用于诊断和治疗癌症及其他疾病的对致病性胞外基质的鉴定和靶向的制作方法

用于诊断和治疗癌症及其他疾病的对致病性胞外基质的鉴定和靶向
1.相关申请的引用
2.本技术要求于2018年10月16日提交的美国临时申请号62/746,286的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。


背景技术：
1.技术领域
3.本发明一般性地涉及医学领域。更具体地，其涉及基于同三聚体i型胶原蛋白之存在来检测癌症以及通过破坏同三聚体i型胶原蛋白以及由其诱导的信号传导来治疗癌症的方法。
4.2.相关技术的描述
5.结缔组织形成(desmoplasia)，即由多种细胞群(例如肌成纤维细胞)构成的致密基质，以及胞外基质(extracellular matrix，ecm)(例如i型胶原蛋白(type i collagen，col1))的沉积是胰腺导管癌(pancreatic ductal carcinoma，pdac)的定义性特征。然而，ecm和肿瘤基质在支持或抑制肿瘤发生中的具体作用仍存在争议(mueller and fusenig,2004；neesse et al.,2015)。已有支持pdac基质的肿瘤支持和肿瘤抑制贡献二者的观察。先前观察表明，pdac中的促结缔组织增生基质(例如活化的胰腺星状细胞[pancreatic stellate cell，psc]/肌成纤维细胞和ecm)形成促肿瘤发生微环境，这会促进药物递送下降和治疗抗性。已表明靶向pdac基质通过抑制音猬因子(sonic hedgehog，shh)途径(olive et al.,2009)或通过消融基质透明质酸(provenzano et al.,2012)来降低pdac结缔组织形成并提高药物递送。然而，靶向pdac基质的临床试验未能产生正如预期的有希望的治疗结局。另外，最近的研究证明了基质成纤维细胞的异质性及其多重作用(ohlund et al.,2014；kalluri,2016；ohlund et al.,2017)。先前研究表明，尽管pdac基质中的纤维化和胶原蛋白沉积降低，但增殖的α
‑
平滑肌肌动蛋白(α
‑
smooth muscle actin，αsma)表达活化的psc/肌成纤维细胞的耗竭仍引起pdac的低氧状态和侵袭性(ozdemir et al.,2014)。shh的遗传消融或平息性抑制还导致更具侵袭性且较低分化的pdac。这些观点与表明肿瘤基质的抑制功能的早期研究(rhim et al.,2014)相一致。也有报道称，由于在很大程度上确定基质重塑的pdac的不同基因型和信号传导，因此pdac对抗基质治疗的响应可能存在很大变化(laklai et al.,2016)。总而言之，这些多样的或甚至冲突的观察表明，pdac基质的复杂的生物学和多重作用超出了先前的知识范围，这无疑需要使用新实验系统进行进一步的系统研究。
[0006]
pdac的当前遗传改造小鼠模型(genetically engineered mouse model，gemm)，例如经典的kpc(lsl
‑
kras
g12d/
；trp53
r172h/
或trp53
loxp/loxp
；pdx1
‑
cre)模型，提供了模仿人pdac临床情况的有价值的平台，并且为针对pdac及其治疗的研究做出了巨大贡献(hingorani et al.,2005)。常规的kpc模型已广泛用于与癌细胞中的条件性敲除(floxed，
侧翼为loxp位点)基因的遗传消融(使用相同的胰腺特异性cre，例如pdx1
‑
cre或p48
‑
cre)或者与基因的全身敲除(knockout，ko)相组合。然而，由于通用的cre
‑
loxp重组机制，在这些gemm中的基质细胞亚群(例如肌成纤维细胞或免疫细胞)中实现细胞类型特异性的遗传操作仍然是不可能的。而且，还不可能建立包含具有ko致命性的那些基因(例如编码i型胶原蛋白α1链的col1a1)的全身ko的kpc模型(lohler et al.,1984)。因此，出乎意料但合理地，到目前为止，还没有使一种或更多种基质细胞来源中的col1能够进行功能性ko以证明col1的来源和贡献的pdac gemm，尤其是考虑到在pdac结缔组织形成和微环境中，col1是这样的必需组分以及是最丰富的蛋白质。
[0007]
i型胶原蛋白(col1)(通常由α1链和α2链构成)是pdac微环境中沉积性最强的间质ecm组分之一。许多研究表明，活化的psc/肌成纤维细胞是col1以及其他ecm物质的主要细胞来源(haber et al.,1999；armstrong et al.,2004；bachem et al.,2005；fujita et al.,2009；apte et al.,2012)。然而，还表明col1由多种类型的癌细胞产生并促进肿瘤进展。实际上，癌细胞来源col1由独特且具有mmp抗性的同三聚体(α1)3链组成，这与由成纤维细胞或其他正常细胞产生的(α1/α2/α1)异三聚体链相反(sengupta et al.,2003；han et al.,2008；egeblad et al.,2010；han et al.,2010；makareeva et al.,2010)。这些观察表明在癌症中，癌症来源col1与肌成纤维细胞来源col1的独特结构和功能作用。先前已经进行了许多研究来解决pdac基质的活性作用。然而，相对于特定细胞来源的ecm组分(例如col1)的作用尚未在临床相关的转基因pdac模型中得到系统验证或比较。为了进一步理解基质对pdac发育的影响，重要的是剖析特定来源于多种细胞来源(例如癌细胞和成纤维细胞亚群)的col1的精确功能。


技术实现要素：

[0008]
在一个实施方案中，本文中提供了与α1同三聚体i型胶原蛋白结合的抗体或抗体片段。在一些方面中，所述抗体或抗体片段对α1同三聚体i型胶原蛋白的亲和力高于对α1/α2/α1异三聚体i型胶原蛋白的亲和力至少二、三、四、五、六、七、八、九或十倍。在一些方面中，所述抗体或抗体片段不与α1/α2/α1异三聚体i型胶原蛋白可检测地结合。所述抗体或抗体片段可识别同三聚体中存在(但异三聚体中不存在)的构象或特定的不连续表位。
[0009]
在一些方面中，抗体片段是重组scfv(单链片段可变)抗体、fab片段、f(ab’)2片段或fv片段。在一些方面中，抗体是嵌合抗体或双特异性抗体。在某些方面中，嵌合抗体是人源化抗体。在某些方面中，双特异性抗体与α1同三聚体i型胶原蛋白和cd3二者均结合。在一些方面中，所述抗体或抗体片段与细胞毒性剂缀合。在一些方面中，所述抗体或抗体片段与诊断剂缀合。
[0010]
在一个实施方案中，本文中提供了编码本发明实施方案的抗体或抗体片段的杂交瘤或经改造细胞。在一些实施方案中，提供了包含一种或更多种的本发明实施方案的抗体或抗体片段的药物制剂。
[0011]
在一个实施方案中，本文中提供了治疗有此需要的患者的方法，所述方法包括施用有效量的α1同三聚体i型胶原蛋白特异性抗体或抗体片段。在一些方面中，所述α1同三聚体i型胶原蛋白特异性抗体或抗体片段是本发明实施方案中任一个所述的抗体或抗体片段。
[0012]
在一些方面中，患者患有癌症、纤维性病、瘢痕疙瘩、器官纤维化、克罗恩病(crohn’s disease)、狭窄、结肠炎、银屑病或结缔组织病症。在一些方面中，结缔组织病症是涉及胶原蛋白的结缔组织病症。在某些方面中，涉及胶原蛋白的结缔组织病症是涉及1型胶原蛋白的结缔组织病症。
[0013]
在一些方面中，患者患有癌症。在一些方面中，已经确定癌症患者相对于对照患者表达升高水平的α1同三聚体i型胶原蛋白。在某些方面中，癌症是胰腺癌。在一些方面中，所述方法进一步限定为抑制胰腺癌转移的方法。在一些方面中，所述方法进一步限定为抑制胰腺癌生长的方法。在一些方面中，所述方法还包括施用至少第二抗癌治疗。在某些方面中，第二抗癌治疗是化学治疗、免疫治疗、放射治疗、基因治疗、外科手术、激素治疗、抗血管生成治疗或细胞因子治疗。
[0014]
在一个实施方案中，本文中提供了嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)多肽，其包含从n端至c端的抗原结合结构域；铰链结构域；跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中所述car多肽与α1同三聚体i型胶原蛋白结合。在一些方面中，抗原结合结构域包含来自与α1同三聚体i型胶原蛋白结合的第一抗体的hcdr序列和来自与α1同三聚体i型胶原蛋白结合的第二抗体的lcdr序列。在一些方面中，抗原结合结构域包含来自与α1同三聚体i型胶原蛋白结合的抗体的hcdr序列和lcdr序列。在一些方面中，抗原结合结构域对α1同三聚体i型胶原蛋白的亲和力高于对α1/α2/α1异三聚体i型胶原蛋白的亲和力至少二、三、四、五、六、七、八、九或十倍。在一些方面中，抗原结合结构域不与α1/α2/α1异三聚体i型胶原蛋白可检测地结合。
[0015]
在一些方面中，铰链结构域是cd8a铰链结构域或igg4铰链结构域。在一些方面中，跨膜结构域是cd8a跨膜结构域或cd28跨膜结构域。在一些方面中，胞内信号传导结构域包含cd3z胞内信号传导结构域。
[0016]
在一个实施方案中，本文中提供了编码任何本发明实施方案所述的car多肽的核酸分子。在一些方面中，编码car多肽的序列与表达控制序列可操作地连接。
[0017]
在一个实施方案中，本文中提供了包含本发明实施方案所述的car多肽或核酸的分离的免疫效应细胞。在一些方面中，所述核酸被整合到细胞的基因组中。在一些方面中，细胞是t细胞。在一些方面中，细胞是nk细胞。在一些方面中，细胞是人细胞。在一个实施方案中，本文中提供了包含在可药用载体中的本发明实施方案所述的细胞的群体的药物组合物。
[0018]
在一个实施方案中，本文中提供了治疗对象的方法，其包括施用抗肿瘤有效量的表达根据本发明实施方案中任一个所述的car多肽的嵌合抗原受体(car)t细胞。在一些方面中，car t细胞是同种异体细胞。在一些方面中，car t细胞是自体细胞。在一些方面中，car t细胞与对象hla匹配。在一些方面中，对象患有癌症，例如如胰腺癌。在一些方面中，所述方法还包括在施用cart细胞之前施用脱甲基化药物，以便用作免疫治疗的引发物(primer)。脱甲基化药物可逆转col1a2高甲基化。脱甲基化药物可以是5
‑
氮杂胞苷或5
‑
氮杂
‑2’‑
脱氧胞苷。在一些方面中，所述方法还包括施用干扰col1a2基因的启动子的甲基化的药物。
[0019]
在一个实施方案中，本文中提供了治疗对象的方法，其包括施用抗肿瘤有效量的表达根据本发明实施方案中任一个所述的car多肽的嵌合抗原受体(car)nk细胞。在一些方
面中，car nk细胞是同种异体细胞。在一些方面中，car nk细胞是自体细胞。在一些方面中，car nk细胞与对象hla匹配。在一些方面中，对象患有癌症，例如如胰腺癌。在一些方面中，所述方法还包括在施用car nk细胞之前施用脱甲基化药物，以便用作免疫治疗的引发物。脱甲基化药物可逆转col1a2高甲基化。脱甲基化药物可以是5
‑
氮杂胞苷或5
‑
氮杂
‑2’‑
脱氧胞苷。在一些方面中，所述方法还包括施用干扰col1a2基因的启动子的甲基化的药物。
[0020]
在一个实施方案中，本文中提供了诊断患者为患有疾病的方法，所述方法包括使获自对象的癌组织与本发明实施方案中任一个所述的抗体接触，以及检测所述抗体与所述组织的结合，其中如果抗体与组织结合，则将患者诊断为患有癌症或纤维性病。在一些方面中，疾病是癌症、纤维性病、瘢痕疙瘩、器官纤维化、克罗恩病、狭窄、结肠炎、银屑病或结缔组织病症。在一些方面中，结缔组织病症是涉及胶原蛋白的结缔组织病症。在一些方面中，涉及胶原蛋白的结缔组织病症是涉及1型胶原蛋白的结缔组织病症。
[0021]
在一个实施方案中，本文中提供了对患有胰腺导管腺癌的患者进行分类的方法，所述方法包括在获自对象的癌组织中确定i型胶原蛋白/ck19比率，其中当比率低于参考正常组织中的比率则表明患者处于更晚期的疾病状态。在一些方面中，参考正常组织获自患者。
[0022]
在一个实施方案中，本文中提供了治疗患有疾病的对象的方法，所述方法包括施用抗肿瘤有效量的抑制使α1i型胶原蛋白同三聚体交联的酶的组合物。在一个实施方案中，本文中提供了治疗患有疾病的对象的方法，所述方法包括施用抗肿瘤有效量的抑制促进α1i型胶原蛋白同三聚体形成的分子伴侣的组合物。在一个实施方案中，本文中提供了治疗患有疾病的对象的方法，所述方法包括施用抗肿瘤有效量的抑制通过ddr1受体进行的促致癌信号传导的组合物。在一些方面中，已经确定对象相对于对照对象表达升高水平的α1同三聚体i型胶原蛋白。
[0023]
在一些方面中，疾病是癌症、纤维性病、瘢痕疙瘩、器官纤维化、克罗恩病、狭窄、结肠炎、银屑病或结缔组织病症。在一些方面中，结缔组织病症是涉及胶原蛋白的结缔组织病症。在一些方面中，涉及胶原蛋白的结缔组织病症是涉及1型胶原蛋白的结缔组织病症。
[0024]
在一些方面中，疾病是癌症。在某些方面中，癌症是胰腺癌。在一些方面中，所述方法进一步限定为抑制胰腺癌转移的方法。在一些方面中，所述方法进一步限定为抑制胰腺癌生长的方法。在一些方面中，所述方法还包括施用至少第二抗癌治疗。在某些方面中，第二抗癌治疗是化学治疗、免疫治疗、放射治疗、基因治疗、外科手术、激素治疗、抗血管生成治疗或细胞因子治疗。
[0025]
本文中使用的“基本上不含”就指定组分而言在本文中用于意指该指定组分未被有目的地配制到组合物中和/或者仅作为污染物或以微量存在。因此，由组合物的任何意外污染引起的指定组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法不能检测到指定组分的量的组合物。
[0026]
本文中说明书使用的没有数量词修饰的名词可意指一个/种或更多个/种。如本文中权利要求书中使用的，当与词语“包含/包括”联合使用时，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或多于一个/种。
[0027]
除非明确地指出仅指替代方案或者替代方案相互排斥，否则权利要求书中术语“或/或者”的使用用于意指“和/或”，但是本公开内容支持指仅替代方案和“和/或”的定义。
本文中使用的“另一”可意指至少第二个/种或更多个/种。
[0028]
在本技术通篇，术语“约”用于表示值包括用于装置、用来确定所述值的方法的误差的固有变化，所述研究对象之间存在的变化，或者所述值10％之内的值。
[0029]
通过以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应理解的是，详细描述和具体实例尽管指出了本发明的一些优选实施方案但是仅以举例说明的方式给出，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的多种改变和修改对于本领域技术人员将变得明显。
附图说明
[0030]
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过结合本文中给出的具体实施方案的详细描述来参考这些附图中的一幅或更多幅可更好地理解本发明。
[0031]
图1a至b：图1a：使用kppf；αsma
‑
cre；col1a1
loxp/loxp
(称为kppf；col1
smako
)小鼠进行的在胰腺癌背景下在αsma表达细胞群中特异性地缺失i型胶原蛋白α1(col1a1)的遗传策略。使用具有kppf(kppf；cre阴性；col1a1
loxp/loxp
)基因型的同窝出生仔畜作为对照小鼠。图1b：用苏木精和伊红(h&e)、天狼星红(picrosirius red)、mts、col1(免疫组织化学)和αsma(免疫组织化学)染色的来自kppf或kppf；col1
smako
小鼠的胰腺肿瘤的系列切片。
[0032]
图2a至f：图2a：kppf和kppf；col1
smako
肿瘤的冷冻切片的代表性原子力显微镜(atomic force microscopic，afm)图像。基于3只小鼠/组的afm测定进行弹性模量的定量。图2b：kppf和kppf；col1
smako
小鼠的存活曲线。图2c：在所示组中显示腹胀和腹水的小鼠百分比。图2d：处于panin或pdac阶段的kppf或kppf；col1
smako
小鼠通过h&e、ck19(免疫组织化学)和col1(免疫组织化学)染色的胰腺系列切片。基于ck19和col1的阳性区域百分比计算col1/ck19比率的定量。图2e：基于来自kppf肿瘤(n＝3只小鼠/组)或kppf；col1
smako
肿瘤(n＝4只小鼠/组)的全转录物组rna测序(rna
‑
seq)数据的gsea
‑
hallmark富集分析，最显著上调的细胞信号传导途径的以归一化富集评分(normalized enrichment score，nes)示出的gsea
‑
hallmark富集分析。图2f：mf中col1α1的q
‑
pcr分析。
[0033]
图3a至f：图3a：在kf(fsf
‑
kras
g12d/
；pdx1
‑
flp)小鼠中，使用pdx1
‑
flp
‑
frt重组系统诱导致癌性kras
g12d
的遗传策略。i型胶原蛋白α1(col1a1)在使用kf；αsma
‑
cre；col1a1
loxp/loxp
(称为kf；col1
smako
)小鼠的αsma表达细胞群中特异性缺失(参见图10a)，或者在使用kf；pdx1
‑
cre；col1a1
loxp/loxp
(称为kf；col1
pdxko
)小鼠的pdx1表达癌细胞谱系中缺失。图3b：kf或kf；col1
pdxko
(年龄匹配的6月龄)小鼠通过h&e和col1(免疫组织化学)染色的胰腺系列切片。图3c：来自具有kf(左列)、kf；col1
smako
(右列)或kf；col1
pdxko
(中间列)基因型的年龄匹配的6月龄小鼠的胰腺中adm和panin病变的百分比。图3d：在kf(左列)和kf；col1
pdxko
(右列)小鼠的adm病变中进行col1免疫组织化学染色。图3e&f：kf(左列)和kf；col1
pdxko
(右列)小鼠的adm和panin病变中的sox9阳性率(％)(图3e)。sox9免疫组织化学染色的代表性图像示于(图3f)中。
[0034]
图4a至f：图4a：使用lsl
‑
kras
g12d
；trp53
loxp/loxp
；pdx1
‑
cre；col1a1
loxp/loxp
(称为kppc；col1
pdxko
)小鼠在胰腺癌背景下在癌细胞谱系中缺失i型胶原蛋白α1(col1a1)的遗传策略。将lsl
‑
kras
g12d
；trp53
loxp/loxp
；pdx1
‑
cre(kppc)小鼠用作对照动物。图4b：kppc(第53
天时间点的底线)和kppc；col1
pdxko
(第53天时间点的顶线)小鼠的存活。图4c：相同28日龄的kppc(左列)和kppc；col1
pdxko
(右列)小鼠的panin病变区域百分比。图4d：用苏木精和伊红(h&e)、col1(免疫组织化学)和天狼星红染色的来自相同53日龄的kppc(左列)和kppc；col1
pdxko
(右列)小鼠的胰腺肿瘤切片的系列切片。图4e：来自相同53日龄的kppc和kppc；col1
pdxko
小鼠的肿瘤的组织学评价。图4f：相同53日龄的kppc(左列)和kppc；col1
pdxko
(右列)小鼠的胰腺肿瘤负荷(肿瘤重量/体重)。
[0035]
图5a至i：图5a至d：对kppc肿瘤(n＝4)和kppc；col1
pdxko
肿瘤(n＝5)进行全转录物组rna测序(rna
‑
seq)分析。基于对kppc；col1
pdxko
肿瘤(图5a)和kppc肿瘤(图5b)的gsea
‑
hallmark富集分析，如(图5c)中所总结的，以上调基因簇的归一化富集评分(nes)示出的gsea图。最高的上调基因列于(图5d)中。图5e：基于kppc；col1
pdxko
肿瘤和kppc肿瘤中富集的转录物鉴定的最高的上调基因网络。图5f至i：对kppc和kppc；col1
pdxko
细胞系进行全转录物组rna测序(rna
‑
seq)分析。基于对kppc；col1
pdxko
细胞(图5f)和kppc细胞(图5g)进行的gsea
‑
hallmark分析，如(图5h)中所总结的，以上调基因簇的归一化富集评分(nes)示出的gsea图。最高的上调基因列于(图5i)中。
[0036]
图6a至h：图6a：由kppc和kppc；col1
pdxko
肿瘤建立的原代小鼠癌细胞系。图6b：随时间推移，kppc(顶线)和kppc；col1
pdxko
(底线)细胞系的细胞增殖。在存在不同浓度的吉西他滨(gemcitabine)的情况下kppc和kppc；col1
pdxko
细胞系的细胞生存力。图6c&d：由kppc和kppc；col1
pdxko
细胞系建立的3d肿瘤球体。通过kppc(左列)和kppc；col1
pdxko
(右列)细胞系的球体的平均直径定量于(图6d)中。图6e：如通过qrt
‑
pcr检查的，在kppc(每对左列)和kppc；col1
pdxko
(每对右列)细胞系中多种胶原蛋白类型的基因表达谱。图6f：与3t3小鼠成纤维细胞相比，由转基因小鼠模型(包括kf、kpf、kppf、kppc、ktc和pkt品系)的胰腺肿瘤建立的原代小鼠癌细胞系中col1a1和col1a2基因的甲基化dna免疫沉淀(methylated dna immunoprecipitation，medip)测定。与从kppc肿瘤中分选的原代小鼠成纤维细胞相比，kppc原代小鼠癌细胞系中col1a1和col1a2的相对表达水平。分别来自kppc癌细胞、kppc；col1
pdxko
细胞和3t3成纤维细胞的细胞培养基中的经纯化的col1同三聚体和异三聚体的col1α1链和col1α2链的表征。检查了col1同三聚体和异三聚体对mmp降解的敏感性。图6g：人胰腺癌细胞系和正常人胰腺上皮细胞系(hpne)的全基因组dna甲基化分析。示出了在col1a1和col1a2基因启动子区域的dna甲基化。图6h：与bj成纤维细胞相比，人胰腺癌细胞系中col1a1(每对左列)和col1a2(每对右列)基因的qrt
‑
pcr检查。
[0037]
图7a至j：图7a：在kppf(fsf
‑
kras
g12d/
；trp53
frt/frt
；pdx1
‑
flp)小鼠中使用pdx1
‑
flp
‑
frt重组系统诱导致癌性kras
g12d
和纯合p53丧失的遗传策略。图7b：kppf小鼠通过苏木精和伊红(h&e)和i型胶原蛋白(col1)免疫组织化学染色的正常、panin和pdac阶段的代表性胰腺切片。图7c：在kppc(lsl
‑
kras
g12d
；trp53
loxp/loxp
；pdx1
‑
cre)小鼠中使用pdx1
‑
cre
‑
loxp重组系统诱导致癌性kras
g12d
和纯合p53丧失的遗传策略。图7d：kppc小鼠通过苏木精和伊红(h&e)和i型胶原蛋白(col1)免疫组织化学染色的正常、panin和pdac阶段的代表性胰腺切片。图7e至f：在kppf；αsma
‑
cre；r26
dual
小鼠中使用rosa26
‑
cag
‑
lo.xp
‑
frt
‑
stop
‑
frt
‑
fireflyluc
‑
egfp
‑
loxp
‑
renillaluc
‑
tdtomato(r26
dual
)示踪剂诱导pdx1
‑
flp谱系中egfp表达和αsma
‑
cre谱系中tdtomato表达的遗传策略。图7g：来自针对固有egfp(癌细胞中)和tdtomato(αsma表达肌成纤维细胞中)信号检查的kppf；αsma
‑
cre；r26
dual
小鼠的原发
性pdac肿瘤的代表性图像。图7h：来自从kppf或kppf；col1
smako
小鼠分选的癌细胞和肌成纤维细胞的原代细胞培养物的dna的pcr产物的电泳迁移。pcr产物检测确定了由来自kppf；col1
smako
小鼠的肌成纤维细胞中特定预期的泳道示出的基因重组的对col1a1的特异性缺失。图7i：使用cmv
‑
cre进行的col1a1的全身性丧失，导致胚胎致命性。图7j：所示组中的胰腺h&e以及adm和panin的定量(kf；col1
pdxko
为左列；kf；cre
neg
；col1
f/f
为中间列；kf；col1
smako
为右列)。
[0038]
图8a至c：图8a&b：kppf小鼠通过h&e、ck19、col1和αsma免疫组织化学染色的在从adm/早期panin至panin(图8a)，或从panin至pdac(图8b)的疾病进展期间的胰腺系列切片。图8c：对疾病进展的每个阶段的ck19、col1和αsma的阳性区域百分比或者col1/ck19比率进行定量。
[0039]
图9：来自与col1a1表达水平和ck19表达水平之比率相关的tcga数据集(rna seq v2 rsem)的胰腺腺癌患者的总存活(overall survival，os)和无进展存活(progression
‑
free survival，pfs)。患者基于中位col1a1/ck19比率(或以对照组，按col1a1/gapdh比率或col1a1/actb比率)分为两组。
[0040]
图10a至b：图10a：使用kf；αsma
‑
cre；col1a1
loxp/loxp
(称为kf；col1
smako
)小鼠在胰腺癌背景下在αsma表达细胞群中特异性地缺失i型胶原蛋白α1(col1a1)的遗传策略。使用具有kf(kf；cre阴性；col1a1
loxp/loxp
)基因型的同窝出生仔畜作为对照小鼠。图10b：kf或kf；col1
smako
(年龄匹配的6月龄)小鼠的通过h&e、mts、col1(免疫组织化学)和αsma(免疫组织化学)染色的胰腺的系列切片。
[0041]
图11a至b：图11a：使用lsl
‑
kras
