高三尖杉酯碱在制备抗卵巢癌药物中的应用的制作方法

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及高三尖杉酯碱在制备抗卵巢癌药物中的应用。


背景技术：

2.全球肿瘤数据表明，宫颈癌是全世界妇女最常见的肿瘤之一，发病率仅次于乳腺癌、肺癌、直肠癌，位居女性肿瘤性疾病的第四位。全球每年约新增加50万例临床确诊的宫颈癌病例，其中大部分发生在发展中国家。我国每年新增宫颈癌患者约13万，每年约有5万人死于宫颈癌。近年来我国宫颈癌的发病率明显上升，且发病年龄逐渐年轻化，呈双峰状分布，即35至39岁和60至69岁。2020年10月美国国立综合癌症网络(nccn)公布的“2021子宫颈癌临床实践指南(第1版)”指出，figo子宫颈癌手术分期中i期和iia期患者，均可以采用手术治疗。对于ⅱb期及以上的晚期病例、局部晚期或不能耐受手术者以及根治性子宫切除术后的辅助治疗方法的最佳治疗方法是放疗。对于无法接受手术或者放射治疗的复发患者，推荐的一线单药方案为顺铂、卡铂或紫杉醇。我国现有的化疗方案中有70％～80％以铂为主或有铂类药物参加配伍。
3.目前国内常用的铂类抗肿瘤药物共有五种(顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、洛铂)。顺铂作为第一代铂类抗肿瘤药物，缺乏对肿瘤组织的选择性，副作用严重。第二代铂类药物中的卡铂，虽然化学稳定性好，水溶性是顺铂的17倍，但是与顺铂具有相同的载体基团，对顺铂产生耐药性的患者，再用卡铂时效果也不佳。另一个第二代铂类药物奈达铂，肾毒性较顺铂和卡铂低。第三代铂类药物中的奥沙利铂，虽然避开了顺铂的某些耐药机制(如错配修复缺陷和旁路复制机制)，但并未完全解决铂类耐药的问题。第三代铂类药物中的洛铂，其作用机制除影响dna的合成、复制以外，还可以影响原肿瘤基因c
‑
myc的表达，亦没有改善铂类耐药的问题。由于肿瘤对顺铂耐药的分子机制十分复杂，因此理清并寻找肿瘤对顺铂耐药关键的分子机制显得尤为重要。
4.高三尖杉酯碱(homoharringtonine，hht)系从粗榧属植物的总生物碱中分离出的一种生物碱，是我国研制成功的高效抗肿瘤药。临床证明对急性粒细胞白血病、急性单核细胞白血病、红系白血病等各种急性非淋巴性白血病及慢性粒细胞白血病均有较好疗效，但其具有极强的细胞毒性，亦可导致心脏毒性及骨髓抑制，限制了化疗剂量的增加。
5.癌症免疫治疗主要是增强免疫系统识别、靶向和消除肿瘤细胞的能力。当病原体入侵和细胞发生恶性转化时，机体启动免疫应答和免疫监视，编码人类白细胞抗原(hla)的基因复合体在免疫应答及免疫监视中发挥关键作用。虽然经典hla
‑
i类基因(hla
‑
a、
‑
b、
‑
c位点)在肿瘤的发生过程中起重要作用。但是非经典hla
‑
i类基因(功能性基因mica/b及假基因micc
‑
micg)在肿瘤免疫应答及监视中的作用也不能忽视。作为非经典hla
‑
i类基因，mica基因与经典hla
‑
i类基因有高度同源性，是自然杀伤细胞受体nkg2d蛋白的配体。生理状态下，mica蛋白广泛表达于人上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及胃肠道上皮、胸腺髓质等细胞和组织中，但细胞表面并不能检测到该蛋白的表达。当在dna损伤、病毒感染、热休
克反应及肿瘤等病理状态下，mica表达明显上调，在细胞表面高表达。机体通过mica
‑
nkg2d等固有免疫信号通路，调节自然杀伤细胞(nk细胞)、cd8

