基。分化时，caco
‑
2细胞在1或5％(v：v最终稀释度，顶部添加)的微藻制剂(ml或mld)不存在或存在的情况下，以10μm(顶部添加)与don一起孵育或不孵育。ml和mld粉末最初都以0.8mg/ml的浓度重新悬浮在缓冲液(微藻的新鲜培养基)中。caco
‑
2细胞被孵育12、24或48小时，然后测量营养吸收。
75.在孵育期结束时，插入式细胞培养器用pbs 洗涤两次。然后用含或不含钠的摄取
缓冲液(ringer hepes缓冲液)洗涤插入式细胞培养器两次。摄取缓冲液组成为：
76.‑
含钠(称为“ na ”)的ringer hepes缓冲液：137mmol/l nacl、5.36mmol/l kcl、0.4mmol/l na2hpo4、0.8mmol/l mgcl2、1.8mmol/l cacl2、20mmol/l n
‑2‑
羟乙基哌嗪
‑
n
‑2‑
乙磺酸(hepes)，用naoh将ph值调至ph 7.4；或者
77.‑
不含钠(称为
“‑
na ”)的ringer hepes缓冲液：137mmol/l氯化胆碱(代替氯化钠)、5.36mmol/l kcl、0.4mmol/l k2hpo4(代替na2hpo4)、0.8mmol/l mgcl2、1.8mmol/l cacl2、20mmol/l n
‑2‑
羟乙基哌嗪
‑
n
‑2‑
乙磺酸(hepes)、用koh将ph值调至ph 7.4。
78.在37℃平衡15分钟后，通过加入在合适的ringer hepes缓冲液(400μl)中稀释的d
‑
glc、l
‑
赖氨酸、l
‑
甲硫氨酸或l
‑
苏氨酸开始摄取试验，并在顶部加入到caco
‑
2插入式细胞培养器上(最终浓度为100μm右旋糖酐和400μm氨基酸)，基底外侧隔室用400μl缓冲液填充。在摄取试验期间，插入式细胞培养器保持在37℃孵育。
79.孵育15分钟后，从顶端或基底外侧隔室收集30μl培养基，并在
‑
20℃下储存，直到营养定量。使用基于酶的定量测定试剂盒(glucose colorimetric/fluorometric assay kit,sigma
‑
aldrich)测量顶端隔室中d
‑
glc或l
‑
氨基酸的残留浓度。
80.摄取量表示为：
81.‑
总摄取：在含na 的ringer hepes缓冲液中测量的摄取(测量的残余顶端浓度或计算的吸收(细胞内 基底外侧)浓度)，对应于钠依赖性和钠非依赖性转运蛋白的活性；
82.‑
被动摄取：在没有na 的ringer hepes缓冲液中测量的摄取仅对应于被动/钠非依赖性转运蛋白；
83.‑
主动摄取：通过总摄取减去被动摄取计算的摄取量。
84.结果：
85.·
在不存在或存在微藻的情况下，暴露于don后d
‑
glc的摄取
86.o 12h孵育
87.在孵育12h时(见表2)，ml和mld抑制了don对总glc摄取(ml 5％和mld 1/5％)、被动摄取(ml 5％和mld 1/5％)和sglt
‑
1活性(所有ml和mld)的影响。
88.表2.用不同微藻制剂处理caco
‑
2细胞12小时后，与未用don处理的细胞相比，don对d
‑
葡萄糖摄取的抑制百分比
[0089][0090]
o 24小时孵育
[0091]
在24小时孵育时，ml和mld逆转/预防don介导的对总、被动和主动d
‑
glc摄取的抑制(见表3)。
[0092]
表3.用不同微藻制剂处理caco
‑
2细胞24小时后，与未用don处理的细胞相比，don对d
‑
葡萄糖摄取的抑制百分比
[0093]
[0094][0095]
o 48h孵育
[0096]
在48小时孵育时，与24小时孵育类似，ml和mld逆转/预防don介导的对总、被动和主动d
‑
glc摄取的抑制。
[0097]
表4.用不同微藻制剂处理caco
‑
2细胞48小时后，与未用don处理的细胞相比，don对d
‑
葡萄糖摄取的抑制百分比
[0098][0099]
·
在不存在或存在微藻的情况下，暴露于don后l