g12d
；pdx1
‑
cre；col1a1
loxp/loxp
(称为kc；col1pdxko)小鼠在胰腺癌背景下在癌细胞谱系中缺失i型胶原蛋白α1(col1a1)的遗传策略。使用lsl
‑
kras
g12d
；pdx1
‑
cre(kc)小鼠作为对照动物。图11b：用苏木精和伊红(h&e)、天狼星红、mts、col1(免疫组织化学)或αsma(免疫组织化学)染色的来自kc或kc；col1
pdxko
小鼠的胰腺肿瘤切片的系列切片。
[0042]
图12a至d：图12a：kppc(第60天时间点的底线)、kppc；col1
pdxko/
(杂合col1a1缺失)(第60天时间点的中线)以及kppc；col1
pdxko
(第60天时间点的顶线)小鼠的存活。图12b：来自终点阶段的kppc和kppc；col1
pdxko
小鼠的用苏木精和伊红(h&e)、col1(免疫组织化学)和天狼星红染色的胰腺肿瘤切片的系列切片。图12c：与bj成纤维细胞相比，多种人胰腺癌细胞系中col1a1和col1a2基因的medip测定。图12d：用所示浓度的col1溶液(来自大鼠尾的异三聚体)处理48小时的kppc和kppc；col1
pdxko
细胞的细胞生存力测定。
[0043]
图13：(右图)用脱甲基化剂5
‑
氮杂胞苷(5
‑
aza)处理的kppc癌细胞、kppc；col1
pdxko
癌细胞和3t3小鼠成纤维细胞中col1a1和col1a2的相对表达水平。(左图)通过western印迹进行的经纯化的col1同三聚体(来自panc1人pdac细胞系)和异三聚体(来自bj成纤维细胞系)的col1α1链和col1α2链的表征。
[0044]
图14a至d：图14a：使用kppf；fsp1
‑
cre；col1a1
loxp/loxp
(称为kppf；col1
fspko
)小鼠在胰腺癌背景下在fsp1表达细胞群中特异性地缺失i型胶原蛋白α1(col1a1)的遗传策略。使用具有kppf(kppf；cre阴性；col1a1
loxp/loxp
)基因型的同窝出生仔畜作为对照小鼠。图14b：kppf和kppf；col1
fspko
小鼠的存活。图14c：来自kppf和kppf；col1
fspko
肿瘤的经fsp1抗体分选的成纤维细胞中col1a1的相对表达水平。这些成纤维细胞还通过重组pcr检测进行检查，
以通过由来自kppf；col1
fspko
小鼠的肌成纤维细胞中特定预期的泳道示出的基因重组来确定col1a1的特异性缺失。图14d：用苏木精和伊红(h&e)、col1(免疫组织化学)和天狼星红染色的来自kppc和kppc；col1
fspko
小鼠的胰腺肿瘤切片的系列切片。
[0045]
图15a至c：图15a：在kppf；fsp1
‑
cre；r26
dual
小鼠中使用r26
dual
示踪剂诱导pdx1
‑
flp谱系中egfp表达和fsp1
‑
cre谱系中tdtomato表达的遗传策略。图15b：来自kppf；fsp1
‑
cre；r26
dual
小鼠的原发性肿瘤的成纤维细胞中，fsp1诱导的固有tdtomato和αsma免疫荧光染色的代表性图像。图15c：来自kppf；cre阴性；r26
dual
小鼠(其在pdx
‑
flp谱系癌细胞中具有egfp表达但不具有tdtomato表达)的原发性肿瘤的fsp1和αsma免疫荧光染色的代表性图像。
具体实施方式
[0046]
肿瘤包含癌细胞和肿瘤微环境(tumor microenvironment，tme)的成分(例如成纤维细胞和i型胶原蛋白)二者。尚不清楚肿瘤微环境是否用作肿瘤生长的促进因素或抑制肿瘤生长。存在tme的一些方面可用作肿瘤进展的正调节剂，而另一些方面用作肿瘤生长的负调节剂的可能性。由肌成纤维细胞产生的i型胶原蛋白(胶原蛋白i)是包含胶原蛋白i的两条α1链(α1(i)胶原蛋白)和胶原蛋白i的一条α2链(α2(i)胶原蛋白)的异三聚体，其通过与癌细胞和另一些基质细胞上的潜在受体(如盘状结构域受体(discodin domain receptor)ii
‑
ddr2)以及免疫细胞上的潜在受体结合而发挥癌症/肿瘤抑制。相比之下，癌细胞产生具有三条α1(i)胶原蛋白链的胶原蛋白i同三聚体，其是癌症/肿瘤促进性的，并与癌细胞中的特异性受体(例如盘状结构域受体1(discodin domain receptor 1，ddr1))结合，以诱导促生存信号、抗凋亡信号、增殖信号和促致癌信号。在与肿瘤微环境中肌成纤维细胞制造的异三聚体相比时，同三聚体(由癌细胞制造)对金属蛋白酶和其他蛋白酶具有抗性。与异三聚体相比，同三聚体表现出其中独特表位暴露的不同的结构，并且除其他机制之外，针对同三聚体产生的抗体还将通过破坏通过癌细胞上促致癌受体进行的信号传导而具有肿瘤抑制特性。导致同三聚体对ddr1的特异性抑制的ddr1阻断导致抑制癌症进展，并诱导抗存活、凋亡信号、抗增殖信号和抗致癌信号。
[0047]
结缔组织形成和胞外基质(ecm)(例如i型胶原蛋白(col1))的显著沉积是胰腺导管癌(pdac)的定义性特征。然而，col1(pdac中最丰富蛋白质之一)的具体作用仍然存在争议。在此，将下一代双重组酶系统(dual
‑
recombinase system，drs)用于在小鼠中在kras
g12d
驱动的自发pdac的背景下，在肌成纤维细胞或癌细胞中特异性地实现col1α1的遗传消融。令人感兴趣地，α平滑肌肌动蛋白(αsma)表达肌成纤维细胞中的col1缺失导致pdac进展加速和动物死亡，而pdx1谱系癌细胞中的col1α1缺失导致pdac发育减缓和存活延长。与由成纤维细胞产生的col1异三聚体(α1/α2/α1)相反，癌症来源col1是独特的同三聚体(α1)3。col1的这些不同结构(同三聚体与异三聚体)导致了癌细胞的独特行为。
[0048]
pdac的当前遗传改造小鼠模型(gemm)，例如经典的kpc(lsl
‑
kras
g12d/
；trp53
r172h/
或trp53
loxp/loxp
；pdx1
‑
cre)模型，提供了模仿人pdac临床情况的有价值的平台，并且为针对pdac及其治疗的研究做出了巨大贡献(hingorani et al.,2005)。常规的kpc模型已广泛用于与癌细胞中的条件性敲除(侧翼为loxp位点)基因的遗传消融(使用相同的胰腺特异性cre，例如pdx1
‑
cre或p48
‑
cre)或者与基因的全身敲除(ko)相组合。然而，由于通用的cre
‑
loxp重组机制，在这些gemm中的基质细胞亚群(例如肌成纤维细胞或免疫细胞)中实现细胞类型特异性的遗传操作仍然是不可能的。而且，还不可能建立包含具有ko致命性的那些基因(例如编码i型胶原蛋白α1链的col1a1)的全身ko的kpc模型(lohler et al.,1984)。因此，没有使一种或更多种基质细胞来源中的col1能够进行功能性ko以测试col1的来源和贡献的pdac gemm，尤其是考虑到col1是pdac结缔组织形成和微环境的必需组分，并且是pdac结缔组织形成和微环境中最丰富的蛋白质。
[0049]
为了克服pdac gemm中的这样的限制，最近开发了整合cre
‑
loxp和flp
‑
frt系统二者的下一代双重组酶系统(schonhuber et al.,2014)。该drs首次允许在pdac中缺失col1，以便在功能上阐明在致癌性kras诱导的pdac的情况下由特定细胞群(例如肌成纤维细胞或癌细胞)产生的col1的特定作用。
[0050]
由于col1α1对所有col1纤维都是必不可少的事实(因为单独的col1α2不能产生任何形式的col1纤维，无论同三聚体或异三聚体)，因此选择col1α1作为col1遗传消融的靶标。drs用于在αsma谱系活化的psc(fsf
‑
kras
g12d/
；pdx1
‑
flp；αsma
‑
cre；col1a1
loxp/loxp
)或在pdx1谱系癌细胞(fsf
‑
kras
g12d/
；pdx1
‑
flp；pdx1
‑
cre；col1a1
loxp/loxp
)中特异性地实现col1的遗传消融。同时，col1在使用具有纯合p53丧失的更敏锐drs模型的αsma谱系活化的psc(fsf
‑
kras
g12d/
；trp53
frt/frt
；pdx1
‑
flp；αsma
‑
cre；col1a1
loxp/loxp
)中以及使用同样具有纯合p53丧失的常规的基于cre
‑
loxp的kpc模型的pdx1谱系癌细胞(lsl
‑
kras
g12d/
；trp53
loxp/loxp
；pdx1
‑
cre；col1a1
loxp/loxp
)中耗竭。通过直接比较这些pdac gemm的表型，确定了pdac微环境中的col1的细胞来源和独特贡献。panin/pdac开发通过αsma谱系活化的psc中的col1的遗传消融而加速，但通过pdx1谱系癌细胞中的col1消融而延迟。这些结果强调了活化的psc来源col1的肿瘤抑制功能，以及癌细胞来源col1的肿瘤保护功能。
[0051]
使用胰腺癌作为一个实例，表明致病性胶原蛋白由癌细胞而不是肌成纤维细胞产生。癌细胞制造的胶原蛋白i是称为α1同三聚体的变体，而由肌成纤维细胞制造的胶原蛋白i是非致病性的，帮助抑制pdac，并且是α1/α2/α1异三聚体。同三聚体对蛋白酶和酶具有抗性，并保留在癌细胞周围，有助于其生长和侵袭。同三聚体结合受体(例如ddr1)，以诱导促生存和促致癌信号。通过小分子或抗体抑制ddr1和同三聚体形成或其诱导促致癌信号的能力导致控制pdac和抑制肿瘤生长。破坏同三聚体形成的癌细胞中分子伴侣的破坏也将控制pdac。对对于同三聚体具有特异性的胶原蛋白1交联酶的抑制可用于控制肿瘤生长。产生自体t细胞或者自体或同种异体nk细胞中的α1(i)胶原蛋白同三聚体特异性car
‑
t构建体作为免疫治疗方法将导致根除早期和晚期胰腺肿瘤。通过一个臂靶向α1(i)胶原蛋白同三聚体而通过另一个臂靶向cd3的双特异性抗体的产生，将导致通过t细胞进行的免疫靶向以杀伤癌细胞。
[0052]
i.抗体及其产生
[0053]“分离的抗体”是已经从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染物组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白性溶质。在一些特定实施方案中，将抗体纯化至：(1)按抗体重量计高于95％(如通过劳里法(lowry method)确定)，并且最特别地按重量计大于99％；(2)通过使用旋杯测序仪(spinning cup sequenator)足以获得n端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)使用考马斯蓝(coomassie blue)或银染在还原或非还原条件下通过sds
‑
page鉴定的
institutes of health,bethesda,md.(1991))；和/或来自“高变环”的那些残基(例如，当根据chothia编号体系进行编号时，v
l
中第24至34位(l1)、第50至56位(l2)和第89至97位(l3)残基，以及v
h
中第26至32位(h1)、第52至56位和第95至101位(h3)；chothia and lesk,j.mol.biol.196:901
‑
917(1987))；和/或来自“高变环”/cdr的那些残基(例如，当根据imgt编号体系进行编号时，v
l
中第27至38位(l1)、第56至65位(l2)和第105至120位(l3)残基，以及v
h
中第27至38位(h1)、第56至65位(h2)和第105至120位(h3)；lefranc,m.p.et al.nucl.acids res.27:209
‑
212(1999)，ruiz,m.et al.nucl.acids res.28:219
‑
221(2000))。任选地，抗体在以下位点中的一处或更多处具有对称插入：当根据aho进行编号时，v
l
中的第28位、第36位(l1)，第63位、第74至75位(l2)和第123位(l3)，以及v
sub
h中的第28位、第36位(h1)，第63位、第74至75位(h2)和第123位(h3)；honneger,a.and plunkthun,a.j.mol.biol.309:657
‑
670(2001))。
[0058]“种系核酸残基”意指天然存在于编码恒定或可变区的种系基因中的核酸残基。“种系基因”是存在于生殖细胞(即，注定要变成卵或在精子中的细胞)中的dna。“种系突变”是指在单一细胞阶段在生殖细胞或合子中发生的特定dna的可遗传变化，并且当传递至后代时，这样的突变会被并入在身体的每个细胞中。种系突变与在单个体细胞中获得的体细胞突变相反。在一些情况下，将使编码可变区的种系dna序列中的核苷酸突变(即，体细胞突变)，并用不同的核苷酸替代。
[0059]
本文中使用的术语“单克隆抗体”是指获自基本上均质的抗体群体的抗体，即，除可能以少量存在的可能天然存在的突变之外，包含该群体的单独抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，是针对单一抗原位点的。此外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除其特异性之外，单克隆抗体的优点在于其可在不受其他抗体污染下合成。修饰语“单克隆”不应理解为要求通过任何特定方法产生抗体。例如，可用于本公开内容的单克隆抗体可通过首先由kohler et al.,nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可在对抗原特异性b细胞(响应于感染或免疫接种的抗原特异性浆母细胞)进行单一细胞分选，或在从大批分选的抗原特异性集合中的单一细胞中捕获连接的重链和轻链之后，在细菌、真核动物或植物细胞中使用重组dna方法来制造(参见，例如，美国专利no.4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用描述于例如clackson et al.,nature,352:624
‑
628(1991)和marks et al.,j.mol.biol.,222:581
‑
597(1991)中的技术从噬菌体抗体文库中分离。
[0060]
a.一般方法
[0061]
将理解的是，与同三聚体i型胶原蛋白结合的单克隆抗体将具有多种应用。这些包括产生诊断试剂盒，其用于检测和诊断癌症，以及用于治疗癌症。在这些情况下，可将这样的抗体与诊断或治疗剂连接，将其用作竞争性测定中的捕获剂或竞争剂，或者在无与其连接的另外的试剂的情况下将其单独使用。可使抗体突变或对其进行修饰，如下文进一步讨论。用于制备和表征抗体的方法是本领域公知的(参见，例如，antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,1988；美国专利4,196,265)。
[0062]
用于产生单克隆抗体(mab)的方法通常沿着与用于制备多克隆抗体的那些路线相同的路线开始。这两种方法的第一步是对合适的宿主进行免疫接种或鉴定由于之前的自然感染或用经许可的或实验性疫苗进行疫苗接种而免疫接种的对象。如本领域中公知的，用
于免疫接种的给定组合物的免疫原性可不同。因此，通常有必要加强宿主的免疫系统，如可通过使肽或多肽免疫原与载体偶联来实现。示例性且优选的载体是钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，klh)和牛血清白蛋白(bovine serum albumin，bsa)。其他白蛋白例如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可用作载体。用于使多肽与载体蛋白缀合的方式是本领域中公知的，并且包括戊二醛、间马来酰亚胺基苯甲酰基
‑
n
‑
羟基琥珀酰亚胺酯(m
‑
maleimidobencoyl
‑
n
‑
hydroxysuccinimide ester)、碳二亚胺和双
‑
重氮联苯胺(bis
‑
biazotized benzidine)。同样如本领域中公知的，特定免疫原组合物的免疫原性可通过使用称为佐剂的免疫应答的非特异性刺激剂来增强。动物中示例性且优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(包含经杀伤结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)的免疫应答的非特异性刺激剂)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂，以及在人中包括明矾、cpg、mfp59以及免疫刺激分子的组合(“佐剂系统”，例如as01或as03)。诱导癌症特异性b细胞的另外的接种实验形式也是可能的，包括纳米粒疫苗，或者作为dna或rna基因在物理递送系统(例如脂质纳米粒或金生物珠上)中递送，以及以针、基因枪、经皮电穿孔装置递送的基因编码抗原。抗原基因还可如通过复制可行或缺陷型病毒载体所编码的进行携带，所述病毒载体例如腺病毒、腺相关病毒、痘病毒、疱疹病毒或甲病毒复制子，或者作为替代地病毒样颗粒。
[0063]
用于产生多克隆抗体的免疫原组合物的量根据免疫原的性质以及用于免疫接种的动物而变化。可使用多种途径来施用免疫原(皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内)。可通过在免疫接种之后的不同点对经免疫接种的动物采血来监测多克隆抗体的产生。也可给予第二、加强注射。重复加强免疫和滴定过程直到达到合适的效价。当获得期望的免疫原性水平时，可对经免疫接种的动物取血，分离血清并储存，和/或可将动物用于产生mab。
[0064]
在免疫接种之后，选择具有产生抗体之潜力的体细胞，特别是b淋巴细胞(b细胞)用于mab产生方案。这些细胞可从活检的脾、淋巴结、扁桃体或腺样体、骨髓穿刺或活检、来自黏膜器官(例如肺或gi道)的组织活检，或者从循环血液中获得。然后，使来自经免疫接种动物或免疫人之抗体产生b淋巴细胞与永生化骨髓瘤细胞的细胞融合，其通常是与经免疫接种动物为同一物种的永生化骨髓瘤细胞或者是人或人/小鼠嵌合细胞。适合用于产生杂交瘤的融合程序的骨髓瘤细胞系优选地不产生抗体、具有高融合效率且具有酶缺陷，这随后使其不能在仅支持期望的融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择培养基中生长。如本领域技术人员已知的，可使用许多骨髓瘤细胞中的任一种。hmma2.5细胞或mfp
‑
2细胞是这样的细胞的特别可用的实例。
[0065]
用于产生抗体产生脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂合体的方法通常包括：在存在促进细胞膜融合的一种或更多种试剂(化学或电学)的情况下使体细胞与骨髓瘤细胞以2:1的比例混合，但是该比例可分别为约20:1至约1:1而不等。在一些情况下，用爱泼斯坦巴尔病毒(epstein barr virus，ebv)转化人b细胞作为初始步骤提高了b细胞尺寸，从而增强与相对较大尺寸骨髓瘤细胞的融合。通过ebv的转化效率通过在转化培养基中使用cpg和chk2抑制剂药物增强。或者，可通过与表达cd40配体(cd154)的经转染细胞系在包含另外的可溶性因子(例如il
‑
21和人b细胞活化因子(b cell activating factor，baff，tnf超家族的ii型成员)的培养基中共培养来使人b细胞活化。已经描述了使用仙台病毒(sendai virus)进行的融合方法以及使用聚乙二醇(peg)(例如37％(v/v)peg)的那些。电学上诱导融合方法的使用也是合适的，并且存在更好效率的过程。融合程序通常会在约1
×
10
‑6至1
×
10
‑8的低频率下产生可生存的杂合体，但是采用优化程序，人们可获得接近200分之1的融合效率。然而，融合的相对低效率并不造成问题，因为通过在选择培养基中培养，活的融合杂合体与亲本未融合细胞(特别是在正常情况下将持续无限分裂的未融合骨髓瘤细胞)区分开来。选择培养基通常是在组织培养基中包含阻断核苷酸从头合成的试剂的培养基。示例性且优选的试剂是氨基蝶呤、甲氨蝶呤和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻断嘌呤和嘧啶二者的从头合成，而重氮丝氨酸仅阻断嘌呤合成。当使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤时，培养基补充有次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸的来源(hat培养基)。当使用重氮丝氨酸时，培养基补充有次黄嘌呤。如果b细胞来源是ebv转化的人b细胞系，则添加哇巴因(ouabain)以清除未与骨髓瘤融合的ebv转化系。
[0066]
优选的选择培养基是hat或具有哇巴因的hat。只有能够进行核苷酸补救途径的细胞才能在hat培养基中存活。骨髓瘤细胞在补救途径的关键酶(例如，次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthine phosphoribosyl transferase，hprt))中有缺陷，因此其不能存活。b细胞可进行该途径，但是其在培养中具有有限的寿命并且通常在约2周内死亡。因此，只有可在选择培养基中存活的细胞才是由骨髓瘤和b细胞形成的那些杂合体。当用于融合的b细胞的来源是ebv转化的b细胞系时，此时还可将哇巴因用于杂合体的药物选择，因为ebv转化的b细胞对药物杀伤敏感，而选择所使用的骨髓瘤配偶体对哇巴因具有抗性。
[0067]
培养提供了从中选择特定杂交瘤的杂交瘤群体。通常如下进行杂交瘤的选择：通过在微量滴定板中进行单克隆稀释来培养细胞，随后针对期望反应性测试单个克隆上清液(在约2至3周之后)。测定应灵敏、简单并且迅速，例如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬菌斑测定、斑点免疫结合测定等。然后将选择的杂交瘤连续稀释或通过流式细胞术分选进行单一细胞分选，并克隆到单独抗体产生细胞系中，所述克隆然后可无限增殖以提供mab。细胞系可以以两种基本方式用于mab产生。可将杂交瘤样品注射(通常注射到腹膜腔中)到动物(例如，小鼠)中。任选地，在注射之前将动物用烃，特别是油(例如，姥鲛烷(四甲基十五烷))致敏(prime)。当以这种方式使用人杂交瘤时，注射免疫缺损的小鼠(例如scid小鼠)是最佳的，以防止肿瘤排斥。经注射动物出现分泌由融合细胞杂合体产生的特异性单克隆抗体的肿瘤。然后，可放出动物的体液例如血清或腹水以提供高浓度mab。也可在体外培养单个细胞系，其中mab自然地分泌到培养基中，从中可容易地获得高浓度的mab。或者，可在体外使用人杂交瘤细胞系以在细胞上清液中产生免疫球蛋白。可将细胞系调整为在不含血清的培养基中生长，以优化回收高纯度人单克隆免疫球蛋白的能力。
[0068]
如果期望的话，以任一种方式产生的mab可进一步使用过滤、离心和多种色谱方法(例如fplc或亲和色谱)进行纯化。本公开内容的单克隆抗体的片段可通过以下方法由经纯化的单克隆抗体获得：其包括用酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化，和/或通过经化学还原切割二硫键。或者，本公开内容所涵盖的单克隆抗体片段可使用自动化肽合成仪合成。
[0069]
还在考虑之中的是，可使用分子克隆方法来产生单克隆抗体。可使用顺磁珠选择或流式细胞术分选对标记有目的抗原的单一b细胞进行物理分选，然后可从单一细胞中分离rna，并通过rt
‑
pcr扩增抗体基因。或者，可将抗原特异性的大批分选的细胞群分离成微囊泡，以及使用重链和轻链扩增子的物理连接，或者从囊泡中对重链和轻链基因进行通用条码编码，从单一细胞中回收匹配的重链和轻链可变基因。来自单一细胞的匹配的重链和轻链基因也可通过使用带有rt
‑
pcr引物和用于以一个条码/细胞标记转录物的条码的细胞
穿透纳米粒处理细胞从抗原特异性b细胞群体中获得。抗体可变基因也可通过杂交瘤系的rna提取来分离，通过rt
‑
pcr获得抗体基因，并将其克隆到免疫球蛋白表达载体中。或者，由从细胞系分离的rna制备组合的免疫球蛋白噬菌粒文库，并使用病毒抗原通过淘选选择表达合适抗体的噬菌粒。这种方法相对于常规杂交瘤技术的优点是：可在单轮中产生和筛选多达约104倍的抗体，并且通过h链和l链组合产生了新的特异性，这进一步提高了发现合适抗体的机会。
[0070]
教导产生可用于本公开内容的抗体的其他美国专利(各自通过引用并入本文)包括美国专利5,565,332，其描述了使用组合方法产生嵌合抗体；美国专利4,816,567，其描述了重组免疫球蛋白制备；以及美国专利4,867,973，其描述了抗体
‑
治疗剂缀合物。
[0071]
b.本公开内容的抗体
[0072]
根据本公开内容的抗体可在第一种情况下通过其结合特异性来定义。通过使用本领域技术人员公知的技术评估给定抗体的结合特异性/亲和力，本领域技术人员可确定这样的抗体是否落入本发明权利要求书的范围内。例如，给定抗体结合的表位可由位于抗原分子内的3个或更多个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个)氨基酸的单一连续序列组成(例如，结构域中的线性表位)。或者，表位可由位于抗原分子内的多个不连续的氨基酸(或氨基酸序列)组成(例如，构象性表位)。
[0073]
