一种黑磷纳米片复合材料及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物医学材料技术领域，尤其涉及一种黑磷纳米片复合材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.传统癌症治疗依赖于化疗、手术治疗和放疗，随着纳米药物的发展，开发通过外部能量非侵入性触发药物消灭肿瘤的治疗方法成为热点。其中光动力疗法利用近红外光触发光敏剂产生有毒的活性氧(reactive oxygen species,ros)治疗肿瘤，然而，近红外光在生物组织中的穿透性差，所以光动力疗法只对浅表肿瘤有效。声动力疗法(sonodynamic therapy，sdt)，利用低频聚焦超声激活声敏剂产生有毒的活性氧(ros)用于治疗肿瘤，使用治疗性超声代替光，超声具有较低的组织衰减系数和非辐射特性，可以在不损失能量的情况下更深入地渗透到组织中，与光动力疗法相比，具有无创性和高组织穿透能力的优点。
3.声动力疗法使用的敏化剂最初从光敏剂发展而来，最常用的声敏剂是卟啉及其衍生物，有机声敏剂具有较好的超声响应产生活性氧的能力，但是有机声敏剂的稳定性不高并且在生物体内易被清除。与有机声敏剂相比，无机声敏剂的稳定性较高，最具代表性的是二氧化钛纳米材料，可以在超声作用下产生ros，但纯二氧化钛在超声激发后产生的电子
‑
空穴对易于复合，导致其ros的量子产率很低。其他无机纳米材料如缺氧双金属氧化物mnwo
x
纳米颗粒、ptcu3纳米笼等也可以用作声敏剂，但它们在体内不可降解，具有一定的不可控性。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明第一个方面提出一种黑磷纳米片复合材料，能够在低频超声作用下产生ros，破坏肿瘤微环境的氧化还原平衡，起到声动力治疗的效果。
5.本发明的第二个方面提出了一种上述黑磷纳米片复合材料的制备方法。
6.本发明的第三个方面提出了一种上述黑磷纳米片复合材料的应用。
7.根据本发明的第一个方面，提出了一种黑磷纳米片复合材料，包括：
8.黑磷纳米片，所述黑磷纳米片表面负载纳米金颗粒，形成金
‑
黑磷纳米片；
9.二氧化锰，所述二氧化锰包覆所述金
‑
黑磷纳米片形成黑磷纳米片复合材料。
10.本发明中，黑磷纳米片作为一种压电材料可以通过超声激发产生ros，但未经修饰的黑磷纳米片声动力效率较低，将纳米金颗粒原位负载到黑磷纳米片表面，可以降低黑磷纳米片的带隙，提高电子
‑
空穴分离效率，从而进一步提高低频率聚焦超声激发的ros产率。进一步采用二氧化锰对金
‑
黑磷纳米片整体进行包覆，显著提高环境的氧气浓度，可以进一步增强ros产率。
11.在本发明的一些实施方式中，所述黑磷纳米片与所述纳米金颗粒的质量比为1：(0.5～6.0)。
12.在本发明的一些优选的实施方式中，所述金
‑
黑磷纳米片与所述二氧化锰的质量比为1：(0.5～3.0)。
13.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述黑磷纳米片的平均尺寸为50nm～500nm。
14.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述黑磷纳米片复合材料的平均尺寸为150nm～300nm。
15.根据本发明的第二个方面，提出了一种黑磷纳米片复合材料的制备方法，包括以下步骤：
16.在黑磷纳米片分散液中加入水溶性金盐，混合，再在搅拌下滴加高锰酸钾水溶液，加热搅拌反应，制得黑磷纳米片复合材料。
17.在本发明的一些实施方式中，所述水溶性金盐选自三水四氯金酸(haucl4·
3h2o)、二水四氯金酸钠(h4aucl4nao2)中的至少一种。
18.在本发明的一些优选的实施方式中，所述加热搅拌反应的温度为20℃～50℃，时间为0.5h～1.5h。
19.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述黑磷纳米片的制备方法包括：将黑磷粉末分散到有机溶剂中，超声后离心。
20.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述有机溶剂选自n
‑
甲基吡咯烷酮(nmp)、二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基亚砜(dmso)中的任意一种。
21.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述超声的时间为18h～22h。
22.根据本发明的第三个方面，提出了一种声敏剂，包括所述黑磷纳米片复合材料。
23.本发明中，黑磷纳米片复合材料在超声下能产生大量活性氧，是优异的声敏剂。
24.根据本发明的第四个方面，提出了一种黑磷纳米片复合材料在制备抗肿瘤药物中的应用，所述黑磷纳米片复合材料为上述黑磷纳米片复合材料。
25.本发明的有益效果为：
