小米米糠活性多酚在制备预防和治疗动脉粥样硬化产品中的应用的制作方法

1.本发明涉及功能食品、医药领域，特别涉及小米米糠活性多酚的新用途，具体属于小米米糠活性多酚在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化功能食品或药品中的应用。


背景技术：

2.谷子(学名：setaria italica)属一年禾本科黍族狗尾草属，起源于我国的黄河流域，是华北地区的主要特产之一。谷子脱壳后即为小米，其脱下的壳就是小米米糠。《黄帝内经》记载：谷糠昧甘、性平、偏于补气，具有益气健脾、养血安神、补肾健脑等医药功效。小米米糠中含有丰富的营养成分和有益成分，小米米糠活性多酚类化合物是一种含量丰富、绿色环保、无毒副作用的可再生绿色资源，且研究发现谷子中酚酸类化合物主要富集于小米米糠之中，开发前景广阔。
3.动脉粥样硬化(atherosclerosis,as)是引起心血管疾病最主要的原因，而全球每年死于心血管疾病人数居于各种死因首位。胆固醇代谢异常、主动脉平滑肌细胞(hasmc)迁移和吞噬脂质；单核巨噬细胞(thp
‑
1)吞噬脂质等是动脉粥样硬化形成过程中重要因素。目前对于治疗动脉粥样硬化以他汀类药品为主，副作用较多，所以对于抗动脉粥样硬化的研究就显得十分重要。
4.国内外研究发现，许多植物多酚具有抗氧化、消炎、降血脂等功能。而不同种类的植物多酚其组分差异较大，功效也各不相同。目前国内外关于小米米糠中多酚抗动脉粥样硬化的研究尚未报道，因此，本发明以北方地区一种小米米糠为材料，通过优化制备工艺获得一种活性多酚，该活性多酚可有效抑制动脉粥样硬化发生进展。因此，本发明为小米米糠赋予了新的开发和利用价值，应用于抗动脉粥样硬化药品、功能食品的开发。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供小米米糠活性多酚的新用途，即提供一种小米米糠活性多酚在制备预防和治疗动脉粥样硬化产品中的应用。
6.本发明提供的小米米糠活性多酚在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化功能食品或药品中的应用，所述的小米米糠活性多酚的制备方法包括以下步骤：
7.第一步：按体积比1:3
‑
5取蒸馏水和丙酮配制丙酮溶液，并预冷备用；
8.第二步：将小米米糠粉碎，按每100g小米米糠加入1000
‑
2000ml预冷的丙酮溶液，4℃下均匀搅拌60
‑
120min；
9.第三步：搅拌后离心，取上清液保存于4℃，取沉淀加入1000
‑
2000ml预冷的丙酮溶液，4℃下均匀搅拌60
‑
120min；
10.第四步：搅拌后离心，取上清弃沉淀；
11.第五步：将第三步和第四步中两次获得的上清液混合，在55
‑
65℃下旋转蒸发直至除净丙酮，得到提取液；回收旋转蒸发的丙酮重复利用；
12.第六步：将提取液先用0.45微米孔径水性滤膜抽滤，再用0.22微米孔径水性滤膜抽滤，除去杂质；
13.第七步：将除杂后的提取液真空冷冻干燥成粉末，使用ab
‑
8大孔树脂柱材料对该冻干粉进行分离；冻干粉与柱材料质量比为1：20
‑
50吸附于ab
‑
8大孔树脂；使用10％，20％，30％和40％的乙醇对吸附的多酚进行梯度洗脱，取40％乙醇洗脱组分旋转蒸发除去乙醇后真空冷冻干燥成粉末即得小米米糠活性多酚样品(msp)，于
‑
20℃保存。
14.实验证明，所述的小米米糠活性多酚能显著抑制主动脉平滑肌细胞(hasmc)的迁移能力，能显著抑制主动脉平滑肌细胞(hasmc)和单核巨噬细胞(thp
‑
1)吞噬脂质，可以抑制体内动脉粥样硬化斑块的形成。因此，所述的小米米糠活性多酚可在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化功能食品或药品中应用。