本领域普通技术人员已知的多种技术可用于确定抗体是否“与多肽或蛋白质内的一个或更多个氨基酸相互作用”。一些示例性技术包括例如常规的交叉阻断测定，例如描述于antibodies,harlow and lane(cold spring harbor press,cold spring harbor,n.y.)中的那些。交叉阻断可在多种结合测定(例如elisa、生物层干涉术或表面等离振子体共振)中测量。另一些方法包括丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(reineke(2004)methods mol.biol.248:443
‑
63)、肽切割分析、使用单一颗粒重建的高分辨率电子显微术技术、cryoem或层析成像(tomography)、晶体学研究和nmr分析。另外，可采用方法，例如抗原的表位切除、表位提取和化学修饰(tomer(2000)prot.sci.9:487
‑
496)。可用于鉴定抗体与之相互作用的多肽内氨基酸的另一种方法是通过质谱检测氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换法涉及氘标记目的蛋白质，随后将抗体与经氘标记的蛋白质结合。接下来，将蛋白质/抗体复合体转移至水，并且与不属于界面一部分的氨基酸中的可交换质子相比，受抗体复合体保护的氨基酸中的可交换质子以更慢的速率经历氘至氢反向交换。作为结果，与不包含在界面中的氨基酸相比，形成蛋白质/抗体界面的一部分的氨基酸可保留氘，并因此表现出相对较高的质量。在抗体解离之后，对靶蛋白进行蛋白酶切割和质谱分析，从而揭示对应于抗体与之相互作用的特定氨基酸的经氘标记的残基。参见，例如，ehring(1999)analytical biochemistry 267:252
‑
259；engen and smith(2001)anal.chem.73:256a
‑
265a。
[0074]
术语“表位”是指抗原上b和/或t细胞对其应答的位点。b细胞表位可由蛋白质的三级折叠并列的连续氨基酸或非连续氨基酸二者形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丧失。表位通常以独特的空间构象包含至少3个，并且更通常至少5或8至10个氨基酸。在此，优选的表位是在同三聚体i型胶原蛋白中存在但在异三聚体i型胶原蛋白中不存在的构象性表位。
[0075]
修饰辅助谱分析(modification
‑
assisted profiling，map)(也称为基于抗原结构的抗体谱分析(antigen structure
‑
based antibody profiling，asap))是根据每种抗
是指至少约20个连续位置(通常为30至约75、40至约50个)的区段，其中在将两个序列最佳比对之后，可将序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。
[0081]
用于比较的序列的最佳比对可使用生物信息学软件的lasergene套件中的megalign程序(dnastar，inc.，madison，wis.)使用默认参数来进行。该程序体现了描述于以下参考文献中的数种比对方案：dayhoff,m.o.(1978)a model of evolutionary change in proteins
‑‑
matrices for detecting distant relationships.in dayhoff,m.o.(ed.)atlas of protein sequence and structure,national biomedical research foundation,washington d.c.vol.5,suppl.3,pp.345
‑
358；hein j.(1990)unified approach to alignment and phylogeny pp.626
‑
645methods in enzymology vol.183,academic press,inc.,san diego,calif.；higgins,d.g.and sharp,p.m.(1989)cabios 5:151
‑
153；myers,e.w.and muller w.(1988)cabios 4:11
‑
17；robinson,e.d.(1971)comb.theor 11:105；santou,n.nes,m.(1987)mol.biol.evol.4:406
‑
425；sneath,p.h.a.and sokal,r.r.(1973)numerical taxonomy
‑‑
the principles and practice of numerical taxonomy,freeman press,san francisco,calif.；wilbur,w.j.and lipman,d.j.(1983)proc.natl.acad.,sci.usa 80:726
‑
730。
[0082]
或者，用于比较的序列的最佳比对可通过以下来进行：smith and waterman(1981)add.apl.math 2:482的局部同一性算法、通过needleman and wunsch(1970)j.mol.biol.48:443的同一性比对算法、通过pearson and lipman(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85:2444的检索相似性方法、通过这些算法(wisconsin遗传学软件包中的gap、bestfit、blast、fasta和tfasta,genetics computer group(gcg),575science dr.,madison,wis.)的计算机实施或通过检查。
[0083]
适合于确定序列同一性和序列相似性的百分比的算法的一个特定实例是blast和blast 2.0算法，其分别描述于altschul et al.(1977)nucl.acids res.25:3389
‑
3402和altschul et al.(1990)j.mol.biol.215:403
‑
410中。blast和blast 2.0可例如与本文中所述的参数一起使用，以确定本公开内容的多核苷酸和多肽的序列同一性百分比。用于进行blast分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information)公开获得。抗体序列的重排性质和每个基因的可变长度需要多轮blast检索以寻找单一抗体序列。而且，不同基因的人工组装是困难且容易出错的。序列分析工具igblast(万维网网址为ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)鉴定与种系v、d和j基因的匹配，重排接界的细节，ig v结构域框架区和互补决定区的描述。igblast可分析核苷酸或蛋白质序列，并且可分批处理序列，并允许同时对种系基因数据库和其他序列数据库进行检索，以使可能错过最佳匹配的种系v基因的机会最小化。
[0084]
在一个举例说明性实例中，对于核苷酸序列，可使用参数m(匹配残基对的奖励评分；总是>0)和n(错配残基的惩罚评分；总是<0)来计算累积评分。在以下情况下，将停止单词命中在每个方向上的扩展：累积比对评分从其最大实现值下降了量x；累积评分变为零或更低，由于一个或更多个负评分残基比对的累积；或者到达任一序列的末端。blast算法参数w、t和x确定比对的灵敏度和速度。blastn程序(对于核苷酸序列)默认使用字长(w)为11，以及期望(e)为10，以及blosum62评分矩阵(参见henikoff and henikoff(1989)proc.natl.acad.sci.usa 89:10915)比对，(b)为50，期望(e)为10，m＝5，n＝
‑
4，以及对两
therapeutic protein in vivo activities through glycoengineering,”nature biotechnol.21:414
‑
21；shields,r.l.et al.(2002)“lack of fucose on human igg n
‑
linked oligosaccharide improves binding to human fcgamma riii and antibody
‑
dependent cellular toxicity,”j.biol.chem.277(30):26733
‑
26740)。
[0088]
可产生具有经改造序列或糖基化状态的衍生抗体或抗体片段，以赋予在以下中的优选的活性水平：抗体依赖性细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞吞噬(adcp)、抗体依赖性嗜中性粒细胞吞噬(adnp)或抗体依赖性补体沉积(adcd)功能，如通过基于珠的或基于细胞的测定或者在动物模型中进行的体内研究所测量的。
[0089]
衍生抗体或抗体片段可通过使用本领域技术人员已知的技术进行化学修饰来修饰，所述技术包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、制剂、衣霉素代谢合成等。在一个实施方案中，抗体衍生物将具有与亲本抗体相似或相同的功能。在另一个实施方案中，相对于亲本抗体，抗体衍生物将表现出改变的活性。例如，与亲本抗体相比，衍生抗体(或其片段)可更紧密地与其表位结合或对蛋白水解更具抗性。
[0090]
c.抗体序列的改造
[0091]
在多个实施方案中，可出于多种原因，例如改善表达、改善交叉反应性或降低脱靶结合而选择对所鉴定抗体的序列进行改造。经修饰抗体可通过本领域技术人员已知的任何技术来制备，所述技术包括通过标准分子生物技术表达或多肽的化学合成。用于重组表达的方法在本文件的其他地方提出。以下是用于抗体改造的相关目标技术的一般讨论。
[0092]
可培养杂交瘤，然后裂解细胞，并提取总rna。可使用随机六聚体和rt一起来产生rna的cdna拷贝，并随后使用预期扩增所有人可变基因序列的pcr引物的多重混合物进行pcr。可将pcr产物克隆到pgem
‑
t easy载体中，然后使用标准载体引物通过自动化dna测序进行测序。可使用从杂交瘤上清液收集并使用g蛋白柱通过fplc纯化的抗体进行结合和中和的测定。
[0093]
可通过以下产生重组全长igg抗体：将来自克隆载体的重链和轻链fv dna亚克隆到igg质粒载体中，将其转染到293(例如freestyle)细胞或cho细胞中，并可从293或cho细胞上清液中收集和纯化抗体。另一些合适的宿主细胞系统包括细菌(例如大肠杆菌(e.coli))、昆虫细胞(s2、sf9、sf29、high five)、植物细胞(例如具有或不具有针对类人聚糖进行改造的烟草)、藻类或多种非人转基因环境，例如小鼠、大鼠、山羊或牛。
[0094]
还预期了出于随后抗体纯化和出于宿主处理二者目的的编码抗体的核酸的表达。抗体编码序列可以是rna，例如天然rna或经修饰rna。经修饰rna预期了赋予mrna以提高的稳定性和低免疫原性，从而促进治疗上重要的蛋白质的表达的某些化学修饰。例如，就翻译能力而言，n1
‑
甲基
‑
假尿苷(n1mψ)优于数种其他核苷修饰及其组合。除关闭免疫/eif2α磷酸化依赖性翻译的抑制之外，并入的n1mψ核苷酸还通过提高mrna上核糖体停顿和密度来显著改变翻译过程的动态。经修饰mrna的核糖体负载提高通过促进同一mrna上的核糖体再循环或从头重新核糖体募集，使它们更易于起始。在接种rna之后，这样的修饰可用于增强体内抗体表达。rna，无论是天然的还是经修饰的，均可作为裸rna或在递送载剂(例如脂质纳米粒)中递送。
[0095]
或者，可将编码抗体的dna用于相同目的。将dna包含在含有在为其设计的宿主细胞中具有活性的启动子的表达盒中。表达盒有利地包含在可复制载体，例如常规质粒或微
载体中。载体包括病毒载体，例如预期了痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、腺相关病毒和慢病毒。还预期了编码抗体基因的复制子，例如基于vee病毒或辛德毕斯病毒(sindbis virus)的甲病毒复制子。这样的载体的递送在期望体内表达时可通过针通过肌内、皮下或皮内途径，或者通过经皮电穿孔来进行。
[0096]
与最终cgmp制造过程在相同宿主细胞和细胞培养过程中产生的抗体的迅速可用性具有降低过程开发计划的持续时间的潜力。lonza已经开发了使用在cdacf培养基中培养的合并转染子用于在cho细胞中迅速产生少量(多至50g)抗体的一般方法。尽管比真正的瞬时系统稍慢，但是其优点包括更高的产物浓度和与生产细胞系使用相同的宿主和过程。在一次性生物反应器中表达模型抗体之gs
‑
cho库的生长和生产力的实例为：在以补料分批模式进行的一次性袋状生物反应器培养(5l工作体积)中，在转染后9周内达到了2g/l的收获抗体浓度。
[0097]
抗体分子将包含例如通过mab的蛋白水解切割产生的片段(例如f(ab’)、f(ab’)2)或者例如可通过重组方式产生的单链免疫球蛋白。f(ab’)抗体衍生物是单价的，而f(ab’)2抗体衍生物是二价的。在一个实施方案中，这样的片段可彼此组合，或者与其他抗体片段或受体配体组合以形成“嵌合”结合分子。明显地，这样的嵌合分子可包含能够与同一分子的不同表位结合的取代基。
[0098]
在一些相关实施方案中，抗体是所公开抗体的衍生物，例如，包含与所公开抗体中cdr序列相同的cdr序列的抗体(例如，嵌合抗体或cdr接枝抗体)。或者，可希望进行修饰，例如向抗体分子中引入保守变化。在进行这种变化时，可预期氨基酸的亲水指数(hydropathic index)。氨基酸亲水指数在赋予蛋白质以相互作用生物学功能中的重要性是本领域中通常了解的。已接受的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，其转而限定了蛋白质与另一些分子(例如酶、底物、受体、dna、抗体、抗原等)的相互作用。
[0099]
本领域中还应理解的是，可基于亲水性有效地进行类似氨基酸的置换。美国专利4,554,101(通过引用并入本文)声称：蛋白质的最大局部平均亲水性(如受其邻近氨基酸的亲水性支配)与蛋白质的生物学特性相关。如美国专利4,554,101中所详述的，已向氨基酸残基分配了以下亲水性值：碱性氨基酸：精氨酸( 3.0)、赖氨酸( 3.0)和组氨酸(
‑
0.5)；酸性氨基酸：天冬氨酸( 3.0
±
1)、谷氨酸( 3.0
±
1)、天冬酰胺( 0.2)和谷氨酰胺( 0.2)；亲水性非离子氨基酸：丝氨酸( 0.3)、天冬酰胺( 0.2)、谷氨酰胺( 0.2)和苏氨酸(
‑
0.4)；含硫氨基酸：半胱氨酸(
‑
1.0)和甲硫氨酸(
‑
1.3)；疏水性非芳族氨基酸：缬氨酸(
‑
1.5)、亮氨酸(
‑
1.8)、异亮氨酸(
‑
1.8)、脯氨酸(
‑
0.5
±
1)、丙氨酸(
‑
0.5)和甘氨酸(0)；疏水性芳族氨基酸：色氨酸(
‑
3.4)、苯丙氨酸(
‑
2.5)和酪氨酸(
‑
2.3)。
[0100]
应理解的是，氨基酸可被置换为具有类似亲水性的另一氨基酸，并且产生在生物学或免疫学上修饰的蛋白质。在这样的变化中，优选亲水性值在
±
2内的氨基酸的置换，特别优选在
±
1内的那些，并且甚至更特别优选在
±
0.5内的那些。
[0101]
如上文概括的，氨基酸置换通常基于氨基酸侧链取代基的相对类似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等。预期多个前述特征的示例性置换是本领域技术人员公知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
[0102]
本公开内容还预期了同种型修饰。通过修饰fc区域以具有不同同种型，可实现不同功能。例如，改变为igg1可提高抗体依赖性细胞细胞毒性，转换为a类可改善组织分布，以及转换为m类可改善价位。
[0103]
作为替代地或另外地，将氨基酸修饰与改变il
‑
23p19结合分子的fc区的c1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)功能的一种或更多种另外的氨基酸修饰组合在一起可以是有用的。特别令人感兴趣的结合多肽可以是与c1q结合并显示出补体依赖性细胞毒性的结合多肽。可修饰具有预先存在的c1q结合活性，任选地还具有介导cdc能力的多肽，使得增强这些活性中的一种或两种。改变c1q和/或修饰其补体依赖性细胞毒性功能的氨基酸修饰描述于例如wo/0042072中，其通过引用并入于此。
[0104]
可例如通过修饰c1q结合和/或fcγr结合并由此改变cdc活性和/或adcc活性来设计具有改变的效应物功能的抗体的fc区。“效应物功能”负责激活或减弱生物活性(例如，在对象中)。效应物功能的一些实例包括但不限于：c1q结合；补体依赖性细胞毒性(cdc)；fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)；吞噬；下调细胞表面受体(例如b细胞受体bcr)等。这样的效应物功能可能需要待与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合的fc区，并可使用多种测定(例如fc结合测定、adcc测定、cdc测定等)进行评估。
[0105]
例如，可产生抗体的具有改善的c1q结合和改善的fcγriii结合(例如，具有改善的adcc活性和改善的cdc活性二者)的变体fc区。或者，如果期望降低或消除效应物功能，则可将变体fc区改造为具有降低的cdc活性和/或降低的adcc活性。在另一些实施方案中，可提高这些活性中的仅一种，并且任选地，另一种活性也降低(例如，产生具有改善的adcc活性，但是降低的cdc活性的fc区变体，反之亦然)。
[0106]
fcrn结合。还可引入fc突变以及对其进行改造，以改变其与新生fc受体(fcrn)的相互作用并改善其药动学特性。已经描述了具有与fcrn的结合改善的人fc变体的集合。人igg1上fcγri、fcγrii、fcγriii和fcrn的结合位点的高分辨率映射以及具有与fcγr的结合改善的igg1变体的设计(j.biol.chem.276:6591
‑
6604)。已知可导致半衰期提高的许多方法，包括可通过包括以下的技术产生的氨基酸修饰：丙氨酸扫描诱变、随机诱变以及评估与新生fc受体(fcrn)结合和/或体内行为的筛选。诱变之后的计算策略也可用于选择氨基酸突变中之一以进行突变。
[0107]
因此，本公开内容提供了具有与fcrn的最佳结合的抗原结合蛋白的变体。在一个特定实施方案中，抗原结合蛋白的所述变体在所述抗原结合蛋白的fc区中包含至少一个氨基酸修饰，其中与所述亲本多肽相比，所述修饰选自fc区的第226位、第227位、第228位、第230位、第231位、第233位、第234位、第239位、第241位、第243位、第246位、第250位、第252位、第256位、第259位、第264位、第265位、第267位、第269位、第270位、第276位、第284位、第285位、第288位、第289位、第290位、第291位、第292位、第294位、第297位、第298位、第299位、第301位、第302位、第303位、第305位、第307位、第308位、第309位、第311位、第315位、第317位、第320位、第322位、第325位、第327位、第330位、第332位、第334位、第335位、第338位、第340位、第342位、第343位、第345位、第347位、第350位、第352位、第354位、第355位、第356位、第359位、第360位、第361位、第362位、第369位、第370位、第371位、第375位、第378位、第380位、第382位、第384位、第385位、第386位、第387位、第389位、第390位、第392位、第393位、第394位、第395位、第396位、第397位、第398位、第399位、第400位、第401 403位、第
404位、第408位、第411位、第412位、第414位、第415位、第416位、第418位、第419位、第420位、第421位、第422位、第424位、第426位、第428位、第433位、第434位、第438位、第439位、第440位、第443位、第444位、第445位、第446位和第447位，其中fc区中氨基酸的编号是kabat中eu索引的编号。在本公开内容的另一方面中，修饰是m252y/s254t/t256e。
[0108]
另外，多个出版物描述了用于通过将fcrn结合多肽引入到分子中或者通过将分子与保留了fcrn结合亲和力但针对其他fc受体的亲和力已大大降低的抗体融合，或与抗体的fcrn结合结构域融合来获得半衰期被修饰的生理活性分子的方法。
[0109]
衍生抗体可用于改变亲本抗体在哺乳动物(特别是在人中)的半衰期(例如血清半衰期)。这样的改变可导致半衰期大于15天，优选大于20天、大于25天、大于30天、大于35天、大于40天、大于45天、大于2个月、大于3个月、大于4个月或大于5个月。本公开内容的抗体或其片段在哺乳动物中，优选在人中的半衰期提高导致所述抗体或抗体片段在哺乳动物中的更高的血清效价，并因此降低了所述抗体或抗体片段的施用频率和/或降低了待施用的所述抗体或抗体片段的浓度。具有提高的体内半衰期的抗体或其片段可通过本领域技术人员已知的技术来产生。例如，具有提高的体内半衰期的抗体或其片段可通过对被鉴定为参与fc结构域与fcrn受体之间的相互作用的氨基酸残基进行修饰(例如，置换、缺失或添加)来产生。
[0110]
beltramello et al.(2010)先前报道了通过产生其中用丙氨酸残基置换ch2结构域的1.3和1.2位的亮氨酸残基(根据c结构域的imgt独特编号)来使mab(由于其倾向于增强登革病毒(dengue virus)感染)中和的修饰。该修饰(也称为“lala”突变)消除了与fcγri、fcγrii和fcγriiia结合的抗体。比较变体和未经修饰的重组mab的其中和和增强四种登革病毒血清型的感染的能力。lala变体保留了与未经修饰的mab相同的中和活性，但完全没有增强活性。因此，在当前公开的抗体的情况下预期了这种性质的lala突变。
[0111]
糖基化改变。本公开内容的一个特定实施方案是包含无唾液酸、半乳糖或岩藻糖的基本上均质的聚糖的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其二者可分别与重链或轻链恒定区连接。前述基本上均质的聚糖可与重链恒定区共价连接。
[0112]
本公开内容的另一个实施方案包含具有新fc糖基化模式的mab。分离的单克隆抗体或其抗原结合片段存在于以gngn或g1/g2糖型表示的基本上均质的组合物中。fc糖基化在治疗性mab的抗病毒和抗癌特性中发挥重要作用。本公开内容与示出了在体外无岩藻糖的抗hiv mab的抗慢病毒细胞介导的病毒抑制提高的最近研究一致。具有缺乏核芯岩藻糖的均质聚糖的本公开内容的该实施方案显示针对特定病毒的保护提高了高于两倍。消除核芯岩藻糖显著改善了自然杀伤(nk)细胞介导的mab的adcc活性，但显示对多形核细胞(polymorphonuclear cell，pmn)的adcc活性具有相反的作用。
[0113]
与不具有基本上均质的gngn糖型和具有含g0、g1f、g2f、gnf、gngnf或gngnfx糖型的相同抗体相比，包含由gngn或g1/g2糖型表示的基本上均质的组合物的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段表现出对fcγri和fcγriii的提高的结合亲和力。在本公开内容的一个实施方案中，所述抗体以1
×
10
‑8m或更小的kd从fcγri解离和以1
×
10
‑7m或更小的kd从fcγriii解离。
[0114]
fc区的糖基化通常是n
‑
连接或o
‑
连接的。n
‑
连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺
残基的侧链的连接。o
‑
连接糖基化是指糖n
‑
乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸(最通常为丝氨酸或苏氨酸)的连接，尽管也可使用5
‑
羟基脯氨酸或5
‑
羟基赖氨酸。用于将碳水化合物部分与天冬酰胺侧链肽序列酶促连接的识别序列是天冬酰胺
‑
x
‑
丝氨酸和天冬酰胺
‑
x
‑
苏氨酸，其中x是除脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，多肽中这些肽序列中任一个的存在均会产生潜在的糖基化位点。
[0115]
糖基化模式可例如通过缺失一个或更多个存在于多肽中的糖基化位点和/或添加一个或更多个不存在于多肽中的糖基化位点来改变。通过改变氨基酸序列以使其包含一个或更多个上述三肽序列，方便地实现了将糖基化位点添加至抗体的fc区(对于n
‑
连接的糖基化位点)。示例性的糖基化变体具有重链的残基asn 297的氨基酸置换。该改变也可通过向原始多肽的序列添加一个或更多个丝氨酸或苏氨酸残基或者用一个或更多个丝氨酸或苏氨酸残基置换原始多肽的序列来进行(对于o
‑
连接的糖基化位点)。另外，将asn 297改变为ala可去除糖基化位点之一。
[0116]
在某些实施方案中，抗体在表达β(1,4)
‑
n
‑
乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶iii(gnt iii)的细胞中表达，使得gnt iii将glcnac添加至il
‑
23p19抗体。用于以这样的方式产生抗体的方法提供于wo/9954342、wo/03011878、专利公开us 2003/0003097a1和umana et al.,nature biotechnology,17:176
‑
