一种利用水平基因组转移创制烟草种间异源多倍体新种质的方法与流程

技术特征：
1.一种利用水平基因组转移创制烟草种间异源多倍体新种质的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：(1)无菌苗培育：在组培室中将红花烟草种子和黄花烟草种子预处理后分别播种于含固体培养基的培养皿中，培养两周后将生长至小十字期的幼苗移植至含有固体培养基的培养瓶中，把培养瓶放入组培室中每天光照培养16小时，每天黑暗培养8小时，待红花烟草植株和黄花烟草幼苗植株生长至株高5
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10cm后作为嫁接亲本；(2)离体嫁接：将步骤(1)中得到的嫁接亲本进行交互嫁接得到嫁接体，将得到的嫁接体置于ms培养基中培养2
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4周至嫁接结合部位融合完好，得到结合部位具有维管组织的接穗植株，所述接穗植株可正常生长；(3)嫁接结合部位愈伤诱导：切下步骤(2)中得到的接穗植株上的嫁接结合部位，用刀片将嫁接紧密结合部位横切成多块薄片，将每块薄片分别平放于含有愈伤固体培养基的培养瓶中培养25d，进行愈伤组织诱导，得到多块愈伤组织块；(4)不定芽诱导和生根培养：将步骤(3)中得到的多块愈伤组织块分别转移至含ms培养基的培养瓶中诱导愈伤组织块产生不定芽，将形成的不定芽分别移植至含固体培养基的培养瓶中进行培养，得到再生植株；重复上述步骤，直至不再产生不定芽；(5)再生植株移栽：用蒸馏水将步骤(4)中得到的再生植株的根部培养基冲洗干净，移栽至装有灭菌基质的营养钵中炼苗，炼苗25
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30天后移栽至温室的花盆中，按常规烟草进行管理栽培，得到再生植株；(6)再生植株的表型筛选：将步骤(5)中得到的再生植株进行表型筛选，筛选出具有种间异源多倍体特性的植株；(7)倍性鉴定：鉴定步骤(6)中得到的具有种间异源多倍体特性植株的倍性，筛选多倍体，即得到多株烟草种间异源多倍体新种质植株。2.根据权利要求1所述的一种利用水平基因组转移创制烟草种间异源多倍体新种质的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的预处理为用次氯酸钠溶液进行消毒预处理后用无菌水清洗3次；所述光照培养的光照强度为50μem
‑2s
‑1，光照培养的温度为24℃，所述黑暗培养的温度为22℃。3.根据权利要求1所述的一种利用水平基因组转移创制烟草种间异源多倍体新种质的方法，其特征在于：所述步骤(1)和步骤(4)中的固体培养基的组成为：4.74g/l ms、30g/l蔗糖、6g/l琼脂和蒸馏水，固体培养基的ph为5.8。4.根据权利要求1所述的一种利用水平基因组转移创制烟草种间异源多倍体新种质的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的愈伤固体培养基的组成为：4.74g/l ms、5mg/l kt、0.2mg/l naa、30g/l蔗糖、6g/l琼脂，愈伤固体培养基的ph为5.8。5.根据权利要求1所述的一种利用水平基因组转移创制烟草种间异源多倍体新种质的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的交互嫁接方法为：选取红花烟草幼苗植株作为接穗植株，留取接穗植株顶上的2片小叶，去除其余叶片，将接穗植株沿茎两侧对称斜切45
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后成楔形状接口；选取黄花烟草幼苗植株作为砧木植株，留取砧木植株根系以上3cm的茎段，其余剪去，用双面刀片从留取的茎中部劈开与接穗植株楔形状接口相配合的接口；将接穗植株楔形端插入砧木植株接口，用塑料套管将接口进行固定完成交互嫁接。6.根据权利要求1所述的一种利用水平基因组转移创制烟草种间异源多倍体新种质的
方法，其特征在于：所述步骤(2)中的交互嫁接方法为：选取黄花烟草幼苗植株作为接穗植株，留取接穗植株顶上的2片小叶，去除其余叶片，将接穗植株沿茎两侧对称斜切约45
°
后成楔形状接口；选取红花烟草幼苗植株作为砧木植株，留取砧木植株根系以上3cm的茎段，其余剪去，用双面刀片从留取的茎中部劈开与接穗植株楔形状接口相配合的接口；将接穗植株楔形端插入砧木植株接口，用塑料套管将接口进行固定完成交互嫁接。7.根据权利要求1所述的一种利用水平基因组转移创制烟草种间异源多倍体新种质的方法，其特征在于：所述嫁接紧密结合部位切成的薄片厚度为1
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2mm。

技术总结
本发明公开了一种利用水平基因组转移创制烟草种间异源多倍体新种质的方法，属于烟草的多倍体育种技术领域，包括无菌苗培育、离体嫁接、嫁接结合部位愈伤诱导、不定芽诱导和生根培养、再生植株移栽、再生植株表型筛选鉴定和倍性鉴定等步骤。本发明采用红花栽培烟草与黄花烟草作为嫁接亲本材料，利用试管离体嫁接技术实现烟草基因组水平转移；利用人工组织培养技术，实现两个嫁接亲本的嫁接接合愈伤组织诱导及无性株系再生，克服了两种近缘烟草种间有性育种障碍，并形成可育的烟草异源多倍体植株。株。


技术研发人员：张光海 陈学军 李永平 高玉龙 焦芳婵 吴兴富 冯智宇 许美玲 孔光辉 吴玉萍 姚恒 赵高坤 李薇
受保护的技术使用者：云南省烟草农业科学研究院
技术研发日：2021.07.16
技术公布日：2021/10/15