t细胞杀伤活性，影响个体清除病毒感染细胞、恶变细胞的能力。当肿瘤发生时，在二硫键异构酶和金属蛋白酶协同作用下，肿瘤细胞表面的mica分子脱落，使nk细胞无法识别肿瘤细胞，产生肿瘤免疫逃逸作用，加速肿瘤进展风险。因此，增加肿瘤细胞表面mica蛋白表达，使mica蛋白与自然杀伤细胞nkg2d受体结合，激活nk细胞介导的细胞毒性，提供cd8

t细胞和αβt细胞的共刺激信号，裂解肿瘤细胞，逆转肿瘤免疫逃逸。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供高三尖杉酯碱在制备抗卵巢癌药物中的应用。
7.本发明发现，高三尖杉酯碱可以激活宫颈癌细胞表面主要组织相容性复合体i类相关链a(mica)，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，增加自然杀伤细胞对肿瘤的识别能力。
8.因此，本发明提供高三尖杉酯碱在制备抗卵巢癌药物中的应用。
9.优选，所述的抗卵巢癌药物为具有如下(1)
‑
(5)中至少一种功能的药物：
10.(1)抑制卵巢癌细胞增殖；
11.(2)促进卵巢癌细胞凋亡；
12.(3)抑制卵巢癌细胞集落形成；
13.(4)上调表达卵巢癌细胞主要组织相容性复合体i类相关链a(mica)；
14.(5)增强自身免疫细胞对卵巢癌细胞的杀伤能力。
15.优选，所述的卵巢癌细胞为卵巢癌耐药细胞。
16.优选，所述的卵巢癌耐药细胞为卵巢癌顺铂耐药细胞。
17.一种抗卵巢癌药物，其含有有效量的作为活性成分的高三尖杉酯碱和药学上可接受的载体。
18.自然杀伤(nk)细胞是一种先天性淋巴细胞，至少具有两种功能，分别是细胞毒性和分泌细胞因子，这对于细胞内病原体防御和肿瘤免疫监视具有重要的作用。本发明从分子、细胞方面均证实，高三尖杉酯碱能直接激活肿瘤细胞表面mhc
‑
i类分子相关蛋白a(mica)表达，增加自身免疫细胞(nk细胞)对肿瘤耐药细胞株的杀伤能力，抑制肿瘤细胞生长。本发明实验证据均表明高三尖杉酯碱具有巨大抗卵巢癌的潜力，具有良好的开发前景。
附图说明
19.图1为高三尖杉酯碱抑制卵巢癌顺铂耐药细胞株增殖；
20.图2为高三尖杉酯碱促进卵巢癌顺铂耐药细胞株凋亡；
21.图3为高三尖杉酯碱能抑制卵巢癌顺铂耐药细胞株集落形成；
22.图4为高三尖杉酯碱通过akt通路上调卵巢癌顺铂耐药细胞株mica；
23.图5为高三尖杉酯碱增强nk
‑
92细胞对卵巢癌顺铂耐药细胞株的杀伤能力。
具体实施方式
24.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
25.实施例1
26.1、高三尖杉酯碱抑制卵巢癌顺铂耐药细胞株增殖
27.我们将高三尖杉酯碱(购自sigma
‑
aldrich公司，cas登记号：26833
‑
87
‑
4)用二甲基亚砜(dmso，购自sigma
‑
aldrich公司)配成的100mm的原液，细胞实验使用之前用pbs稀释至所需浓度。
28.将处于对数生长期的卵巢癌顺铂耐药细胞株c13*(购自中国非典型培养物保藏中心，网址：http://cctcc.whu.edu.cn/portal/index/index，下同)，以1000
‑
2000细胞/孔的密度接种于96孔板中，24小时后更换为含有不同浓度(10μm、0.5μm、0.25μm、0.125μm、0.063μm、0.031μm、0.015μm、0.008μm、0μm)高三尖杉酯碱的完全培养基处理细胞72小时，用cck
‑
8法(日本同仁化学研究所)，检测细胞增殖情况，检测方法参见《医学免疫学实验技术》(苏州大学出版社，出版日期：2011年2月)。我们发现，高三尖杉酯碱抑制卵巢癌顺铂耐药细胞株c13*增殖，其ic50值是1.073
±
0.0304μm(图1)。
29.2、高三尖杉酯碱促进卵巢癌顺铂耐药细胞株凋亡