26.本发明的黑磷纳米片复合材料尺寸可控，可降解且无毒性，黑磷纳米片表面修饰单质金有助于提高ros的产率，还可以通过调节黑磷纳米片表面负载的单质金的比例来调节黑磷纳米片复合材料的声动力灵敏度，二氧化锰的包覆使其在肿瘤特异性微环境下产生氧气，进一步提高声动力效果。本发明拓展了声敏剂的种类，提高了黑磷材料的利用价值。
27.本发明的黑磷纳米片复合材料具有较好的生物相容性和较高的细胞水平声动力效果，在超声激发下，黑磷纳米片复合材料对细胞的毒性呈现浓度依赖性提升。
附图说明
28.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
29.图1为本发明实施例中25μl(a)，50μl(b)，100μl(c)的haucl4水溶液修饰的au/bp的电镜扫描图。
30.图2为本发明实施例中au/bp@mno2的电镜扫描图。
31.图3为本发明实施例中bp、au/bp、au/bp@mno2的粒径分布图。
32.图4为本发明实施例中bp、au/bp、au/bp@mno2的zeta电位分布图。
33.图5为本发明实施例中au/bp@mno2的元素分析edx图谱。
34.图6为本发明实施例中au/bp@mno2的元素分析mapping图谱。
35.图7为本发明实施例中bp、au/bp的带隙能图。
36.图8为本发明实施例中bp、au/bp、au/bp@mno2产生氧气浓度图。
37.图9为本发明实施例中bp、au/bp、au/bp@mno2的ros含量图。
38.图10为本发明实施例中au/bp、au/bp@mno2的细胞毒性和声动力效果图。
具体实施方式
39.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
40.实施例
41.本实施例制备了一种黑磷纳米片复合材料，具体过程为：
42.s1：黑磷纳米片(bp)的制备：
43.10mg黑磷晶体粉末分散到30ml nmp溶剂中，混合物在冰浴条件下探头超声(700w,on/off:4.0s/3.0s)20h。然后用低温超速离心机3000rpm离心20min，除去未剥离的黑磷晶体。收集上清液，10000rpm离心20min，得到的黑磷纳米片分散到nmp中，储存在
‑
20℃
44.s2：金
‑
黑磷纳米复合物(au/bp)的制备：
45.在超声条件下制备金
‑
黑磷纳米复合物，分别将不同体积(25μl，50μl，100μl)的haucl4水溶液(4mg/ml)加入到1ml黑磷纳米片水分散液(0.10mg/ml)中。混合溶液再超声10min。12000rpm离心10min，用水洗两次。得到不同金负载率的au/bp纳米复合物。
46.s3：黑磷纳米片复合材料(au/bp@mno2)的制备：
47.在低速搅拌条件下(磁力搅拌，200rpm)，2ml的kmno4水溶液逐滴滴加到10ml金
‑
黑磷纳米复合物(100μg/ml)中。转移到40℃恒温水浴锅中，剧烈搅拌(1000rpm)反应1h。12000rpm离心10min，水洗两次，得到黑磷纳米片复合材料。
48.试验例1
49.本实施例对实施例制备过程中的中间体及产物进行结构特征及性能分析。
50.对不同浓度纳米金颗粒修饰的金
‑
黑磷纳米复合物进行电镜扫描，结果如图1所示。
51.从图1可看出，纳米金颗粒不同负载量的金
‑
黑磷纳米复合物(au/bp)中，纳米金颗粒的负载比较均匀，金
‑
黑磷纳米复合物的尺寸在200nm～300nm之间。
52.对黑磷纳米材料与四氯金酸的反应质量比为1:1所制备的黑磷纳米片复合材料(au/bp@mno2)进行电镜扫描，结果如图2所示。
53.从图2可看出，二氧化锰成功包覆金
‑
黑磷纳米复合物，黑磷纳米片复合材料尺寸在200nm左右。
54.对黑磷纳米片(bp)、黑磷纳米材料与四氯金酸的反应质量比为1:1所制备的金
‑
黑磷纳米复合物(au/bp)和黑磷纳米片复合材料(au/bp@mno2)进行粒径分布分析，结果如图3所示。
55.从图3可看出，纯黑磷纳米片的尺寸为205.54
±
5.91nm，au/bp的尺寸为265.0714
±
5.16nm，au/bp@mno2为275.0356
±
2.46nm，可见，通过纳米金颗粒修饰后的au/bp和au/bp@mno2，相对于纯黑磷纳米片的尺寸有所增大。
56.对黑磷纳米片(bp)、黑磷纳米材料与四氯金酸的反应质量比为1:1所制备的金
‑
黑磷纳米复合物(au/bp)和黑磷纳米片复合材料(au/bp@mno2)进行zeta电位分布分析，结果如图4所示。
57.从图4可看出，纯黑磷纳米片的zeta电势为
‑
31.22333
±
3.43682ev，au/bp、au/bp@mno2的电势分别为
‑
25.13542
±
1.09521ev，通过纳米金颗粒修饰后的au/bp和au/bp@mno2，相对于纯黑磷纳米片，其zeta电势的绝对值更低。
58.对黑磷纳米材料与四氯金酸的反应质量比为1:1所制备的黑磷纳米片复合材料(au/bp@mno2)进行元素分析，edx(energy dispersive x