‑
氨基酸的摄取
[0100]
o 12h孵育
[0101]
ml和mld不能预防don对总或被动l
‑
赖氨酸吸收的影响，但是ml 1％和mld 1％能够阻止don对l
‑
lys主动摄取的抑制(表5)。
[0102]
表5.用不同微藻制剂处理caco
‑
2细胞12小时后，与未用don处理的细胞相比，don对l
‑
赖氨酸摄取的抑制百分比
[0103][0104]
与受don抑制的l
‑
lys和l
‑
thr相反，don会刺激l
‑
met主动摄取。ml和mld能够限制由don刺激的l
‑
met摄取(表6)。
[0105]
表6.用不同微藻制剂处理caco
‑
2细胞12小时后，与未用don处理的细胞相比，don对l
‑
甲硫氨酸摄取的抑制百分比
[0106][0107][0108]
ml能够限制don对l
‑
thr主动摄取的抑制，但mld不能(表7)。
[0109]
表7.用不同微藻制剂处理caco
‑
2细胞12小时后，与未用don处理的细胞相比，don对l
‑
苏氨酸摄取的抑制百分比
[0110][0111]
o 24h孵育
[0112]
表8显示ml 1％(但不是其他形式的微藻)能够逆转don对活性l
‑
lys摄取的影响。
[0113]
表9显示ml和mld都预防了don对l
‑
met主动转运的影响。
[0114]
表10显示，5％的ml和mld可阻止don对l
‑
thr活性摄取的抑制。
[0115]
表8.用不同微藻制剂处理caco
‑
2细胞24小时后，与未用don处理的细胞相比，don对l
‑
赖氨酸摄取的抑制百分比
[0116][0117]
表9.用不同微藻制剂处理caco
‑
2细胞24小时后，与未用don处理的细胞相比，don对l
‑
甲硫氨酸摄取的抑制百分比
[0118]
[0119][0120]
表10.用不同微藻制剂处理caco
‑
2细胞24小时后，与未用don处理的细胞相比，don对l
‑
苏氨酸摄取的抑制百分比
[0121][0122]
o 48h孵育
[0123]
在孵育48小时时，don刺激了活性l
‑
lys摄取。这种效应被ml预防，但不被mld预防(表11)。在孵育48小时时，don刺激了活性l
‑
met摄取。这种效应被ml和mld 5％预防，但不被mld 1％预防(表12)。
[0124]
表11.用不同微藻制剂处理caco
‑
2细胞48小时后，与未用don处理的细胞相比，don对l
‑
赖氨酸摄取的抑制百分比
[0125]
[0126][0127]
表12.用不同微藻制剂处理caco
‑
2细胞48小时后，与未用don处理的细胞相比，don对l
‑
甲硫氨酸摄取的抑制百分比
[0128][0129]
表13显示ml和mld都部分预防了don对活性l
‑
thr摄取的抑制。
[0130]
表13.用不同微藻制剂处理caco
‑
2细胞48小时后，与未用don处理的细胞相比，don
对l
‑
苏氨酸摄取的抑制百分比
[0131][0132]
结论：
[0133]
要考虑的最重要的摄取是总摄取(以便对营养摄取能力有一个全面的了解)和主动摄取(以便评估抗腹泻营养摄取活性)。总的来说，结果与以前发表的用放射性营养物和ht
‑
29
‑
d4细胞获得的结果一致，证实了10μm的don会改变肠道营养物的摄取。这些初步观察表明，经过或未经预消化的冻干微藻能够部分逆转/预防don介导的对葡萄糖、赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸的总、被动和主动摄取的影响。
[0134]
实施例3：破囊壶菌生物质对肉鸡结肠组织形态和肠道通透性的影响
[0135]
材料和方法：
[0136]
·
实验动物：从当地孵化场获得孵化日雄性ross308肉鸡，放置在地板围栏中直到6日龄，并提供热量以保持适合年龄的温度。在1至16日龄的起始期，为雏鸡不限制地提供了水和平衡的实验饮食，满足了ross308肉鸡推荐的家禽营养要求。
[0137]