30.将处于对数生长期的卵巢癌顺铂耐药细胞株c13*，用高三尖杉酯碱(0μm、0.1μm、1μm、10μm)处理卵巢癌顺铂耐药细胞株c13*24小时，用pbs洗涤细胞二次(2000rpm离心5min)。收集5xl05细胞：加入500μl的结合缓冲液悬浮细胞；加入500μl annexin v
‑
fitc混匀后，加入5μl propidium iodide，混匀；室温、避光、反应10分钟；用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，激发波长ex＝488nm；发射波长em＝530mn。annexin v
‑
fitc的绿色荧光通过fitc通道(fl1)检测；pi红色荧光通过pi通道(fl3)检测。加入2μg/ml的pi与培养基共浴1h后，用倒置荧光显微镜观察细胞膜损伤之后pi的吸收能力。用甲醇和丙酮(1:1)处理细胞5min，用pbs清洗3次，pi染色，流式细胞仪检测细胞周期情况。发现，高三尖杉酯碱能促进卵巢癌顺铂耐药细胞株凋亡(图2)。
31.3、高三尖杉酯碱能抑制卵巢癌顺铂耐药细胞株集落形成
32.我们取对数生长期的卵巢癌顺铂耐药细胞株c13*细胞接种于6孔板中(约1000个/孔)，培养24h后分别加入0μm、0.1μm、1μm、10μm高三尖杉酯碱，处理24h后撤掉高三尖杉酯碱，在完全培养基中培养10天。弃去培养基，用pbs洗两次后使用甲醇将细胞集落固定20min，固定后吸弃甲醇，使用0.2％的结晶紫染色30min，用pbs洗去残余染色液后，拍照分析。我们发现高三尖杉酯碱能抑制卵巢癌顺铂耐药细胞株集落形成(图3)。
33.4、高三尖杉酯碱通过akt通路上调卵巢癌顺铂耐药细胞株mica
34.4.1细胞样本的处理：
35.取处于对数生长期的卵巢癌顺铂耐药细胞株c13*，高三尖杉酯碱(0μm、0.1μm、1μm、10μm)处理，同时加入pi3k/akt通路抑制剂ly294002阻断剂，将原培养基移入15ml离心管中待用。用pbs轻轻洗涤2次，每孔加入1ml预热的胰酶，37℃孵育4
‑
5min后，使细胞完全脱落，使用原培养基1ml终止消化，吹打均匀，转移回15ml离心管。装有细胞样品的15ml离心管于1000rpm，离心5min，去除上层培养基，用pbs洗涤细胞沉淀2次(1000rpm，离心5min)，样品去除pbs后备用或置于
‑
80℃保存。
36.4.2ripa裂解法：
37.整个裂解过程在冰上操作，防止蛋白裂解。将ripa和pmsf(蛋白酶抑制剂)，按100:1的比例配好，充分混匀。按细胞沉淀的量加入适当体积的裂解液，吹打混匀，置于冰中裂解30min，使细胞完全裂解，然后于4℃、16000rcf，离心15min。取上清蛋白至新的离心管中，置
于
‑
80℃保存。
38.4.3蛋白样品的定量(bca法)：
39.采用novagen公司的bca法进行蛋白浓度的测定，方法如下：1)以浓度分别为0mg/ml、0.0625mg/ml、0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml的标准蛋白制作标准曲线；2)取2μl蛋白样品加入18μl的生理盐水，每孔样品体积20μl，设置一个复孔；3)以a液：b液＝200:1的体积均匀混合，在标准蛋白和待测样品中每孔加入200μl bca混合液，将96孔板置于37℃培养箱中孵育30min；4)酶标仪检测蛋白浓度5)在540nm波长下检测每孔蛋白的吸光度，以标准蛋白的浓度为x轴，吸光度为y轴制作标准曲线，将样品蛋白的吸光度的平均值计代入标准曲线计算蛋白浓度，计算出的数值乘以10，得出原样品蛋白的浓度。
40.4.4制胶：
41.根据mica、akt、p
‑
akt、gapdh的分子量，选用12％及8％sds
‑