180,february 1999中。可使用基因组编辑技术(例如簇状规则间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，crispr))，将细胞系改变以增强或降低或消除某些翻译后修饰，例如糖基化。例如，crispr技术可用于在用于表达重组单克隆抗体的293或cho细胞中消除编码糖基化酶的基因。
[0117]
单克隆抗体蛋白质序列缺陷的消除。可改造从人b细胞获得的抗体可变基因序列，以增强其可制造性和安全性。潜在的蛋白质序列缺陷可通过检索与包含以下的位点相关的序列基序来鉴定：
[0118]
1)未配对的cys残基，
[0119]
2)n
‑
连接糖基化，
[0120]
3)asn脱酰胺化，
[0121]
4)asp异构化，
[0122]
5)sye截短，
[0123]
6)met氧化，
[0124]
7)trp氧化，
[0125]
8)n端谷氨酸，
[0126]
9)整合素结合，
[0127]
10)cd11c/cd18结合，或
[0128]
11)片段化。
[0129]
这样的基序可通过改变编码重组抗体的cdna的合成基因来消除。
[0130]
在开发治疗性抗体领域中的蛋白质改造工作清楚地揭示了某些序列或残基与溶解度差异相关(fernandez
‑
escamilla et al.,nature biotech.,22(10),1302
‑
1306,2004；chennamsetty et al.,pnas,106(29),11937
‑
11942,2009；voynov et al.,biocon.chem.,21(2),385
‑
392,2010)。文献中来自溶解度改变突变的证据表明与另一些亲水性残基，例如天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、赖氨酸和精氨酸相比，一些亲水性残基例如天
冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸更有利地显著有助于蛋白质溶解度。
[0131]
稳定性。可对抗体进行改造以增强生物物理特性。可使用平均表观熔融温度，使用升高温度来使抗体解折叠以确定相对稳定性。差示扫描量热术(differential scanning calorimetry，dsc)测量分子的热容量c
p
(使该分子升温每度所需的热)作为温度的函数。可使用dsc研究抗体的热稳定性。mab的dsc数据是特别令人感兴趣的，因为其有时解析了mab结构内单独结构域的解折叠，从而在热谱图中产生多至三个峰(来自fab、c
h
2和c
h
3结构域的解折叠)。通常来说，fab结构域的解折叠产生最强峰。fc部分的dsc谱和相对稳定性显示了人igg1、igg2、igg3和igg4亚类的特征差异(garber and demarest,biochem.biophys.res.commun.355,751
‑
757,2007)。还可使用圆二色性(circular dichroism，cd)(用cd分光计进行)来确定平均表观熔融温度。将以0.5nm的增量在200至260nm中测量抗体的远紫外cd谱。最终谱可确定为20次累积的平均值。在背景减除之后可计算出残基椭圆率值。抗体(0.1mg/ml)的热解折叠可在235nm在25至95℃下以及以1℃/分钟的加热速率进行监测。可使用动态光散射(dynamic light scattering，dls)来评估聚集的倾向性。dls用于表征多种颗粒(包括蛋白质)的尺寸。如果体系尺寸不分散，则可确定颗粒的平均有效直径。该测量取决于颗粒核芯的尺寸、表面结构的尺寸和颗粒浓度。因为dls基本上测量了由于颗粒引起的散射光强度的波动，所以可确定颗粒的扩散系数。商业dla仪器中的dls软件显示不同直径的颗粒群。可使用dls方便地进行稳定性研究。通过确定颗粒的流体动力学半径是否提高，样品的dls测量可显示颗粒是否随时间推移聚集或是否随温度变化而聚集。如果颗粒聚集，则可看到半径更大的更大的颗粒群。取决于温度的稳定性可通过控制原位温度来分析。毛细管电泳(capillary electrophoresis，ce)技术包括用于确定抗体稳定性特征的已证实方法。可使用ice方法解析由于脱酰胺化、c端赖氨酸、唾液酸化、氧化、糖基化以及可导致蛋白质pi改变的蛋白质的任何其他变化而引起的抗体蛋白质电荷变体。可使用protein simple maurice仪器在毛细管柱(cief)中通过高通量的自由溶液等电聚焦(isoelectric focusing，ief)评价每种表达的抗体蛋白质。可每30秒进行全柱uv吸收检测，以实时监测聚焦在等电点(pi)的分子。这种方法在消除对转移步骤需要的同时将传统凝胶ief的高分辨率与基于柱的分离中存在的定量和自动化的优点相组合。该技术对表达的抗体进行同一性、纯度和异质性谱的可再现、定量分析。结果确定了在吸光度和天然荧光检测模式二者下的抗体上的电荷异质性和分子尺寸，以及其中检测灵敏度降至0.7μg/ml。
[0132]
溶解度。可确定抗体序列的固有溶解度评分。固有溶解度评分可使用camsol intrinsic(sormanni et al.,j mol biol 427,478
‑
490,2015)进行计算。可通过在线程序评价每个抗体片段(例如scfv)的hcdr3中第95至102位残基(kabat编号)的氨基酸序列，以计算溶解度评分。也可使用实验室技术确定溶解度。存在多种技术，包括将冻干的蛋白质添加至溶液直至溶液变得饱和并达到溶解度极限，或者通过在具有合适的分子量截止值的微浓缩器中通过超滤进行浓缩。最直接的方法是诱导无定形沉淀，其使用涉及使用硫酸铵进行蛋白质沉淀的方法来测量蛋白质溶解度(trevino et al.,j mol biol,366:449
‑
460,2007)。硫酸铵沉淀提供有关相对溶解度值的快速且准确的信息。硫酸铵沉淀产生具有明确水相和固相的沉淀的溶液，并且需要相对少量的蛋白质。使用通过硫酸铵诱导无定形沉淀进行的溶解度测量也可在不同的ph值下容易地进行。蛋白质溶解度是高度ph依赖性的，并
且ph被认为是影响溶解度的最重要的非固有因素。
[0133]
自身反应性。通常认为，应在个体发生期间通过阴性选择消除自身反应性克隆；然而，已经清楚的是，具有自身反应性特性的许多人天然存在的抗体在成体成熟库中仍然存在。已经注意到，在早期b细胞发育期间抗体中的hcdr3环通常富含正电荷并且表现出自身反应性模式(wardemann et al.,science 301,1374
‑
1377,2003)。可通过评估显微镜下与人来源细胞结合的水平(使用黏附的hela或hep
‑
2上皮细胞)以及流式细胞术细胞表面染色(使用悬浮的jurkat t细胞和293s人胚肾细胞)来测试给定抗体的自身反应性。也可使用对与组织阵列中组织的结合的评估来考察自身反应性。
[0134]
优选残基(“人相似性”)。对来自血液供体的人b细胞进行b细胞库深度测序正在许多最近研究中大规模进行。关于人抗体库重要部分的序列信息有助于对健康人中常见的抗体序列特征进行统计学评估。利用人重组抗体可变基因参考数据库中有关抗体序列特征的知识，可估计抗体序列的“人相似性”(human likeness，hl)的位置特异性程度。已表明hl可用于开发临床应用的抗体，例如治疗性抗体或作为疫苗的抗体。目的是提高抗体的人相似性，以降低将导致抗体药物的效力显著下降或可诱导严重的健康影响的潜在的不良作用和抗抗体免疫应答。可评估总共约4亿个序列的三个健康人血液供体的组合抗体库的抗体特征，并创建了聚焦于抗体的高变区的新“相对人相似性”(rhl)评分。rhl评分使人们容易地区分人序列(正评分)与非人序列(负评分)。可对抗体进行改造，以消除人库中不常见的残基。
[0135]
d.单链抗体
[0136]
单链可变片段(scfv)是用短(通常丝氨酸、甘氨酸)接头连接在一起的免疫球蛋白重链和轻链可变区的融合物。这种嵌合分子虽然去除了恒定区并且引入了接头肽但是保留了原始免疫球蛋白的特异性。这种修饰通常不改变特异性。历史上产生这些分子是为了有利于噬菌体展示，其中将抗原结合结构域表达为单个肽非常方便。或者，可由来源于杂交瘤或b细胞的亚克隆重链和轻链直接产生scfv。单链可变片段缺少存在于完全抗体分子中的恒定fc区，并且因此缺少用于纯化抗体的常见结合位点(例如，蛋白a/g)。这些片段通常可使用蛋白l纯化/固定，因为蛋白l与κ轻链的可变区相互作用。
[0137]
柔性接头通常由促进螺旋和转角的氨基酸残基(例如丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸)构成。然而，其他残基也可很好地作用。tang et al.(1996)使用噬菌体展示作为从蛋白质接头文库中快速选择用于单链抗体(scfv)的专用接头的方式。构建随机接头文库，其中用于重链和轻链可变结构域的基因通过编码具有可变组成的18
‑
氨基酸多肽的区段连接。在丝状噬菌体上展示scfv库(约5
×
106个不同成员)并且用半抗原进行亲和选择。所选择变体的群体表现出结合活性显著提高，但是保留了相当大的序列多样性。随后筛选1054个单独变体产生了以可溶性形式有效产生的催化活性scfv。序列分析揭示，所选择栓链(tether)的仅有的共同特征是：v
h
c末端之后的2个残基是接头中的保守脯氨酸以及在其他位置处有大量的精氨酸和脯氨酸。
[0138]
本公开内容的重组抗体还可涉及允许受体二聚化或多聚化的序列或部分。这样的序列包括来源于iga的那些，其允许与j链联合形成多聚体。另一个多聚化结构域是gal4二聚化结构域。在另一些实施方案中，可用允许两个抗体组合的试剂(例如生物素/抗生物素蛋白)对链进行修饰。
[0139]
在一个独立的实施方案中，可通过使用非肽接头或化学单元连接受体轻链和重链来产生单链抗体。通常来说，使轻链和重链在不同细胞中产生，纯化，并且随后以合适的方式连接在一起(即，通过合适的化学桥将重链的n端与轻链的c端连接)。
[0140]
使用交联试剂形成将两个不同分子的官能团系住的分子桥，例如，稳定和凝结剂。然而，预期可产生相同类似物的二聚体或多聚体或者包含不同类似物的异聚复合体。为了以逐步方式连接两个不同化合物，可使用异
‑
双官能交联剂，其消除了不想要的均聚物形成。
[0141]
一种示例性的异
‑
双官能交联剂包含两个反应性基团：一个与伯胺基(例如，n
‑
羟基琥珀酰亚胺)反应并且另一个与硫醇基团(例如，吡啶基二硫化物、马来酰亚胺、卤素等)反应。通过伯胺反应基，交联剂可与一个蛋白质(例如，所选择的抗体或片段)的赖氨酸残基反应，并且通过硫醇反应基，已经系在第一蛋白质上的交联剂与另一蛋白质(例如，选择剂)的半胱氨酸残基(游离巯基)反应。
[0142]
优选地，使用在血液中具有合理稳定性的交联剂。已知多种类型含二硫键的接头可成功用于使靶向剂和治疗剂/预防剂缀合。包含在空间上受阻之二硫键的接头可证明在体内提供更高稳定性，从而防止靶向肽在到达作用位点之前释放。因此，这些接头是一组连接剂。
[0143]
另一种交联试剂是smpt，这是一种包含二硫键的双官能交联剂，该二硫键由于邻近的苯环和甲基而在“空间上受阻”。认为二硫键的空间位阻发挥了保护键不被可存在于组织和血液中的硫醇盐阴离子(例如谷胱甘肽)攻击的功能，并且从而有助于防止缀合物在连接的药剂递送到靶部位之前解偶联。
[0144]
与许多其他已知的交联试剂一样，smpt交联试剂也能够使官能团例如半胱氨酸的sh或伯胺(例如，赖氨酸的ε氨基)交联。另一种可能的交联剂类型包括含有可切割二硫键的异
‑
双官能光反应性叠氮基苯，例如磺基琥珀酰亚胺基
‑2‑
(对叠氮基水杨酰氨基)乙基
‑
1,3
’‑
二硫代丙酸酯。n
‑
羟基
‑
琥珀酰亚胺基与伯氨基反应，并且叠氮基苯(光分解之后)非选择性地与任何氨基酸残基反应。
[0145]
除了受阻交联剂，非受阻交联剂也可据此使用。不预期包含或产生被保护的二硫化物的话，其他有用的交联剂包括sata、spdp和2
‑
亚氨基硫烷。这样的交联剂的使用是本领域中非常了解的。另一个实施方案涉及使用柔性接头。
[0146]
美国专利4,680,338描述了可用于产生配体与含胺聚合物和/或蛋白质的缀合物，特别是用于与螯合剂、药物、酶、可检测标记等形成抗体缀合物的双官能接头。美国专利5,141,648和5,563,250公开了包含在多种温和条件下可切割之不稳定键的可切割缀合物。这种接头特别可用，因为目的药剂可直接与接头键合，并且其切割导致活性剂的释放。特别的用途包括向蛋白质例如抗体或药物添加游离氨基或游离巯基。
[0147]
美国专利5,856,456提供了用于连接多肽成分以制备融合蛋白(例如，单链抗体)的肽接头。接头的长度为多至约50个氨基酸；包含带电氨基酸(优选精氨酸或赖氨酸)接着是脯氨酸，出现至少一次；并且以更高的稳定性和聚集降低为特征。美国专利5,880,270公开了可用于多种免疫诊断和分离技术的含氨基氧基的接头。
[0148]
e.多特异性抗体
[0149]
在某些实施方案中，本公开内容的抗体是双特异性或多特异性的。双特异性抗体
是对至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。示例性的双特异性抗体可与单个抗原的两个不同表位结合。其他这样的抗体可将第一抗原结合位点与第二抗原的结合位点组合。或者，可将抗原特异性臂与和白细胞上的触发分子(例如t细胞受体分子(例如cd3)或igg的fc受体(fcγr)，例如fcγri(cd64)、fcγrii(cd32)和fcγriii(cd16))结合的臂组合，以便将细胞防御机制集中和定位至受感染细胞。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位于受感染细胞。这些抗体具有抗原结合臂和与细胞毒性剂(例如，皂草毒蛋白(saporin)、抗干扰素
‑
α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白a链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)结合的臂。可将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段(例如f(ab’).sub.2双特异性抗体)。wo 96/16673描述了双特异性抗erbb2/抗fcγriii抗体，并且美国专利no.5,837,234公开了双特异性抗erbb2/抗fcγri抗体。wo98/02463中示出了双特异性抗erbb2/fcα抗体。美国专利no.5,821,337教导了双特异性抗erbb2/抗cd3抗体。
[0150]
用于制造双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统产生基于两个免疫球蛋白重链
‑
轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(millstein et al.,nature,305:537
‑
539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，因此这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))产生了十种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和色谱步骤而完成的正确分子的纯化相当繁琐，并且产物产率较低。在wo 93/08829和traunecker et al.,embo j.,10:3655
‑
3659(1991)中公开了类似的操作。
[0151]
根据不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体
‑
抗原组合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。优选地，融合是与ig重链恒定结构域(包含铰链区、c
h2
区和c
h3
区的至少一部分)进行的。优选使得包含轻链键合所必需位点的第一重链恒定区(c
h1
)存在于至少一个融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果需要的话)免疫球蛋白轻链的dna插入到分开的表达载体中，并共转染到合适的宿主细胞中。在当构建中使用的不等比率的三条多肽链的提供了期望双特异性抗体的最佳产率时的一些实施方案中，这为调节三个多肽片段的相互比例提供了更大的灵活性。然而，当至少两条多肽链以相等的比率的表达导致高产率时，或者当比率对所期望链组合的产率没有显著影响时，可将两条或全部三条多肽链的编码序列插入单个表达载体中。
[0152]
在该方法的一个特别实施方案中，双特异性抗体由一个臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一个臂中杂合免疫球蛋白重链
‑
轻链对(提供第二结合特异性)构成。已发现，这种不对称结构促进了期望双特异性化合物相对于不希望的免疫球蛋白链组合而分离，因为仅在双特异性分子的一半中存在免疫球蛋白轻链提供了简易的分离方式。该方法在wo 94/04690中公开。对于产生双特异性抗体的另外的细节，参见例如suresh et al.,methods in enzymology,121:210(1986)。
[0153]
根据美国专利no.5,731,168中描述的另一种方法，可对一对抗体分子之间的界面进行改造，以使从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包括c
h3
结构域的至少一部分。在该方法中，将来自第一抗体分子的界面的一个或更多个小氨基酸侧链替换为较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)。通过将较大的氨基酸侧链替换为较小的侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)，在第二抗体分子的界面上产生了与一种或更多种大的侧链相同或类似尺寸的补偿“腔”。这提供了关于异二聚体的产率与其他不希望的最终产品(例
如同二聚体)相比而提高的机制。
[0154]
双特异性抗体包括交联或“异缀合”抗体。例如，异缀合物中的一种抗体可与抗生物素蛋白偶联，另一种与生物素偶联。例如，已提出这样的抗体以将免疫系统细胞靶向不希望的细胞(美国专利no.4,676,980)，以及用于治疗hiv感染(wo 91/00360、wo 92/200373和ep 03089)。杂缀合物抗体可使用任何方便的交联方法来制成。合适的交联剂是本领域公知的，并连同许多交联技术在美国专利no.4,676,980中公开。
[0155]
关于从抗体片段产生双特异性抗体的技术也已在文献中描述。例如，可使用化学键联来制备双特异性抗体。brennan et al.,science,229:81(1985)描述了操作，其中完整的抗体被蛋白水解切割以产生f(ab’)2片段。这些片段在二硫醇络合剂亚砷酸钠的存在下被还原，以稳定邻位二硫醇并阻止分子间二硫化物形成。然后将产生的fab’片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(tnb)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将一种fab
’‑
tnb衍生物转化为fab
’‑
硫醇，并与等摩尔量的另一种fab
’‑
tnb衍生物混合以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶选择性固定化的试剂。
[0156]
存在促进从大肠杆菌直接回收fab
’‑
sh片段的技术，该片段可进行化学偶联以形成双特异性抗体。shalaby et al.,j.exp.med.,175:217
‑
225(1992)描述了人源化双特异性抗体f(ab’)2分子的产生。每个fab’片段分别从大肠杆菌中分泌出，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够与过表达erbb2受体的细胞和正常人t细胞结合，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶标的裂解活性。
[0157]
还已描述了多种关于从重组细胞培养物中制备和直接分离双特异性抗体片段的技术(merchant et al.,nat.biotechnol.16,677
–
681(1998))。例如，已使用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体(kostelny et al.,j.immunol.,148(5):1547
‑
1553,1992)。通过基因融合，将来自fos和jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的fab’部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后再氧化以形成抗体异二聚体。该方法也可用于抗体同二聚体的产生。hollinger et al.,proc.natl.acad.sci.usa,90:6444
‑
6448(1993)描述的“双抗体”技术为制造双特异性抗体片段提供了替代机制。片段包含通过接头连接至v
l
的v
h
，该接头太短而无法允许在同一链上的两个结构域之间的配对。因此，一个片段的v
h
和v
l
结构域被迫与另一片段的互补的v
l
和v
h
结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还已报道了通过使用单链fv(sfv)二聚体制造双特异性抗体片段的另一种策略。参见gruber et al.,j.immunol.,152:5368(1994)。
[0158]
在一个特别的实施方案中，双特异性或多特异性抗体可形成为dock
‑
and
‑
lock
tm
(dnl
tm
)复合体(参见，例如，美国专利no.7,521,056；7,527,787；7,534,866；7,550,143和7,666,400，其各自的实施例部分通过引用并入本文。)通常来说，该技术利用了camp依赖性蛋白激酶(pka)的调节(r)亚基的二聚化及对接结构域(dimerization and docking domain，ddd)序列与来源于多种akap蛋白中任何一种的锚定结构域(anchor domain，ad)序列之间发生的特异性和高亲和力结合相互作用(baillie et al.,febs letters.2005；579:3264；wong and scott,nat.rev.mol.cell biol.2004；5:959)。ddd和ad肽可与任何蛋白质、肽或其他分子连接。因为ddd序列自发地二聚化并与ad序列结合，所以该技术允许在可与ddd或ad序列连接的任何选择的分子之间形成复合体。
[0159]
预期了具有多于二价的抗体。例如，可制备三特异性抗体(tutt et al.,
j.immunol.147:60,1991；xu et al.,science,358(6359):85
‑
90,2017)。多价抗体可比二价抗体更快速地被表达抗体与其结合的抗原的细胞内化(和/或分解代谢)。本公开内容的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(例如四价抗体)，其可通过重组表达编码抗体多肽链的核酸来容易地产生。多价抗体可包含二聚化结构域以及三个或更多个抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含fc区或铰链区(或由其组成)。在这种情况下，抗体将包含fc区和fc区氨基端的三个或更多个抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含3个至约8个，但优选4个抗原结合位点(或由其组成)。多价抗体包含至少一条多肽链(并且优选两条多肽链)，其中所述一条或更多条多肽链包含两个或更多个可变区。例如，一条或更多条多肽链可包含vd1
‑
(x1).sub.n
‑
vd2
‑
(x2)
n
‑
fc，其中vd1是第一可变区，vd2是第二可变区，fc是fc区的一条多肽链，x1和x2代表氨基酸或多肽，并且n为0或1。例如，一条或更多条多肽链可包含vh
‑
ch1
‑
柔性接头
‑
vh
‑
ch1
‑
fc区链；或vh
‑
ch1
‑
vh
‑
ch1
‑
fc区链。本文中的多价抗体优选还包含至少2个(并且优选4个)轻链可变区多肽。本文中的多价抗体可例如包含约2至约8个轻链可变区多肽。在此预期的轻链可变区多肽包含轻链可变区，并且任选地还包含c
l
结构域。
[0160]
电荷修饰在多特异性抗体的情况下特别有用，其中fab分子中的氨基酸置换导致降低轻链与不匹配的重链的错配(bence
‑
jones型副产物)，其可在产生基于fab的双/多特异性抗原结合分子的情况下发生，其中在该分子的一条(或更多条，如果分子包含多于两个的抗原结合fab分子的话)结合臂中vh/vl进行交换(另参见pct公开no.wo 2015/150447，特别是其中的实施例，通过引用以其整体并入本文)。
[0161]
f.嵌合抗原受体
[0162]
嵌合抗原受体分子是重组融合蛋白，并由其结合抗原并通过存在于其胞质尾中的免疫受体激活基序(immunoreceptor activation motif，itam)来转导激活信号的能力而辨别。利用抗原结合部分(例如，由单链抗体(scfv)产生)的受体构建体具有“通用”的另外的优势，因为其以hla独立的方式结合靶细胞表面上的天然抗原。
[0163]
嵌合抗原受体可通过本领域已知的任何方法产生，尽管优选地其是使用重组dna技术产生的。编码嵌合抗原受体的数个区域的核酸序列可通过标准分子克隆技术(基因组文库筛选、pcr、引物辅助连接、来自酵母和细菌的scfv文库、位点
‑