15.所述的功能食品或药品可由以下方法制备而成：将得到的小米米糠活性多酚添加防腐剂、香味剂、着色剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、粘合剂、调味剂、抑菌剂中的一种或多种辅料制备成注射液、肠溶片剂、颗粒剂、丸剂、合剂、散剂、注射用冻干粉针剂、糖浆剂或胶囊剂的功能食品或药品。
16.与现有技术相比本发明的有益效果：本发明所述小米米糠活性多酚可以显著抑制人主动脉平滑肌细胞的迁移能力，可以显著抑制人主动脉平滑肌细胞和人单核巨噬细胞吞噬脂质的能力，可以抑制体内动脉粥样硬化斑块的形成，进而预防和治疗动脉粥样硬化。所述小米米糠活性多酚可在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化功能食品或药品中应用。
附图说明
17.图1小米米糠活性多酚(msp)粉末；
18.图2小米米糠活性多酚(msp)可以显著抑制主动脉平滑肌细胞(hasmc)迁移；
19.图3小米米糠活性多酚(msp)可以有效抑制主动脉平滑肌细胞(hasmc)吞噬脂质；
20.图4小米米糠活性多酚(msp)可以有效抑制单核巨噬细胞(thp
‑
1)吞噬脂质；
21.图5小米米糠活性多酚(msp)可以有效抑制体内主动脉的动脉粥样硬化斑块形成；
22.图6小米米糠活性多酚(msp)可以有效抑制体内主动脉窦的动脉粥样硬化斑块形成。
具体实施方式
23.实施例1：小米米糠活性多酚的制备方法
24.(1)按体积比取800ml蒸馏水和3200ml丙酮配制成80％丙酮溶液，在
‑
40℃预冷12小时；
25.(2)将小米米糠粉碎，取小米米糠粉末100g，加入预冷的80％丙酮2000ml，4℃下均匀搅拌120min；
26.(3)充分搅拌后，在4℃，11000rpm/min条件下将混合物离心10min，取上清液保存于4℃，取沉淀加入预冷的80％丙酮2000ml，4℃下均匀搅拌120min；
27.(4)充分搅拌后，在4℃，11000rpm/min条件下将混合物离心10min，取上清弃沉淀；
28.(5)将(3)和(4)中两次获得的上清液混合，在60℃下旋转蒸发直至除净丙酮，得到提取液；回收旋转蒸发的丙酮重复利用；
29.(6)将提取液先用0.45微米孔径水性滤膜抽滤，再用0.22微米孔径水性滤膜抽滤，除去杂质；
30.(7)将除杂后的提取液真空冷冻干燥成粉末，使用ab
‑
8大孔树脂柱材料对该冻干粉进行分离；冻干粉与柱材料质量比为1：20吸附于ab
‑
8大孔树脂；使用10％，20％，30％和40％的乙醇对吸附的多酚进行梯度洗脱，取40％乙醇洗脱组分旋蒸除去乙醇后真空冷冻干燥成粉末即得小米米糠活性多酚样品，于
‑
20℃保存。如图1所示即为小米米糠活性多酚样品(msp)。
31.实施例2：小米米糠活性多酚对主动脉平滑肌细胞迁移的影响
32.取对数生长期的主动脉平滑肌细胞调整细胞密度接种于24孔铺有灭菌枪头圈的细胞培养板中，枪头圈中细胞密度达95％以上的单层细胞后，用无菌镊子将培养板内枪头圈取走，用已灭菌的20μl枪头在单层细胞圈中均匀划痕，吸去旧培养基，pbs洗三次，每孔加入500μl含2％血清和10
‑6mol/l血管紧张素ⅱ(angⅱ)的新培养基，用相同终浓度(0.15mg/ml)的10％、20％、30％、40％的多酚组分处理24h，用倒置显微镜分别于0h、24h对划痕距离拍照，观察细胞迁移情况。细胞迁移率＝(0h加药组划痕距离
‑
24h加药组划痕距离)/(0h对照组划痕距离
‑
24h对照组划痕距离)
33.结果表明：与对照组相比，40％乙醇洗脱的小米米糠活性多酚可以极显著地抑制主动脉平滑肌细胞的迁移，(如图2所示)。
34.实施例3：小米米糠活性多酚对主动脉平滑肌细胞(hasmc)吞噬脂质的影响