page分离胶和5％sds
‑
page浓缩胶。使用1.5cm的玻璃板，配方如下：
[0042][0043]
4.5电泳：
[0044]
将配制好的电泳液倒入电泳槽中，用10μl微量移液枪上样，将预冷好的蛋白样品和maker缓慢加入加样孔中。上样后，浓缩胶电压为80v，待溴酚蓝电泳至分离胶时，改为110v，维持电压至溴酚蓝移至分离胶底部时，停止电泳，取出胶板。
[0045]
4.6转膜：
[0046]
根据彩虹预染蛋白maker指示条带，将目的蛋白对应分子量的胶保留下来，完全浸泡于转膜液中，以防干燥。将与胶大小一致的醋酸纤维膜pvdf膜放于甲醛中浸泡10s活化，然后放置于转膜液中。由负极到正极放置顺序：海绵垫，滤纸，胶，膜，滤纸，海绵垫，放置过程中保持胶和膜的湿润，用玻璃棒赶出胶与膜之间的气泡。将做好的夹板放入装有转膜液的电泳槽中，加入适当冰袋，4℃、250ma恒流条件下转膜60min。
[0047]
4.7封闭、杂交：
[0048]
1)取出转膜后的pvdf膜，蛋白面朝上并于左上角剪角作为标识，然后pvdf膜用1
×
tbst洗涤1次；2)用5％脱脂奶粉室温封闭2h，再用1
×
tbst洗涤1次；3)加入一抗稀释液稀释好的一抗，4℃下摇床孵育过夜；4)次日取出，1
×
tbst洗涤4次，10min/次；5)加入5％脱脂奶粉稀释好的二抗，室温摇床上孵育1.5h；6)1
×
tbst洗涤4次，10min/次。4.8显影(bio
‑
rad凝
胶成像系统成像)：
[0049]
用滤纸将pvdf膜表面的tbst溶液吸干，然后将pvdf膜放在保鲜膜上，根据pvdf膜大小配制ecl显色液，a、b液按1:1的比例混合，将混合液滴在pvdf膜表面，使液体覆盖整张膜，避光室温孵育2
‑
3min，操作过程中应避光。放入bio
‑
rad凝胶成像系统成像，根据显影条带背景情况调整曝光时间，选择满意的图片，同时利用系统软件分析各组条带灰度值，结果进行统计学分析。本实验重复三次以上。
[0050]
我们发现，高三尖杉酯碱上调卵巢癌顺铂耐药细胞株mica，抑制akt和p
‑
akt表达(图4a)，且该效应可以被pi3k/akt通路抑制剂ly294002阻断(图4b)。说明，高三尖杉酯碱可以通过akt通路上调卵巢癌顺铂耐药细胞株mica。
[0051]
5、高三尖杉酯碱增强nk
‑
92细胞对卵巢癌顺铂耐药细胞株的杀伤能力
[0052]
按照说明操作。取卵巢癌顺铂耐药细胞株c13*细胞为靶细胞，用含5％的胎牛血清dmem完全培养液调整细胞密度为1x105/ml，加于96孔板中，每孔50μl。用高三尖杉酯碱(0μm、0.1μm、1μm、10μm)处理靶细胞。以nk92细胞为效应细胞，倍比稀释，按效靶比(2.5:1，5:1，10:1)分别加入靶细胞各50μl。效、靶细胞自然释放组(效应细胞或靶细胞50μl，5％的胎牛血清dmem完全培养液50μl)，靶细胞最大释放组(每孔50μl靶细胞，50μl 5％的胎牛血清dmem完全培养液)。铺完板后37℃，5％co2培养箱继续培养3小时，靶细胞最大释放组分别加入10μl裂解液，继续培养1小时，1000rpm，离心5min，小心吸取50μl上清，加入96孔平底酶标板中。加入50μl钙黄绿素底物反应液，室温避光放置30min，每孔加50μl反应终止液终止反应，酶标仪上波长490nm处以空白组为基准测od值，分别计算各组的nk细胞杀伤活性。计算nk细胞杀伤活性(％)(实验组od值
‑
靶细胞自然释放组od值
‑
效应细胞自然释放组od值)/(靶细胞最大释放组od值
‑
靶细胞自然释放组od值)x 100％。
[0053]
结果如图5所示，随着高三尖杉酯碱浓度的增加，nk92细胞对c13*细胞的杀伤活性增强，有显著性差异(p<0.05)(图5)。