定向诱变等)来制备并组装成完整的编码序列。可将所得编码区插入表达载体中，并用于转化合适的表达宿主同种异体或自体免疫效应细胞，例如t细胞或nk细胞。
[0164]
本文中所述的car的一些实施方案包括编码抗原特异性嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)多肽的核酸，该嵌合抗原受体(car)多肽包含胞内信号传导结构域、跨膜结构域和包含一个或更多个信号传导基序的胞外结构域。在某些实施方案中，car可识别包含一种或更多种抗原之间的共享空间的表位。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含：a)胞内信号传导结构域，b)跨膜结构域，和c)包含抗原结合结构域的胞外结构域。任选地，car可包含位于跨膜结构域和抗原结合结构域之间的铰链结构域。在某些方面中，一些实施方案的car还包含将car的表达引导至细胞表面的信号肽。例如，在一些方面中，car可包含来自gm
‑
csf的信号肽。
[0165]
在某些实施方案中，当存在少量的肿瘤相关抗原时，car还可与膜结合细胞因子共表达以改善持久性。例如，car可与膜结合il
‑
15共表达。
[0166]
根据car结构域的排列和结构域中使用的特定序列，表达car的免疫效应细胞可针对靶细胞具有不同水平的活性。在一些方面中，可将不同的car序列引入免疫效应细胞中以产生经改造细胞，所选用于升高的src的经改造细胞和经测试活性以鉴定car构建体的所选细胞预测具有最大的治疗效力。
[0167]
1.抗原结合结构域
[0168]
在某些实施方案中，抗原结合结构域可包含单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区和/或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，该特异性来源于与受体结合的肽(例如，细胞因子)。“互补决定区(complementarity determining region，cdr)”是在抗原受体(例如，免疫球蛋白和t细胞受体)蛋白的可变结构域中发现的短氨基酸序列，其与抗原互补并因此向受体提供针对该特定抗原的特异性。抗原受体的每条多肽链均包含三个cdr(cdr1、cdr2和cdr3)。由于抗原受体通常由两条多肽链构成，因此对于可与抗原接触的每个抗原受体有6个cdr——每条重链和轻链均包含三个cdr。因为在cdr中发现了大多数与免疫球蛋白和t细胞受体相关的序列变异，所以有时将这些区域称为高变结构域。其中，cdr3显示出最大的可变性，因为它是由vj(在重链和tcrαβ链的情况下为vdj)区的重组编码的。
[0169]
预期了car核酸，特别地，scfv序列是人基因，以增强对人患者的细胞免疫治疗。在一个具体的实施方案中，提供了全长car cdna或编码区。抗原结合区或结构域可包含来源于特定小鼠或人或人源化单克隆抗体的单链可变片段(scfv)的vh和vl链的片段。该片段也可以是抗原特异性抗体的任何数量的不同抗原结合结构域。在一个更具体的实施方案中，该片段是由针对人密码子使用而优化的序列编码的抗原特异性scfv，以在人细胞中表达。在某些方面中，car的vh和vl结构域被接头序列(例如whitlow接头)隔开。可根据一些实施方案修饰或使用的car构建体还可在国际(pct)专利公开no.wo/2015/123642(通过引用并入本文)中提供。
[0170]
如前所述，原型car编码包含与跨膜结构域和一个或更多个胞质信号传导结构域(例如共刺激结构域和信号传导结构域)偶联的来源于一种单克隆抗体(mab)的vh和vl结构域的scfv。因此，car可包含与目的抗原(例如肿瘤相关抗原)结合的抗体的lcdr1至3序列和hcdr1至3序列。然而，在另一些方面中，鉴定了与目的抗原结合的两种或更多种抗体，并且构建了car，其包含：(1)与抗原结合的第一抗体的hcdr1至3序列；和(2)与抗原结合的第二抗体的lcdr1至3序列。包含来自两种不同抗原结合抗体的hcdr和lcdr序列的这样的car可具有与抗原的特定构型(例如，相对于正常组织与癌细胞优先相关的构型)优先结合的优势。
[0171]
或者，显示出可使用来源于不同mab的vh和vl链来改造car，以产生一组car t细胞。car的抗原结合结构域可包含第一抗体的lcdr1至3序列和第二抗体的hcdr1至3序列的任何组合。
[0172]
2.铰链结构域
[0173]
在某些方面中，一些实施方案的car多肽可包含位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间的铰链结构域。在一些情况下，铰链结构域可包含在car多肽中，以在抗原结合结构域和细胞表面之间提供足够的距离，或者以减轻可能不利地影响car基因经修饰的t细胞的抗原结合或效应功能的可能的位阻。在一些方面中，铰链结构域包含与fc受体(例如fcγr2a或fcγr1a)结合的序列。例如，铰链序列可包含与fc受体结合的来自人免疫球蛋白(例
如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2、igm、igd或ige)的fc结构域。在某些方面中，铰链结构域(和/或car)不包含野生型人igg4 ch2和ch3序列。
[0174]
在一些情况下，car铰链结构域可来源于人免疫球蛋白(ig)恒定区或其包含ig铰链的一部分，或者来源于人cd8α跨膜结构域和cd8a
‑
铰链区。在一个方面，car铰链结构域可包含抗体同种型igg4的铰链
‑
ch2‑
ch3区。在一些方面中，可在抗体重链ch2结构域中引入点突变以降低car
‑
t细胞或任何其他car经修饰的细胞的糖基化和非特异性fcγ受体结合。
[0175]
在某些方面中，一些实施方案的car铰链结构域包含ig fc结构域，其包含相对于野生型ig fc结构域的至少一个突变，所述突变降低了fc受体结合。例如，car铰链结构域可包含igg4
‑
fc结构域，其包含相对于野生型igg4
‑
fc结构域的至少一个突变，所述突变降低了fc受体结合。在一些方面中，car铰链结构域包含相对于野生型igg4
‑
fc序列在对应于l235和/或n297位具有突变(例如氨基酸缺失或置换)的igg4
‑
fc结构域。例如，car铰链结构域可包含相对于野生型igg4
‑
fc序列具有l235e和/或n297q突变的igg4
‑
fc结构域。在另一些方面中，car铰链结构域可包含在l235位具有置换为亲水性氨基酸(例如r、h、k、d、e、s、t、n或q)或者与“e”的特性类似的氨基酸(例如d)的氨基酸置换的igg4
‑
fc结构域，在某些方面中，car铰链结构域可包含在n297位具有置换为与“q”的特性类似的氨基酸(例如s或t)的氨基酸置换的igg4
‑
fc结构域。
[0176]
在某些具体方面中，铰链结构域包含与igg4铰链结构域、cd8a铰链结构域、cd28铰链结构域或经改造铰链结构域具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
[0177]
3.跨膜结构域
[0178]
抗原特异性胞外结构域和胞内信号传导结构域可通过跨膜结构域连接。可用作跨膜结构域的一部分的多肽序列包括但不限于：人cd4跨膜结构域、人cd28跨膜结构域、跨膜人cd3ζ结构域或半胱氨酸突变的人cd3ζ结构域，或者来自其他人跨膜信号传导蛋白(例如cd16和cd8和红细胞生成素受体)的其他跨膜结构域。在一些方面中，例如，跨膜结构域包含与美国专利公开no.2014/0274909中提供的那些(例如cd8和/或cd28跨膜结构域)或美国专利公开no.8,906,682中提供的那些(例如cd8α跨膜结构域)之一具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，所述两个美国专利公开均通过引用并入本文。在本发明中特别使用的跨膜区可来源于(即，包含以下的至少一个跨膜区)t细胞受体的α、β或ζ链，cd3ε，cd45，cd4，cd5，cd8，cd9，cd16，cd22，cd33，cd37，cd64，cd80，cd86，cd134，cd137，cd154。在某些具体方面中，跨膜结构域可与cd8a跨膜结构域或cd28跨膜结构域具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
[0179]
4.胞内信号传导结构域
[0180]
一些实施方案的嵌合抗原受体的胞内信号传导结构域负责经改造以表达嵌合抗原受体的免疫细胞的至少一种正常效应功能的激活。术语“效应功能”是指分化细胞的特化功能。例如，t细胞的效应功能可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。初始、记忆或记忆型t细胞中的效应功能包括抗原依赖性增殖。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应功能信号并指导细胞进行特化功能的蛋白质部分。在一些方面中，胞内信号传导结构域来源于天然受体的胞内信号传导结构域。这样的天然受体的一些实例包括t
细胞受体的ζ链或其任何同源物(例如β、δ、γ或ε)、mb1链、b29、fc riii、fc ri，和信号传导分子(例如cd3ζ和cd28、cd27、4
‑
1bb、dap
‑
10、ox40)的组合，及其组合，以及其他类似的分子和片段。可使用活化蛋白家族其他成员的胞内信号传导部分。尽管通常将使用整个胞内信号传导结构域，但是在许多情况下，将不必使用整个胞内多肽。就胞内信号传导结构域的截短部分可应用的程度而言，可使用这样的截短部分代替完整链，只要它仍转导效应功能信号即可。因此，术语“胞内信号传导结构域”意指包括当car与靶标结合时足以转导效应功能信号的胞内信号传导结构域截短部分。在一个优选的实施方案中，人cd3ζ胞内结构域用作用于一些实施方案的car的胞内信号传导结构域。
[0181]
在一些具体实施方案中，car中的胞内受体信号传导结构域包括t细胞抗原受体复合体的那些，例如cd3的ζ链，还例如单独或与cd3ζ相连的fcγriii共刺激信号传导结构域、cd28、cd27、dap10、cd137、ox40、cd2。在一些具体实施方案中，胞内结构域(其可称为胞质结构域)包含tcrζ链、cd28、cd27、ox40/cd134、4
‑
1bb/cd137、fcεriγ、icos/cd278、il
‑
2rβ/cd122、il
‑
2rα/cd132、dap10、dap12和cd40中的一种或更多种的一部分或全部。在一些实施方案中，在胞内结构域中使用内源性t细胞受体复合体的任何一部分。可使用一个或多个胞质结构域，因为所谓的第三代car具有用于叠加或协同作用的融合在一起的至少两个或三个信号传导结构域，例如cd28和4
‑
1bb可组合在car构建体中。
[0182]
在一些实施方案中，car包括另外的其他共刺激结构域。其他共刺激结构域可包括但不限于cd28、cd27、ox
‑
40(cd134)、dap10和4
‑
1bb(cd137)中的一种或更多种。除了由cd3ζ引发的主要信号之外，由插入人car中的人共刺激受体提供的另外的信号对于t细胞的完全活化是重要的，并且可帮助改善体内持久性和过继免疫治疗的治疗成功。
[0183]
在某些具体方面中，胞内信号传导结构域包含与cd3ζ胞内结构域、cd28胞内结构域、cd137胞内结构域，或者包含与4
‑
1bb胞内结构域融合的cd28胞内结构域的结构域具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
[0184]
g.adc
[0185]
抗体药物缀合物或adc是新类别的被设计为治疗患有疾病的人的靶向治疗的高度强效生物药物。adc是由通过具有不稳定键的稳定化学接头与生物活性细胞毒性/抗病毒载荷或药物连接的抗体(完整的mab或抗体片段，例如单链可变片段或scfv)构成的复合分子。抗体药物缀合物是生物缀合物和免疫缀合物的实例。
[0186]
通过将单克隆抗体独特的靶向能力与细胞毒性药物的癌症杀伤能力相结合，抗体
‑
药物缀合物允许灵敏地区分健康组织和患病组织。这意味着，与传统的全身性方法相反，抗体
‑
药物缀合物靶向并攻击患病细胞，因此健康细胞受到的影响没那么严重。
[0187]
在基于adc的抗肿瘤治疗的开发中，将抗癌药物(例如细胞毒素(cell toxin)或细胞毒素(cytotoxin))与特异性靶向某些细胞标志物(例如，理想地仅在受感染细胞中或受感染细胞上发现的蛋白质)的抗体偶联。抗体在体内追踪这些蛋白质并将其自身附着于癌细胞表面。抗体与靶蛋白(抗原)之间的生化反应触发肿瘤细胞中的信号，肿瘤细胞然后吸收或内化抗体以及细胞毒素。adc内化之后，细胞毒性药物被释放并杀伤细胞或损害细胞复制。由于这种靶向，与其他药剂相比，理想地该药物具有更低的副作用并给予更宽的治疗窗。
[0188]
抗体和细胞毒性剂之间的稳定连接是adc的一个关键方面。接头基于包括二硫化
物、腙或肽(可裂解)或硫醚(不可裂解)的化学基序，并控制细胞毒性剂的分布和向靶细胞的递送。在临床前和临床试验中，已证明可裂解和不可裂解类型的接头是安全的。本妥昔单抗(brentuximab vedotin)包含将强效且高毒性的抗微管剂，合成的抗肿瘤剂单甲基澳瑞他汀e(monomethyl auristatin e)或mmae，递送至人特异性cd30阳性恶性细胞的酶敏感的可裂解接头。mmae由于其高毒性(其通过阻断微管蛋白的聚合来抑制细胞分裂)，因此不能用作单一药剂化学治疗药物。然而，与抗cd30单克隆抗体(cac10，肿瘤坏死因子或tnf受体的一种细胞膜蛋白)连接的mmae的组合被证明在胞外流体中是稳定的，可被组织蛋白酶裂解，并且用于治疗是安全的。曲妥珠单抗美坦新(trastuzumab emtansine)作为另一种批准的adc，是微管形成抑制剂美登素(dm
‑
1)(美登素的衍生物)与抗体曲妥珠单抗(/genentech/roche)通过稳定的、不可裂解的接头连接的组合。
[0189]
更好和更稳定的接头的可用性已改变了化学键的功能。接头的类型(可裂解的或不可裂解的)为细胞毒性(抗癌)药物提供了特定的特性。例如，不可裂解的接头将药物保留在细胞内。作为结果，整个抗体、接头和细胞毒性剂进入靶癌细胞，在那里抗体被降解至氨基酸水平。所得的复合体(氨基酸、接头和细胞毒性剂)现成为活性药物。相反，可裂解的接头被宿主细胞中的酶催化，在那里释放细胞毒性剂。
[0190]
目前在开发中的另一种类型的可裂解接头在细胞毒性药物和裂解位点之间添加了额外的分子。该接头技术允许研究人员创建具有更高灵活性的adc，而不必担心改变裂解动力学。研究人员还在开发基于edman降解的肽裂解的新方法，该方法是对肽中的氨基酸进行测序的方法。adc开发的未来方向还包括位点特异性缀合(tdc)的开发，以进一步改善稳定性和治疗指数以及发射α的免疫缀合物和抗体缀合的纳米粒。
[0191]
h.bite
[0192]
双特异性t细胞衔接器(bi
‑
specific t
‑
cell engager，bite)是一类人工双特异性单克隆抗体，已被研究用作抗癌药物。其指导宿主的免疫系统，更具体地t细胞的细胞毒性活性，来针对受感染细胞。bite是micromet ag的注册商标。
[0193]
bite是融合蛋白，由不同抗体的两个单链可变片段(scfv)或者来自约55道尔顿的单条肽链上的四个不同基因的氨基酸序列组成。scfv中的一个通过cd3受体与t细胞结合，另一个通过特定分子与受感染细胞结合。
[0194]
与其他双特异性抗体一样，与普通的单克隆抗体不同，bite在t细胞和靶细胞之间形成连接。这导致t细胞独立于mhc i或共刺激分子的存在，通过产生例如穿孔素和颗粒酶的蛋白质对受感染细胞发挥细胞毒性活性。这些蛋白质进入受感染细胞并引发细胞凋亡。该作用模仿了在t细胞攻击受感染细胞期间观察到的生理过程。
[0195]
i.胞内抗体
[0196]
在一个具体实施方案中，抗体是适合在细胞内发挥作用的重组抗体——这样的抗体被称为“胞内抗体”。这些抗体可通过多种机制，例如通过改变胞内蛋白质运输，干扰酶的功能以及阻断蛋白质
‑
蛋白质或蛋白质
‑
dna的相互作用来干扰靶向功能。在许多方面中，它们的结构模仿或类似于以上所讨论的单链和单结构域抗体的那些。实际上，单转录物/单链是重要的特征，其允许在靶细胞中进行胞内表达，并且还使蛋白质跨细胞膜转运更为可行。然而，还需要另外的特征。
[0197]
影响胞内抗体治疗的实施的两个主要问题是递送(包括细胞/组织靶向)和稳定
性。关于递送，已采用了多种方法，例如组织定向的递送、细胞类型特异性启动子的使用、基于病毒的递送以及细胞通透性/膜易位肽的使用。一种递送方式包括使用基于脂质的纳米粒或外排体，如美国专利申请公开2018/0177727所教导的，其通过引用以其整体并入于此。关于稳定性，方法通常是通过蛮力(brute force)筛选，包括涉及噬菌体展示并且可包括序列成熟或共有序列的开发的方法，或者更定向的修饰，例如插入稳定序列(例如fc区、伴侣蛋白序列、亮氨酸拉链)和二硫化物替换/修饰。
[0198]
胞内抗体可需要的另外的特征是胞内靶向的信号。已设计了可将胞内抗体(或其他蛋白质)靶向至亚细胞区域(例如细胞质、细胞核、线粒体和er)的载体，并且是可商购的(invitrogen corp.)。
[0199]
凭借其进入细胞的能力，胞内抗体具有其他类型的抗体可能无法实现的另外的用途。在本发明抗体的情况下，在活细胞中与ddr1胞质结构域相互作用的能力可干扰与ddr1相关的功能，例如信号传导功能(与其他分子结合)或寡聚体形成。特别地，预期了可使用这样的抗体通过例如破坏相关的伴侣蛋白或交联酶功能来抑制i型胶原蛋白同三聚体的形成。
[0200]
j.纯化
[0201]
本公开内容的抗体可以是经纯化的。如本文中使用的术语“纯化的”意在指可与其他组分分离的组合物，其中蛋白质被纯化至相对于其可天然获得状态的任何程度。因此，经纯化的蛋白质也指这样的蛋白质，其脱离了其可天然存在的环境。当使用术语“基本上纯化的”时，该指定是指这样的组合物，其中蛋白质或肽形成该组合物的主要组分，例如构成组合物中蛋白质的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多。
[0202]
蛋白质纯化技术是本领域技术人员公知的。这些技术在一个水平上涉及将细胞环境粗分级至多肽级分和非多肽级分。在使多肽与其他蛋白质分离之后，可使用色谱和电泳技术进一步纯化目的多肽以实现部分纯化或完全纯化(或纯化至均质)。特备适合制备纯肽的分析方法是离子交换色谱、排阻色谱；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚集。其他用于蛋白质纯化的方法包括用硫酸铵、peg、抗体等或通过热变性进行沉淀，然后进行离心；凝胶过滤、反相、羟基磷灰石和亲和色谱；以及这些技术与其他技术的组合。
[0203]
在纯化本公开内容的抗体中，可需要在原核或真核表达系统中表达多肽并使用变性条件提取蛋白质。可使用与多肽的标记部分结合的亲和柱从其他细胞组分纯化多肽。如本领域中通常已知的，认为进行各纯化步骤的顺序可改变，或者可省略某些步骤，并且仍然获得适合制备基本上纯化的蛋白质或肽的方法。
[0204]
通常，使用与抗体的fc部分结合的试剂(即，蛋白a)对完全抗体进行分级。或者，可使用抗原以同时纯化和选择合适的抗体。这样的方法通常使用结合在支持物(例如柱、过滤器或珠)上的选择剂。使抗体与支持物结合，除去(例如，冲洗掉)污染物，并通过施加条件(盐、热等)释放抗体。
[0205]
根据本公开内容，本领域技术人员将知道多种用于对蛋白质或肽之纯化程度进行定量的方法。这些包括例如确定活性级分的比活性，或者通过sds/page分析来评估级分中多肽的量。另一种用于评估级分纯度的方法是计算级分的比活性，将其与初始提取物的比活性比较，并且因此计算纯度。当然，用于表示活性量的实际单位将取决于根据纯化而选择的特定测定技术，以及所表达蛋白质或肽是否表现出可检测活性。
[0206]
已知多肽的迁移可随着不同的sds/page条件而改变，有时候显著地改变。因此，应理解的是，在不同的电泳条件下，纯化的或部分纯化的表达产物的表观分子量可改变。
[0207]
k.抗体缀合物
[0208]
本公开内容的抗体可与至少一种试剂连接以形成抗体缀合物。为了提高抗体分子作为诊断剂或治疗剂的效力，常规地与至少一种期望的分子或部分连接或共价结合或复合。这样的分子或部分可以是但不限于至少一种效应分子或报道分子。效应分子包括具有期望活性，例如细胞毒活性的分子。已与抗体连接的效应分子的一些非限制性实例包括毒素、抗肿瘤剂、治疗性酶、放射性核素、抗病毒剂、螯合剂、细胞因子、生长因子和寡核苷酸或多核苷酸。相比之下，报道分子被定义为可使用测定检测的任何部分。已经与抗体缀合的报道分子的一些非限制性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、光亲和分子、着色颗粒或配体，例如生物素。
[0209]
通常优选使用抗体缀合物作为诊断剂。抗体诊断剂通常属于两类：用于体外诊断例如用于多种免疫测定的那些，以及用于通常称为“抗体指导的成像”的体内诊断方案的那些。许多合适的显像剂是本领域中已知的，其与抗体连接的方法也如此(参见，例如，美国专利5,021,236、4,938,948和4,472,509)。所使用的成像部分可以是顺磁性离子、放射性同位素、荧光染料、可nmr检测物质和x
‑
射线显像剂。
[0210]
在顺磁性离子的情况下，可通过以下示例性离子来提及：例如铬(iii)、锰(ii)、铁(iii)、铁(ii)、钴(ii)、镍(ii)、铜(ii)、钕(iii)、钐(iii)、镱(iii)、钆(iii)、钒(ii)、铽(iii)、镝(iii)、钬(iii)和/或铒(iii)，其中特别优选钆。在另一些情况(例如x
‑
射线成像)下可用的离子包括但不限于镧(iii)、金(iii)、铅(ii)和特别是铋(iii)。
[0211]
在用于治疗和/或诊断应用的放射性同位素的情况下，可提及砹
211
、
14
碳、
51
铬、
36
氯、
57
钴、
58
钴、铜
67
、
152
eu、镓
67
、3氢、碘
123
、碘
125
、碘
131
、铟
111
、
59
铁、
32
磷、铼
186
、铼
188
、
75
硒、
35
硫、锝
99m
和/或钇
90
。在某些实施方案中通常优选使用
125
i，并且也通常优选锝
99m
和/或铟
111
，因为其能量低和适用于长距离检测。本公开内容的放射性标记的单克隆抗体可根据本领域公知的方法产生。例如，可通过与碘化钠和/或碘化钾和化学氧化剂(例如次氯酸钠)或酶促氧化剂(例如乳过氧化物酶)接触来使单克隆抗体碘化。根据本公开内容的单克隆抗体可通过配体交换过程用锝
99m
标记，例如，通过用亚锡溶液还原高锝酸盐，将还原的锝螯合到sephadex柱上，并将抗体施加于该柱。或者，可使用直接标记技术，例如通过孵育高锝酸盐、还原剂(例如sncl2)、缓冲溶液(例如邻苯二甲酸钠钾溶液)和抗体进行。通常用于使作为金属离子存在的放射性同位素与抗体结合的中间官能团是二乙烯三胺五乙酸(dtpa)或乙二胺四乙酸(edta)。
[0212]
在预期作为缀合物使用的荧光标记之中包括alexa 350、alexa 430、amca、bodipy 630/650、bodipy 650/665、bodipy
‑
fl、bodipy
‑
r6g、bodipy
‑
tmr、bodipy
‑
trx、cascade blue、cy3、cy5、6
‑
fam、异硫氰酸荧光素、hex、6
‑
joe、oregon green 488、oregon green 500、oregon green 514、pacific blue、reg、罗丹明绿、罗丹明红、肾造影剂(renographin)、rox、tamra、tet、四甲基罗丹明和/或德克萨斯红(texas red)。
[0213]
在本公开内容中预期的另外类型的抗体是主要意图体外使用的那些，其中抗体与第二结合配体和/或在与显色底物接触之后产生着色产物的酶(酶标签)连接。合适的酶的一些实例包括脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的第二结合配体
是生物素以及抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白化合物。这样的标记的使用对于本领域技术人员是公知的，并且在例如美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241中描述。
[0214]
分子与抗体的位点特异性连接的另一种已知方法包括使抗体与基于半抗原的亲和标记反应。实质上，基于半抗原的亲和标记与抗原结合位点中的氨基酸反应，从而破坏该位点并阻断特异性抗原反应。然而，这可能是不利的，因为其导致通过抗体缀合物的抗原结合丧失。
[0215]
包含叠氮基的分子也可用于经由通过低强度紫外光产生的反应性氮宾中间体来与蛋白质形成共价键。特别地，已经使用嘌呤核苷酸的2
‑
叠氮类似物和8
‑
叠氮类似物作为定点光探针以鉴定粗制细胞提取物中的核苷酸结合蛋白。2
‑
叠氮核苷酸和8
‑
叠氮核苷酸还已被用于对经纯化蛋白质的核苷酸结合结构域进行图谱绘制并且可用作抗体结合剂。
[0216]
用于使抗体与其缀合部分连接或缀合的数种方法是本领域中已知的。一些连接方法涉及使用金属螯合物复合体，其使用例如与抗体连接的有机螯合剂，例如二乙烯三胺五乙酸酐(dtpa)；亚乙基三胺四乙酸；n
‑
氯
‑
对
‑
甲苯磺酰胺；和/或四氯
‑
3α
‑
6α
‑
二苯基甘脲
‑
3(tetrachloro
‑
3α
‑
6α
‑
diphenylglycouril
‑
3)(美国专利4,472,509和4,938,948)。单克隆抗体还可在存在偶联剂例如戊二醛或高碘酸盐的情况下与酶反应。与荧光素标记的缀合物在存在这些偶联剂的情况下或通过与异硫氰酸酯反应来制备。在美国专利4,938,948中，使用单克隆抗体实现了乳腺肿瘤的成像并且使用接头例如甲基