35.将盖玻片酸泡过夜，蒸馏水冲洗干净，浸泡于70％酒精中，使用时将盖玻片上酒精烧干，铺于24孔板中，将用无血清培养基稀释好的浓度为20000/ml的主动脉平滑肌细胞(hasmc)铺于24孔板中，培养24h。待处理完成后主动脉平滑肌细胞(hasmc)弃掉无血清培养基，分别加入1ml含10
‑6mol/l angⅱ完全培养基。然后加入小米米糠活性多酚(msp)，终浓度为0.1mg/ml、0.15mg/ml，处理24h。吸掉培养基，用37℃预热的pbs(ph＝7.4)清洗2次，每孔加入500μl oro fixative固定液固定30min，弃去固定液，用蒸馏水清洗2次，加入60％异丙醇浸洗5min，然后弃去60％异丙醇后加入新配制好的oro stain，浸染20min，弃去染色液，水洗5次，直至无多余染液后，加入mayer苏木素染色液，复染核2min。弃去染液后水洗5次，加入oro buffer 1min后弃去，封片后于倒置显微镜下观察主动脉平滑肌细胞(hasmc)的吞噬脂质情况。
36.结果表明：和对照组相比，小米米糠活性多酚(msp)可以有效抑制主动脉平滑肌细胞(hasmc)吞噬脂质的能力(如图3所示msp组红色脂滴面积显著减少)。
37.实施例4：小米米糠活性多酚对单核巨噬细胞(thp
‑
1)吞噬脂质的影响
38.将盖玻片酸泡过夜，蒸馏水冲洗干净，浸泡于70％酒精中，使用时将盖玻片上酒精烧干，铺于24孔板中，用含100μm pma的终浓度为20000/ml的单核巨噬细胞(thp
‑
1)分别铺于24孔板中，培养24h。待处理完成后单核巨噬细胞(thp
‑
1)换为正常完全培养基。然后加入小米米糠活性多酚(msp)，终浓度为0.1mg/ml、0.15mg/ml，处理24h。吸掉培养基，用37℃预热的pbs(ph＝7.4)清洗2次，每孔加入500μl oro fixative固定液固定30min，弃去固定液，用蒸馏水清洗2次，加入60％异丙醇浸洗5min，然后弃去60％异丙醇后加入新配制好的oro stain，浸染20min，弃去染色液，水洗5次，直至无多余染液后，加入mayer苏木素染色液，复染核2min。弃去染液后水洗5次，加入oro buffer 1min后弃去，封片后于倒置显微镜下观察
单核巨噬细胞(thp
‑
1)的吞噬脂质情况。
39.结果表明：和对照组相比，小米米糠活性多酚可以有效抑制单核巨噬细胞(thp
‑
1)吞噬脂质的能力(如图4所示msp组红色脂滴面积显著减少)。
40.实施例5：小米米糠活性多酚(msp)可以有效抑制体内动脉粥样硬化斑块形成
41.1、小鼠名称：apoe
‑
/
‑
小鼠(载脂蛋白e基因敲除小鼠)；
42.2、级别：spf级；
43.3、性别：雄性；
44.4、年龄：5周龄；
45.5、喂养时间：17周；
46.6、饲养条件：温度：20
‑
25℃，相对湿度：50
‑
55％，室内灯光模拟昼夜，12小时明暗循环，
47.7、饲料：除正常对照组外均为高脂饲料喂养，
48.正常对照组为普通维持饲料喂养。
49.8、实验动物分组及给药：
[0050][0051]
9、麻醉处死小鼠后，先用生理盐水冲洗血液，然后pbs灌注，找到小鼠主动脉，剥离干净周围组织，而后从主动脉弓分离至髂动脉。在体视显微镜下纵向剖开动脉，4％甲醛固定48h，油红o染色60min，75％酒精分化至官腔内脂肪斑块呈橘红色或鲜红色，其他部位近无色，然后蒸馏水洗两次，拍照。
[0052]
取心脏于4％甲醛中固定，然后进行冰冻切片染色，在距离三尖瓣100μm的地方开始采集切片，10μm/张，而后进行油红o染色。
[0053]
结果表明：模型组和对照组相比，主动脉和主动脉窦中的脂质斑块明显增加，说明造模成功；而且小米米糠活性多酚(msp)可以有效抑制主动脉和主动脉窦中动脉粥样硬化斑块形成(如图5、图6所示msp处理组红色病变斑块面积显著减少)。