·
实验饮食：以小麦、玉米和豆粕为基础，配制了短颗粒形式的基础起始饮食(con)(表14)。通过替换部分谷物、蛋白质或油含量，将其它实验饮食配制成含5％微藻红树橙黄壶菌(mag
‑
5)或2％姜黄素(cum
‑
2)。这3种饮食被配制成等能量(isoenergetic)和同功蛋白(isoprotein)(表15)。
[0138]
表14.实验饮食的成分组成
[0139][0140]
表15.实验饮食的营养成分
[0141]
[0142][0143]
·
葡聚糖硫酸钠(dss)施用：使用dss通过诱导上皮损伤来增加肉鸡的肠道通透性。dss(mw 40kda，alfa aesar，ward hill，ma)在第10天至第15天在饮用水中以0.75％(wt/vol)的浓度给药。在第15天结束时，向所有组提供不含dss的淡水，直到第16天最终采集样本。每日以淡水制备dss溶液，并通过与每个笼子的饮用系统直接相连的单瓶水进行分配。在填充新的dss溶液之前和之后，对每个瓶子进行称重，以测量每个笼子的每日dss消耗量。对照组动物从第1天到第16天随意接受正常饮用水。
[0144]
·
结肠长度和肠道通透性的实验设计和测量：在6日龄时，将总共144只肉仔鸡随机分成4组，每组12个笼(3只鸡/笼)：1个对照组给予对照起始饮食，3个组接受dss并分别饲喂3种实验饮食(对照起始饮食、微藻饮食和姜黄素饮食
‑
见表14)。在第16天(dss的第5天)，通过在水中以8mg/kg口服灌胃给鸡服用2ml fitc
‑
葡聚糖(mw 4000；sigma aldrich co.,st.louis,mo)以检测肠漏。口服灌胃后1小时，每种条件下的24只禽(2只禽/笼)被人道地吸入co2杀死并放血收集血浆。取样后，将血液置于冰冻的edta试管中，离心(2000
×
g，15分钟)分离血浆。在485nm的激发波长和528nm的发射波长下测量稀释血浆(1∶4在0.9％氯化钠的盐水溶液中)的荧光水平(biotek synergie h1)，并基于标准曲线计算每ml血浆的fitc
‑
葡聚糖浓度。
[0145]
在安乐死时，收集结肠用于形态测量。简而言之，将每只禽从近端食道到泄殖腔的消化道小心地从体腔中取出。然后切除结肠(从回盲部到泄殖腔)并测量其长度。
[0146]
结果：
[0147]
·
消化道测量(结肠长度)：结肠长度在16日龄安乐死后直接测量，并报告个体体重。这些结果以及结肠粘膜的肉眼观察如图3所示。与未接受dss的对照组(“dss
‑“
)相比，在饮用水中添加2％的dss显著增加了接受dss的对照禽(“dss ”)的结肠长度，这可能是由于dss施用导致肠道吸收和分泌功能丧失的部分补偿作用。在对照饮食中添加5％的红树橙黄壶菌诱导结肠长度减少至与喂食对照饮食且未接受dss的动物没有显著差异的水平(比较图3中的“微藻”和“dss
‑”
，顶部)。这种观察可能与结肠粘膜的肉眼观察相关(图3，底部)。在饮用水中添加dss影响了结肠粘膜，与dss对照组相比，结肠粘膜变得更薄、半透明和更脆弱(b vs a，图3，底部)。与没有dss的对照禽相比，接受dss和补充了红树橙黄壶菌的对照饮食的禽没有显示结肠粘膜的任何肉眼可见的改变(c vs a，图3，底部)。
[0148]
·
肠道通透性：安乐死后1小时，通过血液分析测量荧光标记物(fitc
‑
葡聚糖)通过上皮的流量，评估dss对肠道屏障完整性的影响(图4)。dss的施用显著增加了fitc
‑
葡聚糖通过肠屏障的流量，口服灌胃1h后血液中fitc
‑
葡聚糖浓度的升高就说明了这一点。因此，肠道上皮的完整性被dss的施用所损害。在实验饮食中添加5％的微藻导致肉鸡血浆中fitc
‑
葡聚糖浓度降低至非常接近在非dss处理的禽类血浆中测得的fitc
‑
葡聚糖水平(12.15vs 12.65ng/ml)(图4)。结果表明，在给予基于微藻的饮食的鸡的情况下，屏障完整性得以保持，并且通过微藻预防了由dss处理引起的上皮不通透性的损失。