‑
对羟基苯甲亚氨酸酯或n
‑
琥珀酰亚胺基
‑3‑
(4
‑
羟基苯基)丙酸酯使可检测成像部分与抗体结合。
[0217]
在另一些实施方案中，预期通过使用不改变抗体结合位点的反应条件选择性地将巯基引入免疫球蛋白的fc区中来使免疫球蛋白衍生化。据公开，根据这种方法产生的抗体缀合物表现出改善的寿命、特异性和灵敏度(美国专利5,196,066，其通过引用并入本文)。在文献中也已经公开了效应分子或报道分子的位点特异性连接，其中报道分子或效应分子与fc区中的糖残基缀合。已经报道该方法产生目前处于临床评价之中的在诊断和治疗方面有希望的抗体。
[0218]
ii.治疗方法
[0219]
本实施方案的某些方面可用于预防或治疗与同三聚体i型胶原蛋白的存在相关的疾病或病症，例如胰腺导管腺癌。同三聚体i型胶原蛋白的功能可通过任何合适的药物来降低。优选地，这样的物质将是抗同三聚体i型胶原蛋白抗体。
[0220]“治疗”及其变化形式是指出于获得疾病或健康相关病症的治疗性益处的目的而向对象施用或应用治疗剂或者对对象进行程序或模式(modality)。例如，治疗可包括单独或者与化学治疗、免疫治疗或放射治疗、外科手术进行、或其任何组合的施用组合施用药学有效量的抑制同三聚体i型胶原蛋白的抗体。
[0221]
本文中使用的术语“对象”是指对其进行主题方法的任何个体或患者。通常来说，对象是人，尽管本领域技术人员将理解，对象可以是动物。因此，另一些动物，包括哺乳动物，例如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔、农场动物(包括牛、马、山羊、绵羊、猪等)以及灵长类(包括猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)均包括在对象的定义之内。
[0222]
本技术通篇使用的术语“治疗益处”或“治疗有效”是指对于该病症的医学治疗而言促进或增强对象的福祉的任何事物。这包括但不限于降低疾病(例如癌症或纤维性病)体
征或症状的频率或严重程度。例如，癌症的治疗可涉及例如降低肿瘤的尺寸、降低肿瘤的侵袭力、降低癌症的生长速率或预防转移。癌症的治疗还可指延长患有癌症的对象的存活。
[0223]
本文中使用的术语“癌症”可用于描述实体瘤、转移性癌症或非转移性癌症。在某些实施方案中，癌症可起源于膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食管、十二指肠、小肠、大肠、结肠、直肠、肛门、牙龈(gum)、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫。
[0224]
癌症可具体地是以下组织学类型，尽管其不限于这些：恶性肿瘤；癌；未分化的癌；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；组合肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；恶性类癌肿瘤；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；无包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌(endometroid carcinoma)；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；黏液表皮样癌；嚢腺癌；乳头状嚢腺癌；乳头状浆液性嚢腺癌；黏液性嚢腺癌；黏液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳房佩吉特病(paget’s disease)；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌w/鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质肿瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞瘤；恶性男性母细胞瘤；sertoli细胞癌；恶性莱迪希细胞瘤(leydig cell tumor)；恶性脂质细胞瘤；恶性神经节细胞瘤；恶性乳房外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；皮肤丝球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒管混合瘤(mullerian mixed tumor)；肾胚细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性布伦纳瘤(brenner tumor)；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺肿；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤(kaposi’s sarcoma)；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性成软骨细胞瘤；间质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤(ewing’s sarcoma)；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；成胶质细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原发性神经外胚层；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病(hodgkin’s disease)；霍奇金副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞，弥散性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样霉菌病；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓性白血病；嗜碱细胞性白血病；嗜酸细胞性白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。尽管如此，还认识到本发明也可用于治疗非癌性疾病(例如，真菌感染、细菌感染、病毒感染、神经退行性疾病和/或遗传紊乱)。
[0225]
b.制剂和施用
[0226]
本公开内容提供了药物组合物，其包含与同三聚体i型胶原蛋白选择性结合的抗体。这样的组合物包含预防或治疗有效量的抗体或其片段以及可药用载体。在一个具体实施方案中，术语“可药用的”意指由联邦或州政府的监管机构批准或者在美国药典或其他公认的药典中列出用于动物并且更特别地用于人。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、赋形剂或载剂。这样的药用载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物是静脉内施用时，水是特定的载体。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。另一些合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。
[0227]
如果需要的话，组合物还可包含少量的润湿剂或乳化剂或ph缓冲剂。这些组合物可采取溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等形式。经口制剂可包含标准载体，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药用剂的一些实例在“remington’s pharmaceutical sciences”中描述。这样的组合物将包含预防或治疗有效量的抗体或其片段(优选以纯化的形式)以及合适量的载体，以便向患者提供用于适当施用的形式。制剂应适合于施用方式，其可以是经口、静脉内、动脉内、颊内、鼻内、雾化、支气管吸入、直肠内、经阴道、表面或通过机械通气递送。
[0228]
抗体的被动转移通常将涉及静脉内或肌内注射的使用。抗体的形式可以是单克隆抗体(mab)。这样的免疫通常仅持续短的时间段，并且还存在对于超敏反应和血清病，特别是来自于非人来源的γ
‑
球蛋白的超敏反应和血清病的潜在风险。抗体将被配制在适合于注射(即无菌且可注射的)的载体中。
[0229]
通常来说，本公开内容的组合物的成分以单位剂型分开提供或混合在一起提供，例如，作为在指示活性剂的量的密封容器(例如安瓿或药袋(sachette))中的干燥的冻干粉末或无水浓缩物提供。当组合物通过输注施用时，可用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶进行分配。当通过注射施用组合物时，可提供一安瓿的无菌注射用水或盐水以便可在施用之前将成分混合。
[0230]
本公开内容的组合物可被配制为中性或盐形式。可药用盐包括与阴离子形成的那些，所述阴离子例如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些；以及与阳离子形成的那些，所述阳离子例如来源于钠、钾、铵、钙、铁氢氧化物、异丙胺、三乙胺、2
‑
乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。
[0231]
c.试剂盒与诊断
[0232]
在一些实施方案的多个方面中，设想试剂盒包含治疗剂和/或其他治疗剂和递送剂。本发明实施方案预期用于制备和/或施用一些实施方案的治疗的试剂盒。试剂盒可包含一个或更多个密封的小瓶，其包含本发明实施方案的任何药物组合物。试剂盒可包含例如至少一种同三聚体i型胶原蛋白抗体以及用于制备、配制和/或施用一些实施方案的组分或进行本发明方法的一个或更多个步骤的试剂。在一些实施方案中，试剂盒还可包含合适的容器，所述容器是不会与试剂盒的组分反应的容器，例如eppendorf管、测定板、注射器、瓶或管。容器可由可灭菌材料(例如塑料或玻璃)制成。
[0233]
试剂盒还可包含说明单，其概述了本文中所述方法的程序性步骤，并且将遵循与本文中所述或本领域普通技术人员已知的基本上相同的程序。指令信息可在包含机器可读
指令的计算机可读介质中，当使用计算机执行该机器可读指令时，导致显示递送药学有效量的治疗剂的真实或虚拟程序。
[0234]
d.adcc
[0235]
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody
‑
dependent cell
‑
mediated cytotoxicity adcc)是导致免疫效应细胞对抗体包被的靶细胞的裂解的一种免疫机制。靶细胞是通常通过fc区n端的蛋白质部分与抗体或其包含该fc区的片段特异性结合的细胞。“具有提高/降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)的抗体”意指如通过本领域普通技术人员已知的任何合适方法所确定的具有提高/降低的adcc的抗体。
[0236]
本文中使用的术语“提高/降低的adcc”定义为：在靶细胞周围的介质中的抗体的给定浓度下，通过如上定义的adcc的机制，在给定时间内裂解的靶细胞数量的提高/降低；和/或在靶细胞周围的介质中，通过adcc机制，在给定时间内实现给定数量的靶细胞裂解所需的抗体浓度的降低/提高。adcc的提高/降低是相对于使用相同标准的产生、纯化、配制和储存方法(其是本领域技术人员已知的)由同一类型的宿主细胞(但其是未经改造的)产生的相同抗体介导的adcc。例如，由通过本文中所述方法改造以具有改变的糖基化模式(例如，以表达糖基转移酶gntiii或其他糖基转移酶)的宿主细胞产生的抗体所介导的adcc的提高是相对于由通过同一类型的未经改造宿主细胞产生的相同抗体介导的adcc。
[0237]
e.cdc
[0238]
补体依赖性细胞毒性(complement
‑
dependent cytotoxicity，cdc)是补体系统的功能。其是免疫系统中的过程，通过破坏病原体的膜来杀伤病原体而没有免疫系统的抗体或细胞的参与。存在三种主要过程。所有这三种过程都将一种或更多种膜攻击复合体(membrane attack complex，mac)插入病原体中，这引起致死的胶体
‑
渗透肿胀，即cdc。其是抗体或抗体片段具有细胞毒性作用的机制之一。
[0239]
f.组合治疗
[0240]
在某些实施方案中，本发明实施方案的组合物和方法涉及与第二或另外的治疗(例如化学治疗或免疫治疗)组合的针对同三聚体i型胶原蛋白以抑制其活性的抗体或抗体片段。这样的治疗可应用于治疗与同三聚体i型胶原蛋白升高相关的任何疾病。例如，疾病可以是癌症或纤维性病。
[0241]
包括组合治疗在内的方法和组合物增强了治疗或保护作用，和/或提高了另一抗癌或抗过度增殖治疗的治疗作用。治疗和预防方法以及组合物可以以有效地实现期望作用(例如杀伤癌细胞和/或抑制细胞过度增殖)的组合量提供。该过程可涉及使细胞与抗体或抗体片段和第二治疗二者接触。组织、肿瘤或细胞可与包含一种或更多种药剂(即抗体或抗体片段或抗癌剂)的一种或更多种组合物或一种或更多种药理制剂接触，或者通过使组织、肿瘤和/或细胞与两种或更多种不同的组合物或制剂接触，其中一种组合物提供1)抗体或抗体片段，2)抗癌剂，或3)抗体或抗体片段和抗癌剂二者。此外，预期了可将这样的组合治疗与化学治疗、放射治疗、外科手术治疗或免疫治疗结合使用。
[0242]
术语“接触”和“暴露”当应用于细胞时在本文中用于描述将治疗性构建体以及化学治疗剂或放射治疗剂递送至靶细胞或者与靶细胞直接并置放置的过程。为了实现细胞杀伤，例如，将两种药剂以有效杀伤细胞或阻止其分裂的组合量递送至细胞。
[0243]
治疗性抗体可在相对于抗癌治疗之前、期间、之后或以多种组合施用。施用可以以
同时至数分钟至数天至数周的间隔进行。在抗体或抗体片段与抗癌剂分开提供给患者的一些实施方案中，通常将确保每次递送的时间之间有意义的时间段没有到期，以使得两种化合物仍然能够对患者发挥有利的组合作用。在这样的情况下，预期在彼此相隔约12小时至24小时或72小时内，并且更特别地，在彼此相隔约6小时至12小时内，可为患者提供抗体治疗和抗癌治疗。在一些情况下，可期望将治疗时间段显著延长，其中分开施用之间间隔数天(2、3、4、5、6或7天)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
[0244]
在某些实施方案中，疗程将持续1至90天或更长(该这样的范围包括中间天数)。预期可在第1天至第90天(该这样的范围包括中间天数)的任意天或其任何组合给予一个药剂，以及在第1天至第90天(该这样的范围包括中间天数)的任意天或其任何组合给予另一药剂。在单日(24小时时期)内，可给予患者一次或多次施用一种或更多种药剂。此外，在疗程之后，预期存在未施用抗癌治疗的时间段。该时间段可持续1至7天，和/或1至5周，和/或1至12个月或更长(该这样的范围包括中间天数)，取决于患者的状况，例如其预后、体力(strength)、健康等。预期将根据需要重复治疗周期。
[0245]
可采用多种组合。对于以下的实例，抗体治疗是“a”，并且抗癌治疗是“b”：
[0246][0247]
预期到药剂的毒性(如果有的话)，向患者施用本发明实施方案的任何化合物或治疗将遵循用于施用这样的化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，存在监测归因于组合治疗的毒性的步骤。
[0248]
1.化学治疗
[0249]
根据本发明实施方案，可使用广泛多种的化学治疗剂。术语“化学治疗”是指使用药物来治疗癌症。“化学治疗剂”用于表示在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物通过其在细胞内的活性模式(例如其是否影响细胞周期和在什么阶段影响细胞周期)进行分类。或者，药剂可基于其直接交联dna、嵌入dna中或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来表征。
[0250]
化学治疗剂的一些实例包括包括烷化剂类，例如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯类，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷类，例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三甲蜜胺；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱类(包括合成的类似物拓扑替康)；苔藓虫素；卡利他汀(callystatin)；cc
‑
1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素；倍癌霉素(包括合成类似物kw
‑
2189和cb1
‑
tm1)；五加素；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇类；海绵抑制素；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺和尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，例如烯二炔类抗生
素(例如，加利车霉素，尤其是加利车霉素γ1i和加利车霉素ωi1)；达因霉素，包括达因霉素a；二膦酸盐类，例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素类；以及新制癌菌素发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c(cactinomycin)、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6
‑
重氮
‑5‑
氧代
‑
l
‑
正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代
‑
多柔比星、氰基吗啉代
‑
多柔比星、2
‑
吡咯啉基
‑
多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类(例如丝裂霉素c)、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类、培洛霉素、泼非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢物类，例如甲氨蝶呤和5
‑
氟脲嘧啶(5
‑
fu)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6
‑
巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6
‑
氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素，例如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗肾上腺类，例如米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；贝斯布西；比生群；依达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依洛尼塞；依利醋铵；埃博霉素类；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登木素生物碱类，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2
‑
乙酰肼；丙卡巴肼；psk多糖复合物；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2’,2
”‑
三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是t
‑
2毒素、疣孢菌素a、漆斑菌素a和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星；阿拉伯糖苷(“ara
‑
c”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛吉西他滨；6
‑
硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位络合物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(vp
‑
16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如，cpt
‑
11)；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(dfmo)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨、卡铂、丙卡巴肼、普卡霉素、吉西他滨、诺维本、法尼基
‑
蛋白质转移酶抑制剂、反铂，以及上述任意一种的可药用的盐、酸或衍生物。
[0251]
2.放射治疗
[0252]
导致dna损伤并已广泛使用的其他因素包括通常被称为γ射线、x射线和/或向肿瘤细胞定向递送放射性同位素的那些。还预期了其他形式的dna损伤因素，例如微波、质子束辐照(美国专利5,760,395和4,870,287)以及uv辐照。很可能所有这些因素均对dna、dna前体、dna的复制和修复以及染色体的组装和维持产生广泛的损害。x射线的剂量范围为从50至200伦琴的日剂量持续延长的时间段(3至4周)到2000至6000伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、发出的辐射的强度和类型以及赘生性细胞的摄取。
[0253]
3.免疫治疗
[0254]
技术人员将理解的是，免疫治疗可与一些实施方案的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫治疗通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗是这样的一个实例。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上
的一些标志物具有特异性的抗体。单独的抗体可用作治疗的效应物或者其可募集其他细胞以实际上影响细胞杀伤。抗体还可与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白a链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并且仅用作靶向剂。或者，效应物可以是携带直接或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋巴细胞。多种效应物细胞包括细胞毒性t细胞和nk细胞。
[0255]
在免疫治疗的一个方面中，肿瘤细胞必须具有适用于靶向(即，不存在于大多数其他细胞上)的一些标志物。存在许多肿瘤标志物，并且这些肿瘤标志物中的任何一种可适用于本发明实施方案的上下文中的靶向。常见的肿瘤标志物包括cd20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、tag
‑
72、hmfg、唾液酸化的路易斯抗原(sialyl lewis antigen)、muca、mucb、plap、层黏连蛋白受体、erb b和p155。免疫治疗的另一个方面是将抗癌作用与免疫刺激作用组合。还存在免疫刺激分子，其包括：细胞因子，例如il
‑
2、il
‑
4、il
‑
12、gm
‑
csf、γ
‑
ifn；趋化因子，例如mip
‑
1、mcp
‑
1、il
‑
8；以及生长因子，例如flt3配体。
[0256]
目前正在研究或应用的免疫治疗的一些实例是免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169)；细胞因子治疗，例如干扰素α、β和γ，il
‑
1，gm
‑
csf和tnf；基因治疗，例如tnf、il
‑
1、il
‑
2和p53(美国专利5,830,880和5,846,945)；以及单克隆抗体，例如抗cd20、抗神经节苷脂gm2和抗p185(美国专利5,824,311)。预期可将一种或更多种抗癌治疗与本文中所述的抗体治疗一起使用。
[0257]
在一些实施方案中，免疫治疗可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点或调高信号(例如，共刺激分子)或调低信号。可通过免疫检查点阻断被靶向的抑制性免疫检查点包括：腺苷a2a受体(a2a receptor，a2ar)、b7
‑
h3(也称为cd276)、b和t淋巴细胞弱化子(b and t lymphocyte attenuator，btla)、细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic t
‑
lymphocyte
‑
associated protein 4，ctla
‑