‑
ray spectroscopy，能量色散x射线光谱仪)图谱如图5所示，mapping图如图6所示。
59.从图5可看出，存在o、mn、p、au元素，表面本发明的黑磷纳米片复合材料制备成功。
60.从图6可看出，二氧化锰成功全包覆金
‑
黑磷纳米复合物形成黑磷纳米片复合材料。
61.对黑磷纳米片(bp)、黑磷纳米材料与四氯金酸的反应质量比为1:1所制备的金
‑
黑磷纳米复合物(au/bp)进行带隙测试，结果如图7所示。
62.从图7可看出，黑磷纳米片的带隙为1.57ev，au/bp的带隙为1.30ev，可见，au/bp的带隙相对于bp降低了，纳米金颗粒的负载可以降低纳米材料的带隙，提高电子
‑
空穴分离效率。
63.试验例2
64.本试验例对黑磷纳米片(bp)、黑磷纳米材料与四氯金酸的反应质量比为1:1所制备的金
‑
黑磷纳米复合物(au/bp)和黑磷纳米片复合材料(au/bp@mno2)的生物性能进行分析。
65.对黑磷纳米片(bp)、金
‑
黑磷纳米复合物(au/bp)和黑磷纳米片复合材料(au/bp@mno2)产生氧气的浓度进行测试，测试方法为：将au/bp@mno2(50μg/ml)重新分散在磷酸盐缓冲液(7.4或6.5)中，充氩气并用封口膜密封，用注射器加入h2o2(100μm)，用jpsj
‑
605f便携式溶解氧仪测量溶液不同时间点的氧气浓度。同时，以au/bp(25μg/ml)的磷酸氧缓冲溶液(ph 7.4)和h2o2(100μm)中的氧浓度作为对照组，结果如图8所示。
66.从图8可看出，对照组的氧气终点为0.71mg/l，未经二氧化锰包覆的au/bp在肿瘤微环境模拟液各产生的氧气浓度低，仅为1.02mg/l，而通过二氧化锰进一步包覆产生的材料au/bp@ms可以在肿瘤微环境模拟液中产生氧气浓度显著提高，可达4.4mg/l(ph为7.4下)和6.31mg/l(ph为6.5下)。
67.对黑磷纳米片(bp)、金
‑
黑磷纳米复合物(au/bp)和黑磷纳米片复合材料(au/bp@mno2)的ros含量进行检测，检测方法为：将1ml au/bp、au/bp@ms(25μg/ml)与h2o2(100μm)混合，加入sosg(10μm)后，将混合物暴露于超声辐射(1.0mhz，1.0w/cm2，占空比50％)不同时间，通过荧光分光光度计(ex/em：488/525nm)测量混合物的荧光强度。同时，以纯bp nss，含h2o2(100μm)作为对照组，结果如图9所示。
68.从图9可看出，bp在超声条件下诱导产生单线态氧少，在5min时诱导产生1o2导致的荧光强度为320左右，而经纳米金颗粒进行表面修饰后，au/bp在5min时产生1o2导致的荧光
强度可达700左右，进一步用二氧化锰对au/bp进行包覆后，au/bp@mno2在5min时产生1o2导致的荧光强度可达920左右，ros的产率有了显著的提升。
69.对黑磷纳米材料与四氯金酸的反应质量比为1:1所制备的金
‑
黑磷纳米复合物(au/bp)和黑磷纳米片复合材料(au/bp@mno2)对mcf
‑
7细胞的细胞毒性和声动力效果进行测试，测试方法为：将mcf
‑
7细胞以每孔8
×
103个细胞的密度接种于96孔板并培养12小时。用pbs洗涤一次后，将细胞与梯度浓度(0、6.25、12.5、25、50、75μg/ml)的au/bp@ms nss或相应浓度(0、3.125、6.25、12.5、25,37.5μg/ml)au/bp nss孵育24小时并用pbs洗涤。使用cell counting kit
‑
8(cck
‑
8)孵育2小时，在450nm波长处测量吸光度，进行标准细胞活力测定以确定相对细胞活力。对于体外声动力效果，mcf
‑
7细胞以每孔8
×
103个细胞的密度接种在96孔板中12小时。用pbs洗涤一次后，将细胞与梯度浓度(0、6.25、12.5、25、50、75μg/ml)的au/bp@ms nss或相应浓度(0、3.125、6.25、12.5、25,37.5μg/ml)的au/bp nss孵育6小时并用pbs洗涤。然后，将细胞暴露于超声辐射(us，1.0mhz，1.0w/cm2，占空比50％)3分钟，并进一步孵育24小时。进行标准细胞活力测定以确定相对细胞活力，结果如图10所示。
70.从图10可看出，不同浓度下的au/bp和au/bp@mno2本身对细胞几乎没有毒性，但在超声(us)激发后，au/bp和au/bp@mno2使得细胞的活力不同程度下降，尤其是au/bp@mno2，其在6.25μg/ml浓度下，即可使得40％左右的细胞失去活力，且随着au/bp@mno2浓度的增加，其对细胞的毒性呈现依赖性增大，当au/bp@mno2的浓度达到75μg/ml时，细胞活力仅剩30％左右。可见，本发明制得的au/bp@mno2具备优异的声动力效果。
71.上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。