4，也称为cd152)、吲哚胺2,3
‑
双加氧酶(indoleamine 2,3
‑
dioxygenase，ido)、杀伤细胞免疫球蛋白(killer
‑
cell immunoglobulin，kir)、淋巴细胞活化基因
‑
3(lymphocyte activation gene
‑
3，lag3)、程序性死亡1(programmed death 1，pd
‑
1)、t
‑
细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(t
‑
cell immunoglobulin domain and mucin domain 3，tim
‑
3)和t细胞活化的v结构域ig抑制剂(v
‑
domain ig suppressor of t cell activation，vista)。特别地，免疫检查点抑制剂靶向pd
‑
1轴和/或ctla
‑
4。
[0258]
免疫检查点抑制剂可以是药物，例如小分子、重组形式的配体或受体、或者特别地可以是抗体，例如人抗体(例如，国际专利公开wo2015016718，其通过引用并入本文)。可使用免疫检查点蛋白或其类似物的已知抑制剂，特别地，可使用嵌合的、人源化的或人形式的抗体。如技术人员将知道的，替代和/或等同的名称可用于本公开内容中提及的某些抗体。在本公开内容的上下文中，这样的替代和/或等同名称是可互换的。例如，已知拉立珠单抗(lambrolizumab)也以替代和等同的名称mk
‑
3475和派姆单抗(pembrolizumab)而为人所知。
[0259]
在一些实施方案中，pd
‑
1结合拮抗剂是抑制pd
‑
1与其配体结合伴侣结合的分子。在一个具体方面中，pd
‑
1配体结合伴侣是pdl1和/或pdl2。在另一个实施方案中，pdl1结合拮抗剂是抑制pdl1与其结合伴侣结合的分子。在一个具体方面中，pdl1结合伴侣是pd
‑
1和/
或b7
‑
1。在另一个实施方案中，pdl2结合拮抗剂是抑制pdl2与其结合伴侣结合的分子。在一个具体方面中，pdl2结合伴侣是pd
‑
1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体描述于美国专利no.8,735,553、8,354,509和8,008,449，其全部通过引用并入本文。用于本文中提供的方法的另一些pd
‑
1轴拮抗剂是本领域已知的，例如描述于美国专利公开no.20140294898、2014022021和20110008369，其全部通过引用并入本文。
[0260]
在一些实施方案中，pd
‑
1结合拮抗剂是抗pd
‑
1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗pd
‑
1抗体选自纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗和ct
‑
011。在一些实施方案中，pd
‑
1结合拮抗剂是免疫黏附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的fc区)融合的pdl1或pdl2的胞外部分或pd
‑
1结合部分的免疫黏附素)。在一些实施方案中，pd
‑
1结合拮抗剂是amp
‑
224。纳武单抗(也称为mdx
‑
1106
‑
04、mdx
‑
1106、ono
‑
4538、bms
‑
936558和)是wo2006/121168中描述的抗pd
‑
1抗体。派姆单抗，也称为mk
‑
3475、merck 3475、拉立珠单抗、和sch
‑
900475，是描述于wo2009/114335的抗pd
‑
1抗体。ct
‑
011，也称为hbat或hbat
‑
1，是wo2009/101611中描述的抗pd
‑
1抗体。amp
‑
224，也称为b7
‑
dcig，是wo2010/027827和wo2011/066342中描述的pdl2
‑
fc融合可溶性受体。
[0261]
可在本文中提供的方法中被靶向的另一免疫检查点是细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla
‑
4)，也称为cd152。人ctla
‑
4的完整cdna序列的genbank登录号为l15006。ctla
‑
4见于t细胞表面上并且当与抗原呈递细胞表面上的cd80或cd86结合时用作“关闭”开关。ctla4是免疫球蛋白超家族的成员，该超家族在辅助性t细胞的表面上表达并向t细胞传递抑制信号。ctla4与t细胞共刺激蛋白cd28相似，并且两个分子均与抗原呈递细胞上的cd80和cd86结合，分别还称为b7
‑
1和b7
‑
2。ctla4向t细胞传递抑制信号，而cd28则传递刺激信号。胞内ctla4也见于调节性t细胞中并且可能对调节性t细胞的功能是重要的。通过t细胞受体和cd28的t细胞活化导致ctla
‑
4(b7分子的抑制性受体)的表达提高。
[0262]
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗ctla
‑
4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。
[0263]
适用于本发明方法的抗人ctla
‑
4抗体(或来源于其的vh和/或vl结构域)可使用本领域中公知的方法产生。或者，可使用本领域公认的抗ctla
‑
4抗体。例如，公开于以下中的抗ctla
‑
4抗体可用于本文中公开的方法中：美国专利no.8,119,129、wo 01/14424、wo 98/42752；wo 00/37504(cp675,206，也称为替西木单抗(tremelimumab)；原名西木单抗(ticilimumab))，美国专利no.6,207,156；hurwitz et al.(1998)proc natl acad sci usa 95(17):10067
‑
10071；camacho et al.(2004)j clin oncology22(145):摘要no.2505(抗体cp
‑
675206)；以及mokyr et al.(1998)cancer res 58:5301
‑
5304。每个前述出版物的教导均通过引用并入于此。也可使用与这些本领域公认的抗体中任一者竞争用于与ctla
‑
4结合的抗体。例如，人源化ctla
‑
4抗体描述于国际专利申请no.wo2001014424、wo2000037504和美国专利no.8,017,114；其全部通过引用并入本文。
[0264]
示例性的抗ctla
‑
4抗体是伊匹单抗(也称为10d1、mdx
‑
010、mdx
‑
101和)或其抗原结合片段和变体(参见例如wo 01/14424)。在另一些实施方案中，抗体包含伊匹
单抗的重链和轻链cdr或vr。因此，在一个实施方案中，抗体包含伊匹单抗的vh区的cdr1、cdr2和cdr3结构域，以及伊匹单抗的vl区的cdr1、cdr2和cdr3结构域。在另一个实施方案中，抗体与如上述的抗体竞争结合ctla
‑
4上的同一表位和/或与之结合。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹单抗具有至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。
[0265]
用于调节ctla
‑
4的另一些分子包括ctla
‑
4配体和受体，所述ctla
‑
4配体和受体例如描述于美国专利no.5844905、5885796和国际专利申请no.wo1995001994和wo1998042752中，其全部通过引用并入本文；以及免疫黏附素，所述免疫黏附素例如描述于美国专利no.8329867中，其通过引用并入本文。
[0266]
在一些实施方案中，免疫治疗可以是过继免疫治疗，其涉及转移离体产生的自体抗原特异性t细胞。用于过继免疫治疗的t细胞可通过抗原特异性t细胞的扩增或通过遗传工程进行的t细胞的重定向来产生(park,rosenberg et al.2011)。已表明肿瘤特异性t细胞的分离和转移成功治疗黑素瘤。通过转基因t细胞受体或嵌合抗原受体(car)的遗传转移，已成功地在t细胞中产生了新的特异性(jena,dotti et al.2010)。car是由与单一融合分子中的一个或更多个信号传导结构域缔合的靶向部分组成的合成受体。一般而言，car的结合部分由单链抗体(scfv)的抗原结合结构域组成，该结构域包含通过柔性接头连接的单克隆抗体的轻片段和可变片段。基于受体或配体结构域的结合部分也已成功使用。第一代car的信号传导结构域来源于cd3ζ的胞质区或fc受体γ链。car已成功地使t细胞针对来自多种恶性肿瘤(包括淋巴瘤和实体瘤)的肿瘤细胞表面表达的抗原重定向。
[0267]
在一个实施方案中，本技术提供了用于治疗癌症的组合治疗，其中所述组合治疗包含过继t细胞治疗和检查点抑制剂。在一个方面中，过继t细胞治疗包含自体和/或同种异体t细胞。在另一个方面中，自体和/或同种异体t细胞靶向肿瘤抗原。
[0268]
4.外科手术
[0269]
约60％患有癌症的人将经历某种类型的外科手术，其包括预防性、诊断性或阶段性、治愈性和姑息性外科手术。治愈性外科手术包括其中将全部或部分癌组织物理地去除、切除和/或破坏，并且可与另一些治疗(例如本发明实施方案的治疗、化学治疗、放射治疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或替代治疗)结合使用的切除术。肿瘤切除术是指物理去除至少一部分肿瘤。除肿瘤切除术之外，通过外科手术的治疗包括激光外科手术、冷冻外科手术、电外科手术和显微控制的外科手术(莫氏外科手术(mohs’surgery))。
[0270]
在切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤之后，可在体内形成腔。治疗可通过灌注、直接注射或向该区域局部应用另外的抗癌治疗来实现。可重复这样的治疗，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可具有多种剂量。
[0271]
5.其他药剂
[0272]
预期可将其他药剂与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的治疗效力。这些另外的药剂包括影响细胞表面受体和gap连接的上调的药剂、细胞抑制剂和分化剂、细胞黏附抑制剂、提高过度增殖细胞对凋亡诱导剂敏感性的药剂或其他生物药剂。通过升高gap连接数提高胞间信号传导，将提高对邻近的过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在另一些实施方案中，细胞抑制剂或分化剂可与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高
治疗的抗过度增殖效力。预期细胞黏附抑制剂提高本发明实施方案的效力。细胞黏附抑制剂的一些实例是黏着斑激酶(focal adhesion kinase，fak)抑制剂和洛伐他汀(lovastatin)。还预期可将提高过度增殖细胞对凋亡的敏感性的另一些药剂，例如抗体c225，与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗效力。
[0273]
iii.免疫检测方法
[0274]
在另一些实施方案中，本公开内容涉及用于结合、定量和以其他方式通常检测同三聚体i型胶原蛋白的免疫检测方法。其他免疫检测方法包括用于确定对象中同三聚体i型胶原蛋白的存在的特异性测定。预期了广泛多种测定形式，但具体地是将用于在从对象获得的组织样品中检测同三聚体i型胶原蛋白的那些，例如活检。这些测定可以以试剂盒的形式包装，并带有适当的试剂和允许使用的说明。
[0275]
一些免疫检测方法包括酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)、免疫放射测定、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定和western印迹等。在科学文献中已描述了可用免疫检测方法的多个步骤。通常来说，免疫结合方法包括获得怀疑含有同三聚体i型胶原蛋白的样品并根据本公开内容使样品与第一抗体接触，视情况而定，这在有效允许免疫复合体形成的条件下进行。
[0276]
免疫结合方法还包括用于检测和定量样品中同三聚体i型胶原蛋白或相关组分的量以及检测和定量在结合过程期间形成的任何免疫复合体的方法。在此，将获得怀疑含有同三聚体i型胶原蛋白的样品，并使该样品与结合同三聚体i型胶原蛋白的抗体接触，随后检测并定量在特定条件下形成的免疫复合体的量。就抗原检测而言，所分析的生物样品可以是任何怀疑含有同三聚体i型胶原蛋白的样品，例如组织切片或试样、均质化组织提取物或生物流体。
[0277]
使所选生物样品与抗体在有效条件下接触并持续足以允许形成免疫复合体(初级免疫复合体)的时间通常是简单地将抗体组合物添加至样品并将混合物孵育足够长的时间以使抗体与同三聚体i型胶原蛋白形成免疫复合体(即与之结合)的问题。在该时间之后，通常对样品
‑
抗体组合物，例如组织切片、elisa板、斑点印迹或western印迹进行洗涤以去除任何非特异性结合的抗体种类，从而允许只有特异性结合在初级免疫复合体中的那些抗体被检测到。
[0278]
通常来说，免疫复合体形成的检测是本领域中公知的，并且可通过应用多种方法来实现。这些方法通常基于标记或标志物(例如那些放射性标签、荧光标签、生物标签和酶标签中的任一种)的检测。有关使用这样的标记的专利包括美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。当然，如本领域中已知的，通过使用第二结合配体例如第二抗体和/或生物素/抗生物素蛋白配体结合布置，可发现另外的优点。
[0279]
用于检测的抗体可本身与可检测标记连接，其中然后将简单地检测该标记，从而允许确定组合物中初级免疫复合体的量。或者，可通过对第一抗体具有结合亲和力的第二结合配体来检测结合在初级免疫复合体中的该抗体。在这些情况下，第二结合配体可与可检测标记连接。第二结合配体本身通常是抗体，其因此可称为“第二”抗体。使初级免疫复合体与经标记的第二结合配体或抗体在有效条件下接触并持续足以允许形成次级免疫复合体的时间。然后，通常洗涤次级免疫复合体以去除任何非特异性结合的经标记的第二抗体
或配体，并且随后检测次级免疫复合体中的剩余标记。
[0280]
另一些方法包括通过两步法检测初级免疫复合体。如上所述，将对抗体具有结合亲和力的第二结合配体(例如抗体)用于形成次级免疫复合体。在洗涤之后，再次使次级免疫复合体与对第二抗体具有结合亲和力的第三结合配体或抗体在有效条件下接触并持续足以允许形成免疫复合体(三级免疫复合体)的时间。第三配体或抗体与可检测标记连接，从而允许检测由此形成的三级免疫复合体。如果期望的话，该系统可提供信号放大。
[0281]
一种免疫检测方法使用两种不同的抗体。将第一生物素化抗体用于检测靶抗原，并且然后将第二抗体用于检测与复合生物素连接的生物素。在该方法中，首先将待测试样品在包含第一步抗体的溶液中孵育。如果存在靶抗原，则一些抗体与抗原结合形成生物素化抗体/抗原复合体。然后通过在链霉抗生物素蛋白(或抗生物素蛋白)、生物素化dna和/或互补生物素化dna的连续溶液中孵育来扩大抗体/抗原复合体，其中每个步骤向抗体/抗原复合体添加另外的生物素位点。重复扩大步骤直至达到合适的扩大水平，此时将样品在包含针对生物素的第二步抗体的溶液中孵育。该第二步抗体是经标记的，如例如经酶标记的，所述酶可用于使用色原底物通过组织酶学来检测抗体/抗原复合体的存在。经过适当扩大，可产生宏观可见的缀合物。
[0282]
另一种已知的免疫检测方法利用免疫pcr(聚合酶链反应)方法。在与生物素化dna一起孵育之前，pcr方法类似于cantor方法，然而，作为使用多轮链霉抗生物素蛋白和生物素化dna孵育的替代，将dna/生物素/链霉抗生物素蛋白/抗体复合体用低ph或高盐缓冲液洗掉，这释放抗体。然后将所得洗涤溶液用于用合适的引物与合适的对照进行pcr反应。至少在理论上，pcr的巨大扩增能力和特异性可用于检测单抗原分子。
[0283]
a.elisa
[0284]
免疫测定就其最简单和直接而言是结合测定。某些优选的免疫测定是本领域中已知的多种类型的酶联免疫吸附测定(elisa)和放射免疫测定(ria)。使用组织切片的免疫组织化学检测也特别有用。然而，将容易理解的是，检测不限于此类技术，并且也可使用western印迹、斑点印迹、facs分析等。
[0285]
在一种示例性elisa中，将本公开内容的抗体固定在表现出蛋白质亲和力的所选表面上，例如聚苯乙烯微量滴定板中的孔上。然后，向孔添加怀疑包含同三聚体i型胶原蛋白的受试组合物。在结合并洗涤以去除非特异性结合的免疫复合体之后，可检测结合的抗原。检测可通过添加与可检测标记连接的另外的抗同三聚体i型胶原蛋白抗体来实现。这种类型的elisa是简单的“夹心elisa”。检测也可通过添加第二抗同三聚体i型胶原蛋白抗体，随后添加对该第二抗体具有结合亲和力的第三抗体来实现，其中该第三抗体与可检测标记连接。
[0286]
在另一种示例性elisa中，将怀疑包含同三聚体i型胶原蛋白的样品固定在孔表面上，并随后与本公开内容的抗同三聚体i型胶原蛋白抗体接触。在结合并洗涤以去除非特异性结合的免疫复合体之后，检测结合的抗同三聚体i型胶原蛋白抗体。当初始抗同三聚体i型胶原蛋白抗体与可检测标记连接时，可直接检测免疫复合体。同样，可使用对第一抗同三聚体i型胶原蛋白抗体具有结合亲和力的第二抗体来检测免疫复合体，其中第二抗体与可检测标记连接。
[0287]
不论使用何种形式，elisa都具有某些共同特征，例如包被、孵育和结合、洗涤以去
除非特异性结合的物质以及检测结合的免疫复合体。以下对这些进行描述。
[0288]
在用抗原或抗体包被板中，通常用抗原或抗体的溶液孵育板的孔过夜或持续指定的一段时间。然后对板的孔进行洗涤以去除不完全吸附的物质。然后，将孔的任何剩余可用表面用相对于受试抗血清为抗原中性的非特异性蛋白质“包被”。这些包括牛血清白蛋白(bsa)、酪蛋白或乳粉溶液。包被允许封闭固定表面上的非特异性吸附位点，并且因此降低由抗血清在表面上的非特异性结合引起的背景。
[0289]
在elisa中，更习惯于使用二级或三级检测方法而不是直接操作。因此，在蛋白质或抗体与孔结合，用非反应性物质包被以降低背景，并洗涤以去除未结合的物质之后，使固定表面与待测试的生物样品在有效允许免疫复合体(抗原/抗体)形成的条件下接触。然后，免疫复合体的检测需要经标记的第二结合配体或抗体，以及与经标记的第三抗体或第三结合配体联合的第二结合配体或抗体。
[0290]“在有效允许免疫复合体(抗原/抗体)形成的条件下”意指该条件优选包括用溶液(例如bsa、牛丙种球蛋白(bovine gamma globulin，bgg)或磷酸缓冲盐水(phosphate buffered saline，pbs)/吐温)来稀释抗原和/或抗体。这些添加的试剂还倾向于有助于降低非特异性背景。
[0291]“合适的”条件还意指孵育在足以允许有效结合的温度或时间下进行。孵育步骤通常在优选为约25℃至27℃的温度下进行约1至2至4小时左右，或者可在约4℃左右下过夜进行。
[0292]
在elisa中所有孵育步骤之后，洗涤接触的表面以去除未复合的物质。一个优选的洗涤过程包括用溶液例如pbs/吐温或硼酸盐缓冲液洗涤。在受试样品与最初结合物质之间形成特异性免疫复合体并随后进行洗涤之后，可确定甚至是微量的免疫复合体的出现。
[0293]
为了提供检测手段，第二或第三抗体具有缔合的标记以允许检测。优选地，这是在与合适的显色底物孵育之后产生显色的酶。因此，例如，期望在有利于发生进一步的免疫复合体形成的时间和条件下使初级和次级免疫复合体与脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或过氧化氢酶缀合的抗体接触或孵育(例如，在室温下在含有pbs的溶液(例如pbs
‑
吐温)中孵育2小时)。
[0294]
在与经标记的抗体孵育并随后进行洗涤以去除未结合的物质之后，对标记的量进行定量，例如通过与显色底物(例如尿素或溴甲酚紫或2,2
’‑
联氮基
‑
二
‑
(3
‑
乙基
‑
苯并噻唑啉
‑6‑
磺酸(abts)或h2o2(在过氧化物酶作为酶标记的情况下))一起孵育进行。然后通过测量产生的颜色的程度，例如使用可见光谱分光光度计实现定量。
[0295]
在另一个实施方案中，本公开内容预期使用竞争形式。这在检测样品中诺如病毒(norovirus)抗体的情况下特别有用。在基于竞争的测定中，未知量的分析物或抗体通过其置换已知量的经标记抗体或分析物的能力来确定。因此，信号的可量化损失表明样品中未知抗体或分析物的量。
[0296]
b.western印迹
[0297]
western印迹(或者，蛋白质免疫印迹)是用于在给定的组织匀浆或提取物样品中检测特定蛋白质的分析技术。其使用凝胶电泳通过多肽的长度(变性条件)或通过蛋白质的3
‑
d结构(天然/非变性条件)来分离天然或变性的蛋白质。然后将蛋白质转移到膜(通常是硝酸纤维素或pvdf)上，在膜上使用对靶蛋白具有特异性的抗体对其进行探测(检测)。
[0298]
样品可取自整个组织或来自细胞培养物。在大多数情况下，首先使用搅拌器(用于较大的样品体积)、使用均化器(较小的体积)或通过声处理将实体组织机械破碎。细胞也可通过上述机械方法之一破裂。可使用多种洗涤剂、盐和缓冲液来促进细胞裂解和使蛋白质溶解。通常添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂以防止样品被其自身的酶消化。组织制备通常在低温下进行以避免蛋白质变性。
[0299]
使用凝胶电泳分离样品的蛋白质。蛋白质的分离可通过等电点(pi)、分子量、电荷或这些因素的组合来进行。分离的本质取决于样品的处理和凝胶的性质。这是确定蛋白质的非常有用的方法。也可使用二维(two
‑
dimensional，2
‑
d)凝胶，其将来自单个样品的蛋白质以两个维度散布。在第一维度中根据等电点(蛋白质具有中性净电荷时的ph)分离蛋白质，而在第二维度中根据其分子量分离蛋白质。
[0300]
为了使蛋白质易于进行抗体检测，将其从凝胶中移动到由硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯(pvdf)制成的膜上。将膜放置在凝胶的顶部，并在其顶部放置一叠滤纸。将整叠放置在缓冲溶液中，该缓冲溶液通过毛细作用移动至纸上，从而使蛋白质随之移动。用于转移蛋白质的另一种方法称为电印迹，并且使用电流将蛋白质从凝胶拉到pvdf或硝酸纤维素膜中。蛋白质在维持其在凝胶中具有的组织的同时从凝胶中移动到膜上。作为该印迹过程的结果，蛋白质被暴露在薄的表面层上用于检测(参见下文)。选择这两种膜是因为其非特异性的蛋白质结合特性(即，同等良好地结合所有蛋白质)。蛋白质结合基于疏水性相互作用以及膜与蛋白质之间的带电相互作用。硝酸纤维素膜比pvdf便宜，但更加易脆而不能良好地经受反复探测。蛋白质从凝胶转移到膜上的均匀性和整体有效性可通过用考马斯亮蓝或丽春红s(ponceau s)染料对膜进行染色来检查。一旦转移，就使用经标记的初级抗体或未经标记的初级抗体并随后使用经标记蛋白a或与初级抗体的fc区结合的第二经标记抗体进行间接检测来检测蛋白质。
[0301]
c.侧流测定
[0302]
侧流测定，也称为侧流免疫色谱测定，是旨在检测样品(基质)中靶分析物的存在(或不存在)，而无需专用且昂贵的设备的简单装置，尽管存在许多基于实验室的由阅读设备支持的应用。通常来说，这些测试用作低资源医学诊断，用于家庭测试，即时测试(point of care testing)或实验室使用。家庭妊娠测试是广泛传播且公知的应用。
[0303]
该技术基于一系列毛细管床，例如若干件多孔纸或烧结聚合物。这些元件中的每一个都具有自发运输流体(例如尿)的能力。第一元件(样品垫)充当海绵，并容纳过量的样品流体。一旦浸泡，流体迁移至制造商已在其中储存所谓缀合物的第二元件(缀合垫)，所述缀合物是在盐
‑
糖基质中干燥形式的生物活性颗粒(见下文)，该基质包含所有确保优化了靶分子(例如抗原)与其已固定在颗粒表面上的化学伴侣(例如抗体)之间的化学反应。当样品流体溶解盐糖基质时，它还溶解颗粒，并且在一种组合的运输作用下，样品和缀合物混合同时流经多孔结构。以这种方式，分析物与颗粒结合，同时进一步迁移通过第三毛细管床。该材料具有一个或更多个区域(通常称为条带(stripe))，制造商已将第三分子固定在该区域上。当样品
‑
缀合物混合物到达这些条带时，分析物已结合在颗粒上，并且第三“捕获”分子结合复合体。一段时间之后，当越来越多的流体已通过条带时，颗粒积累，并且条纹区域变色。通常来说，至少有两个条带：一个(对照)捕获任何颗粒，并从而表明反应条件和技术运行良好，第二个包含特定的捕获分子，并且仅捕获已将分析物分子固定在其上的那些颗
粒。在通过这些反应区之后，流体进入最终的多孔材料，芯(wick)，其仅充当废物容器。侧流测试可作为竞争性测定或夹心测定使用。侧流测定在美国专利6,485,982中公开。
[0304]
d.免疫组织化学
[0305]
本公开内容的抗体还可与新鲜冷冻和/或福尔马林固定石蜡包埋的组织块二者联合使用，所述组织块为了通过免疫组织化学(immunohistochemistry，ihc)进行研究而制备。由这些颗粒状样本制备组织块的方法已成功用于多种预后因子的先前ihc研究中，并且是本领域技术人员公知的。
[0306]
简言之，冷冻切片可通过以下来制备：在室温下在小塑料囊中的磷酸缓冲盐水(pbs)中将50ng冷冻的“粉碎”组织再水合；通过离心使颗粒沉淀；将其重悬在黏性包埋介质(oct)中；将囊倒置和/或通过离心再次沉淀；在
‑
70℃异戊烷中速冻；切割塑料囊和/或取出冷冻的组织圆柱状物；将组织圆柱状物固定在低温恒温切片机卡盘上；和/或从囊上切下25至50个连续切片。或者，可将整个冷冻的组织样品用于连续切片切割。
[0307]
可通过类似的方法制备永久切片，其包括在塑料微量离心管中将50mg样品再水合；沉淀；重悬于10％福尔马林中固定4小时；洗涤/沉淀；重悬于温热的2.5％琼脂中；沉淀；在冰水中冷却以使琼脂硬化；从管中取出组织/琼脂块；将块浸入和/或包埋在石蜡中；和/或切割多至50个连续的永久切片。同样，整个组织样品可替换。
[0308]
e.免疫检测试剂盒
[0309]
在另一些实施方案中，本公开内容涉及与上述免疫检测方法一起使用的免疫检测试剂盒。由于抗体可用于检测同三聚体i型胶原蛋白，因此试剂盒中可包含抗体。免疫检测试剂盒因此在合适的容器装置中包含与同三聚体i型胶原蛋白结合的第一抗体和任选地免疫检测试剂。
[0310]
在某些实施方案中，同三聚体i型胶原蛋白抗体可与固体支持物，例如柱基质和/或微量滴定板的孔预先结合。试剂盒的免疫检测试剂可采取多种形式中的任一种，包括与给定抗体缔合或连接的那些可检测标记。与第二结合配体缔合或连接的可检测标记也在预期之中。示例性的第二配体是对第一抗体具有结合亲和力的那些第二抗体。
[0311]
用于本发明试剂盒的其他合适的免疫检测试剂包括双组分试剂，其包含对第一抗体具有结合亲和力的第二抗体，以及对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体，所述第三抗体与可检测标记连接。如上所述，许多示例性的标记在本领域中是已知的，并且所有这样的标记均可结合本公开内容使用。
[0312]
试剂盒还可包含适当等分的同三聚体i型胶原蛋白组合物，无论是标记的还是未标记的，如可用于制备用于检测测定的标准曲线那样。试剂盒可包含以完全缀合形式、以中间体形式或作为将由试剂盒使用者进行缀合的独立部分的抗体
‑
标记缀合物。试剂盒的组分可包装在水性介质中或以冻干形式包装。
[0313]
试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器装置，其中可放置抗体，或者优选将抗体适当地等分。本公开内容的试剂盒通常还包括用于封闭限制式容纳抗体、抗原和任何其他试剂容器以用于商业销售的装置。这样的容器可包括其中保持期望小瓶的注塑或吹塑的塑料容器。
[0314]
iv.实施例
[0315]
包括以下实施例以表明本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解，以
下实施例中公开的技术代表了本发明人发现在本发明的实施中良好发挥作用的技术，并且因此可被认为构成了用于其实践的优选模式。然而，本领域技术人员应理解，根据本公开内容，可对公开的具体实施方案进行许多改变并且仍然获得相同或类似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。
[0316]
材料和方法
[0317]
小鼠fsf
‑
kras
g12d/
(schonhuber et al.,2014)、pdx1
‑
flp(schonhuber et al.,2014)、trp53
frt/
(lee et al.,2012)、lsl
‑
kras
g12d/
(hingorani et al.,2005)、trp53
loxp/
(chen et al.,2005)、pdx1
‑
cre((hingorani et al.,2005)、αsma
‑
cre(lebleu et al.,2013)和fsp1
‑
cre(xue et al.,2003；bhowmick et al.,2004)小鼠品系先前已有文献记载。col1a1
loxp/loxp
小鼠品系(具有loxp侧翼外显子2至5)从购自欧洲小鼠突变细胞储库(european mouse mutant cell repository，eummcr)的col1a1
tm1a(eucomm)wtsi
品系建立。rosa26
‑
cag
‑
loxp
‑
frt
‑
终止子
‑
frt
‑
萤火虫萤光素酶
‑
egfp
‑
loxp
‑
renillaluc
‑
tdtomato(称为r26
dual
)小鼠品系包含新的r26
dual
双重荧光报道等位基因，其允许egfp在pdx1
‑
flp转基因的控制下表达，或允许tdtomato在αsma
‑
cre和fsp1
‑
cre转基因的控制下表达。对于fsf
‑
kras
g12d/
；pdx1
‑
flp(称为kf)或fsf
‑
kras
g12d/
；trp53
frt/frt
；pdx1
‑
flp(称为kppf)小鼠的基因型和疾病表型的表征按照先前所述(schonhuber et al.,2014)来进行。将kf和kppf小鼠与αsma
‑
cre、pdx1
‑
cre、fsp1
‑
cre、col1a1
loxp/loxp
或r26
dual
小鼠品系杂交，从而产生kf；αsma
‑
cre；col1a1
loxp/loxp
(称为kf；col1
smako
)、kf；pdx1
‑
cre；col1a1
loxp/loxp
(称为kf；col1
pdxko
)、kppf；αsma
‑
cre；col1a1
loxp/loxp
(称为kppf；col1
smako
)和kppf；fsp1
‑
cre；col1a1
loxp/loxp
(称为kppf；col1
fspko
)小鼠。这些小鼠允许在表达αsma或fsp1的pdac相关成纤维细胞亚群中缺失col1a1。将lsl
‑
kras
g12d
；pdx1
‑
cre(称为kc)或lsl
‑
kras
g12d
；trp53
loxp/loxp
；pdx1
‑
cre(称为kppc)小鼠与col1a1
loxp/loxp
小鼠品系杂交，从而产生kc；col1a1
loxp/loxp
(称为kc；col1
pdxko
)和kppc；col1a1
loxp/loxp
(称为kppc；col1
pdxko
)小鼠。这些小鼠允许在pdac细胞中缺失col1a1。在无随机化或不知情(blinding)的情况下监测并分析具有期望基因型的上述实验小鼠。将具有对于pdac所期望的一种或更多种基因型的雌性和雄性小鼠二者都用于实验小鼠。所有小鼠均在md anderson癌症中心(md anderson cancer center，mdacc)动物设施的标准饲养条件下饲养，并且所有动物程序均经过mdacc机构动物护理和使用委员会(mdacc institutional animal care and use committee)的审查和批准。
[0318]
实施例1
‑
双重重组酶系统(dual
‑
recombinase system，drs)小鼠模型诱导自发性胰腺癌，并允许在多种靶细胞群中进行遗传调节
[0319]
用于胰腺癌的新的双重重组酶系统(drs)小鼠模型利用翻转酶
‑
frt(flp
‑
frt)系统诱导pdx1谱系(fsf
‑
kras
g12d/
；trp53
frt/frt
；pdx1
‑
flp)中致癌kras表达和p53丧失，取代了在广泛使用的kpc(lsl
‑
kras
g12d/
；trp53
r172h/
或trp53
loxp/loxp
；pdx1
‑
cre)小鼠模型中的传统cre
‑
loxp系统。这种基于flp
‑
frt的drs(fsf
‑
kras
g12d/
；trp53
frt/frt
；pdx1
‑
flp，简称“kppf”)小鼠模型以与传统的基于cre
‑
loxp(lsl
‑
kras
g12d/
；trp53
loxp/loxp
；pdx1
‑
cre，简称“kppc”)小鼠模型几乎相同的方式发展胰腺上皮内瘤(pancreatic intraepithelial neoplasia，panin)和胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，pdac)(图7a至d)，也如drs模型的原始研究所表明(schonhuber et al.,2014)。如所预期的，两种胰腺癌小鼠模型系统在疾病发展期间均表现出显著的i型胶原蛋白(col1)沉积。重要地，这种新的
drs模型系统允许添加另一个具有cre转基因和条件性敲除(以loxp位点为侧翼)等位基因的遗传操纵系统，而独立于由基于flp
‑
frt的系统诱导的自发性pdac。
[0320]
为了测试包含cre
‑
loxp和flp
‑
frt系统二者的该drs小鼠模型的功能，新的谱系追踪双重报道分子(rosa26
‑
cag
‑
loxp
‑
frt
‑
终止子
‑
frt
‑
萤火虫萤光素酶
‑
egfp
‑
loxp
‑
renillaluc
‑
tdtomato，在下文中称为r26
dual
)用于产生kppf；αsma
‑
cre；r26
dual
小鼠(图7e)。在该小鼠品系的pdac组织中，pdx1谱系癌细胞表现出egfp表达，而αsma谱系活化的psc表现出tdtomato表达(图7f和g)，分别证实了通过pdx
‑
flp和αsma
‑
cre的遗传重组。
[0321]
实施例2
‑
i型胶原蛋白(col1)沉积随panin/pdac发展阶段而变化
[0322]
在panin/pdac发展期间，在连续切片上使用ihc染色方法，检查与ck19和αsma(分别为癌细胞和活化的psc的标志物)的表达水平相比的col1的表达(图8a至b)。前述蛋白质的表达显示出动态变化(图8c)。正常胰腺组织显示ck19、αsma或col1的存在极少/可忽略。当出现adm(或panin早期)病变时，由于psc响应于胰腺上皮异常而活化，αsma立即升高至最高水平。这些活化的psc开始产生间质col1，导致在随后的panin阶段col1纤维的峰值水平。当疾病从panin继续发展到pdac时，癌细胞群超过了基质组分，这与降低的αsma阳性区域或col1阳性区域的存在一致。
[0323]
特别地，在panin/pdac的整个发展中，ck19的水平不断提高。αsma在腺泡至导管化生(acinar
‑
to
‑
ductal metaplasia，adm)或早期panin阶段达到最高水平，表明αsma阳性psc响应于疾病进展的极早期的立即募集和/或活化。相反，col1水平在panin阶段期间达到最高水平，并然后在发展为pdac阶段期间降低。pdac组织显示出主要的癌细胞存在(ck19阳性区域)，以及col1和αsma阳性活化的psc的稀释/降低存在。
[0324]
值得注意的是，尽管col1水平呈非线性动力学，但随着疾病进展，col1/ck19比率不断降低。这些结果表明，降低的col1/ck19比率可表明宿主对pdac发展的限制受损以及更晚期的疾病状态。
[0325]
实施例3
‑
在表达αsma的活化psc中col1的缺失加速了pdac的发展并缩短动物存活
[0326]
上述观察结果与先前表明活化的psc群(而不是胰腺癌细胞)是pdac基质中col1的主要产生者的研究一致。因此，寻求使用新的drs小鼠模型在活化的psc群中进行col1的遗传消融。如图1a所示，将kppf；col1
smako
[0327]
(fsf
‑
kras
g12d/
；trp53
frt/frt
；pdx1
‑
flp；αsma
‑
cre；col1a1
loxp/loxp
)小鼠中pdac的表达αsma的活化psc中的col1进行特异性缺失。在表达αsma的活化psc中的col1缺失导致纤维col1的水平降低、结缔组织增生和pdac组织的僵硬，如通过用ihc染色的连续切片所示(图1b)。
[0328]
在pdac的情况下，在表达αsma的活化psc中的col1缺失导致显著更短的动物存活(图2b)和在终点阶段更高的腹水发生(图2c)。在panin和pdac阶段二者均观察到kppf；col1
smako
肿瘤中col1水平降低(图2f)，其伴随着与在kppf肿瘤中相比在kppf；col1
smako
肿瘤中显著降低的col1/ck19比率(图2d)。这些观察结果还支持了这样的观点：较低的col1/ck19比率与宿主对pdac发展的限制受损以及更晚期的疾病状态相关。接下来，通过比较tcga数据库的人pdac样品中col1a1和ck19的mrna水平(rna seq v2 rsem)来检查col1/ck19比率。与转基因小鼠模型中的观察结果一致，较低的col1/ck19比率与显著更差的总存活(overall survival，os)和无进展存活(progression
‑
free survival，pfs)相关(图9)。
[0329]
产生了具有致癌kras突变但无p53丧失的kf；col1
smako
(fsf
‑
kras
g12d/
；pdx1
‑
flp；αsma
‑
cre；col1a1
loxp/loxp
)小鼠，以观察对pdac发展的早期(adm和/或panin)的影响(图10a)。检查年龄匹配(6月龄)的动物的adm和panin病变的发生。如图10b所示，kf；col1
smako
小鼠比kf同窝出生仔畜对照小鼠表现出显著更大的adm和panin病变区域。综上所述，这些观察结果与先前表明pdac微环境中肌成纤维细胞亚群的肿瘤抑制功能的发现一致。
[0330]
实施例4
‑
胰腺癌细胞中col1缺失延迟了adm和panin发展
[0331]
尽管一些研究已提出癌症相关的成纤维细胞是col1的主要产生者，但另一些研究也强调了癌细胞来源的col1的潜在独特组成和功能(sengupta et al.,2003；han et al.,2008；egeblad et al.,2010；han et al.,2010；makareeva et al.,2010)。为了实现癌细胞中col1的遗传消融，建立了另一个drs小鼠模型，kf；col1
pdxko
[0332]
(fsf
‑
kras
g12d/
；pdx1
‑
flp；pdx1
‑
cre；col1a1
loxp/loxp
)。该kf；col1
pdxko
品系具有相同的kf背景，但是整合了pdx1
‑
cre转基因(图3a)以替换先前图10a中kf；col1
smako
品系的αsma
‑
cre转基因。
[0333]
值得注意的是，kf；col1
pdxko
小鼠模型与kf；col1
smako
小鼠共享相同的对照小鼠(kf；cre
‑
阴性；col1a1
loxp/loxp
)，允许在相同的6个月龄点直接比较这三种品系之间的疾病进展状态(kf对照组、如图10a所示的在表达αsma的肌成纤维细胞中具有col1缺失的kf；col1
smako
组以及在pdx1谱系癌细胞中具有col1缺失的kf；col1
pdxko
组)。有趣的是，与kf；col1
smako
小鼠中疾病进展加速相反，在pdx1谱系癌细胞中具有col1消融的kf；col1
pdxko
小鼠比kf对照小鼠显示出显著延迟了adm和panin的发展(图3b至c和7j)。即使kf；col1
pdxko
小鼠的胰腺组织显示出比kf对照小鼠显著更好的组织学和更少的adm/panin区域，在这两个小鼠组之间，在相同panin阶段的任何给定视野内的col1沉积水平(图3b，20
×
放大图)也并无差异。这些结果表明，癌症来源的col1可具有重要的癌症支持功能，即使其存在在很大程度上可被成纤维细胞在panin阶段产生的丰富col1所掩盖。
[0334]
然而，当psc刚刚经历活化并且没有沉积大量的col1时，在kf；col1
pdxko
小鼠疾病发展的早期(adm)观察到col1水平降低(图3d)。kf；col1
pdxko
小鼠的adm病变表现出不仅col1沉积降低，而且sox9的水平显著降低(图3e至f)，sox9是胰腺器官发生以及胰腺癌起始的重要标志物(seymour et al.,2007；kopp et al.,2012)。这些观察结果表明，癌起始细胞的col1沉积支持胰腺癌的早期发展。
[0335]
除kf；col1
pdxko
小鼠模型之外，还同时生成了另一个小鼠模型，以实现pdx1谱系癌细胞中col1的遗传缺失。在此，与kc(lsl
‑
kras
g12d/
；pdx1
‑
cre)对照小鼠相比，使用传统的基于cre
‑
loxp的系统建立了kc；col1
pdxko
(lsl
‑
kras
g12d/
；pdx1
‑
cre；col1a1
loxp/loxp
)小鼠品系(图11a)。从kc；col1
pdxko
小鼠中获得了一致的结果，显示出在相同的6个月龄点时，与kc对照小鼠相比，adm和panin的发展显著延迟(图11b)。
[0336]
实施例5
‑
胰腺癌细胞中col1缺失延迟了pdac发展和动物存活
[0337]
接下来，生成了kppc；col1
pdxko
[0338]
(lsl
‑
kras
g12d/
；trp53
loxp/loxp
；pdx1
‑
cre；col1a1
loxp/loxp
)的小鼠模型，其具有致癌kras突变和由传统cre
‑
loxp系统诱导的p53纯合丧失二者(图4a)。这些具有kppc遗传背景的小鼠在45天内发展为急性pdac，导致约55日龄的动物死亡。与先前的观察结果一致(图3a至f和11a至b)，当与kppc对照小鼠相比时，kppc；col1
pdxko
小鼠中癌细胞谱系中的col1缺失
显著延长了动物存活并延迟了pdac发展(图4b)。还生成了在癌细胞中具有杂合col1a1
loxp
缺失的另外的kppc；col1
pdxko/
品系(lsl
‑
kras
g12d/
；trp53
loxp/loxp
；pdx1
‑
cre；col1a1
loxp/
)，显示出与kppc对照品系类似的动物存活(图12a)。
[0339]
在相同的28日龄时，在kppc；col1
pdxko
小鼠和kppc对照小鼠中检查疾病发展的早期。与kppc对照小鼠相比，kppc；col1
pdxko
小鼠的胰腺显示出显著更少的adm和panin病变(图4c)。在相同的52日龄时，与年龄匹配的kppc对照小鼠相比，kppc；col1
pdxko
(lsl
‑
kras
g12d/
；trp53
loxp/loxp
；pdx1
‑
cre；col1a1
loxp/loxp
)显示出显著更好的组织学(图4d和e)和降低的胰腺肿瘤负荷(图4f)。
[0340]
对来自相同的53日龄时年龄匹配的kppc；col1
pdxko
小鼠(n＝5)和kppc对照小鼠(n＝4)的肿瘤组织中的总rna进行rna测序分析。基因集富集分析(gene set enrichment analysis，gsea)显示，在kppc；col1
pdxko
肿瘤中，与干扰素应答、炎性应答、间叶性标志、il6/il2途径和kras下调的信号传导相关的标志性途径中的转录标志显著上调(图5c和d)。这些结果表明，在癌细胞中col1缺失之后，免疫应答、免疫浸润和基质应答提高，这进一步有助于抑制pdac进展。这是出乎意料的，鉴于炎症已显示出直接促进pdac的发展，而这些结果显示，在癌细胞中col1缺失之后，在具有更好的组织学的延迟的pdac发展中炎症途径上调。相比之下，gsea还显示出在kppc肿瘤中与tgf
‑
β信号传导和有丝分裂纺锤体调节相关的标志性途径中的转录标志显著上调，这与这些肿瘤中更晚期的pdac阶段一致。
[0341]
还分别对来自kppc和kppc；col1
pdxko
原代癌细胞系的总rna进行rna测序分析。在癌细胞中col1a1缺失之后观察到基因表达谱的显著改变(图5h和i)。
[0342]
实施例6
–
col1缺失之后pdac癌细胞表现出显著的表型改变
[0343]
还分别从kppc；col1
pdxko
小鼠和kppc对照小鼠的肿瘤组织中建立了原代胰腺癌细胞系。如图6a所示，当与kppc癌细胞系(以集落生长的鹅卵石形细胞)相比，kppc；col1
pdxko
原代癌细胞系显示出细胞黏附降低和独特的细胞形态(纺锤形细胞)。
[0344]
kppc；col1
pdxko
原代癌细胞系在2d细胞培养系统中的增殖比kppc癌细胞系显著更慢(mtt；图6b)。kppc；col1
pdxko
原代癌细胞系还显示出在3d matrigel中肿瘤球形成的能力受阻(图6c和d)。
[0345]
有趣的是，来自kppc小鼠的原代pdac细胞显示出col1a1而非col1a2的可检测的表达水平(图6e)，这与以下观点一致：由于col1a2基因的dna超甲基化和col1a2表达丧失，数种癌症类型的癌细胞表达col1同三聚体(α1)3。值得注意的是，来自kppc；col1
pdxko
小鼠的原代pdac细胞表现出col1a1的有效敲低，但是col4a1、col5a2和col9a1的表达水平显著升高，大概是由于补偿机制引起的(图6e)。
[0346]
为了检查col1a2基因的dna甲基化水平，在从多个pdac转基因小鼠模型(包括kf、kpf、kppf、kpc和kppc品系)的肿瘤建立的多个pdac细胞系中进行了甲基化dna免疫沉淀(methylated dna immunoprecipitation，medip)测定(图6f)。medip测定显示出在这些鼠原代pdac细胞中col1a2基因而非col1a1基因的dna超甲基化(图6f)，以及在人癌细胞系中一致的观察结果(图12c)。相比之下，从kppc小鼠肿瘤分离的成纤维细胞显示出非常低水平的col1a2 dna甲基化(图6f)，并以类似水平表达高水平的col1a1和col1a2二者(图13)。另外，脱甲基化剂5
‑
阿扎胞苷的处理部分地恢复了癌细胞而非成纤维细胞中col1a2的表达水平(图13)。这些结果证实了通过dna超甲基化抑制癌细胞中col1a2的表达。
[0347]
接下来，检查kppc和kppc；col1
pdxko
癌细胞系在用多种浓度的col1处理之后的细胞增殖。有趣的是，col1处理略微抑制了kppc癌细胞系的细胞增殖，但显著抑制了kppc；col1
pdxko
癌细胞系的增殖(图12d)。这是非常有趣的，鉴于与癌细胞来源的同三聚体col1相反，从大鼠尾腱分离的col1是异三聚体。这些观察结果与肌成纤维细胞来源的异三聚体col1抑制胰腺肿瘤的生长的结果一致，尤其是在癌细胞缺失其自身的col1a1同三聚体的情况下。这些结果表明癌细胞来源的col1同三聚体和正常组织来源的col1异三聚体具有不同的功能。
[0348]
有趣的是，kppc；col1
pdxko
癌细胞显示出出乎意料的ddr1提高，ddr1是上皮细胞和癌细胞中col1的受体之一。接下来，在存在col1补充(来自大鼠尾的col1异三聚体溶液)的情况下，测试了ddr1抑制剂(3
‑
(2
‑
(吡唑并(1,5
‑
a)嘧啶
‑6‑
基)
‑
乙炔基)苯甲酰胺化合物(7rh)对kppc癌细胞系和kppc；col1
pdxko
癌细胞系二者的作用。有趣的是，kppc；col1
pdxko
癌细胞对7rh的响应不同于kppc对照细胞，在低剂量的7rh下显示出显著的细胞生长提高。该结果表明低浓度的7rh可通过提供的col1异三聚体溶液逆转对kppc；col1
pdxko
癌细胞的生长抑制，而更高浓度的7rh最终可阻断该信号通路并显著抑制细胞增殖。
[0349]
实施例7
–
在表达fsp1的成纤维细胞亚群中的col1缺失不影响pdac进展
[0350]
鉴于先前显示出表达αsma的活化psc中的col1缺失导致panin发展加速的观察结果，接下来要询问的是在pdac内另一个成纤维细胞亚群中col1缺失是否也会导致类似的表型。使用成纤维细胞特异性fsp1
‑
cre转基因生成kppf；col1
fspko
[0351]
(fsf
‑
kras
g12d/
；trp53
frt/frt
；pdx1
‑
flp；fsp1
‑
cre；col1a1
loxp/loxp
)小鼠(图14a)。有趣的是，当与kppc同窝出生仔畜对照小鼠相比时，在表达fsp1的成纤维细胞中允许col1缺失的kppf；col1
fspko
小鼠显示出动物存活和pdac进展无差异(图14b)。如在分离的表达fsp1的原代成纤维细胞中所证实的，kppf；col1
fspko
系统有效地使col1在表达fsp1的成纤维细胞中缺失(图14c)。然而，当与kppf对照小鼠相比时，在kppf；col1
fspko
小鼠中，pdac组织中col1的总水平没有显著降低(图14d)，表明表达fsp1的成纤维细胞亚群可能不是pdac基质中col1的主要贡献者。这些结果支持了成纤维细胞亚群在pdac微环境中的异质性及其在胶原蛋白沉积中的多种贡献。
[0352]
为了进一步探查成纤维细胞亚群的异质性，生成了kppf；fsp1
‑
cre；r26
dual
小鼠(图15a)，其中pdx1谱系癌细胞表达egfp，而fsp1谱系成纤维细胞表达tdtomato。通过fsp1抗体染色与fsp1
‑
cre诱导的tdtomato信号之间的共定位证实了fsp1
‑
cre转基因在该小鼠模型中的特异性和效力(图15b)。非常有趣的是，表达fsp1的成纤维细胞显示出pdac基质的间质定位模式，这与表达αsma的活化psc的瘤周定位显著不同(图15b)。通过使用αsma抗体和fsp1抗体的免疫荧光染色，也证实了fsp1和αsma成纤维细胞亚群之间的这样的最小共定位(图15c)。
[0353]
***
[0354]
根据本公开内容，不需要过度实验就可进行和实施本文公开和要求保护的所有方法。尽管已经按照一些优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，然而对于本领域技术人员显而易见的是，可对本文中所述方法以及方法的步骤或步骤的顺序进行改变，而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，显而易见的是，可用某些在化学和生理学两个方面均相关的试剂替代本文中所述的试剂，同时实现相同或类似的结果。对于本领域技术人
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