一种利用粪菌移植提高昆明犬幼犬抗运输应激能力的方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种利用粪菌移植提高昆明犬幼犬抗运输应激能力的方法。


背景技术：

2.昆明犬有草黄、狼青、黑背3个品系，其对高原气候、严寒环境及高温均具有较强的适应性，且警用性能突出且易于训练，广泛使用在边防巡逻、侦查破案、搜查毒品和爆炸物等领域，服务于我国军队、公安刑侦战线。
3.随着大型活动与赛事的增加，从各地调集警犬参与安检搜爆工作任务的频率越来越高。尽管专用警犬运输车具有的保障设施能在一定程度改善运输条件，但运输过程中装卸、颠簸、饥渴、冷热以及陌生环境刺激等因素，均可诱导警犬发生严重的应激反应。警犬对运输应激的适应能力有个体和品种差异，如不能适应，就会出现精神萎靡、食欲不振、咳嗽、腹泻、呼吸和心率加快，影响警用性能的发挥和完成工作任务的质量，严重时休克和虚脱，甚至死亡，造成巨大的经济损失。
4.粪菌移植(fecal microbiota transplantation,fmt)是指将健康供体动物粪便的功能菌群移植到受体动物的胃肠道中，通过调整、修复、重塑受体动物的肠道菌群，达到治疗动物疾病、促进生长和提高免疫力的目的。已有研究证实，fmt可治疗人类患者的炎症性肠病和肠易激综合症，提高猪、鸡的生长性能和免疫力。而关于利用fmt技术提高警(军)犬抗运输应激能力的方法，尚无见文献报道。
5.因此，如何提供利用粪菌移植提高昆明犬幼犬抗运输应激能力的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种利用粪菌移植提高昆明犬幼犬抗运输应激能力的方法，对于警(军)犬工作具有重要经济和社会意义。同时，简单易行，可操作性强，应用前景广阔。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种利用粪菌移植提高昆明犬幼犬抗运输应激能力的方法，包括以下步骤：
9.(1)粪便供体筛选：选择养殖条件相同、警用性能优良幼公犬的外祖母作为菌源供体；
10.(2)采集供体的新鲜粪便预处理，在无菌条件下，通过溶解、过滤、离心、悬浮制备粪菌原液，加入无菌甘油，得粪菌原液，冻存备用；
11.(3)移植时，溶解冻存的粪菌原液，离心去除甘油和上清液，加入0.9％无菌生理盐水，重悬沉淀制备粪菌移植液；
12.(4)将粪菌移植液灌胃至来源于同一健康外祖母、45～55日龄的不同健康幼公犬，连续灌胃≥14天；饲喂无抗饲料。
13.进一步的：幼公犬和外祖母养殖条件相同。
14.警用性能优良：根据幼犬警用素质行为评分标准，得分在37分以上。
15.有益效果在于：新生哺乳动物肠道菌群具有强烈的母源性特征，母体来源的微生物在子代肠道菌群的形成过程中发挥重要作用，而幼龄动物的肠道菌群又对营养物质代谢、免疫系统的激活以及肠屏障功能的构建发挥重要作用，故不选择幼犬父系作为供体。另一方面，一般来说每头母犬平均每胎可生7
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9头幼犬，如果选择幼犬的母亲，就必须将几头甚至更多的幼犬母亲的粪便进行混合，而混合操作会破坏粪菌液中发挥作用的厌氧菌的丰度和多样性，从而影响粪菌移植效果，而选择幼犬的外祖母，采集其粪便制备粪菌移植液，可减少操作，增加粪菌液中厌氧菌的数量和丰富，从而保证粪菌移植的效果。
16.优选的：步骤(1)供体为狼青品系昆明犬；选择标准如下：
17.(1)具有清晰准确、追溯的系谱信息；
18.(2)正常注射疫苗、驱虫，三个月无病史、未使用抗生素；
19.(3)无狂犬病、犬瘟热、细小病毒、犬传染性肝炎；
20.(4)精神状态良好，采食无抗颗粒饲料积极，体温无异常；
21.(5)每天排便1～2次，粪便的含水率在60％～70％，粪便颜色为金黄色或褐色，形状为圆柱形、大小适中，有光泽、气味为正常的粪臭味。
22.优选的：步骤(2)预处理：加入新鲜粪便同等质量、浓度为15％的无菌甘油，置于冰上。
23.优选的：步骤(2)溶解：加入0.9％无菌生理盐水进行溶解至粪便浓度0.2g/ml，搅拌均匀。
24.优选的：步骤(2)过滤：依次通过尺寸为2.0mm、1.0mm、0.5mm、0.25mm筛除残渣和颗粒物，留滤液，并再次搅拌均匀。
25.优选的：步骤(2)离心：6000r/min；时间15min。
26.优选的：步骤(2)悬浮：将离心后的液体去上清，加入与溶解的步骤中相同体积的0.9％的无菌生理盐水，重悬沉淀，即粪菌原液。
27.优选的：步骤(3)溶解：在37℃水浴锅中解冻8～10min；离心：6000r/min，时间15min。
28.优选的：步骤(3)0.9％无菌生理盐水的加入量为粪菌原液体积的1/2～2倍。
29.进一步优选的，为粪菌原液体积的2倍。
30.优选的：步骤(4)灌胃量为1次1ml每天1次。
31.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种利用粪菌移植提高昆明犬幼犬抗运输应激能力的方法，相较于现有技术本发明可以促进血清中alt、ast、ck、glu、ldh、acth和cor浓度下降，进而显著提高幼犬的抗运输应激能力。
具体实施方式
32.下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.本发明实施例公开了一种利用粪菌移植提高昆明犬幼犬抗运输应激能力的方法。
34.实施例1
35.(1)选择养殖条件相同(幼公犬和外祖母)、警用性能优良、健康狼青品系昆明犬幼公犬fmt受体的外祖母作为菌源供体。
36.选择标准如下：1)具有清晰准确、可追溯的系谱信息；2)正常注射疫苗、驱虫，三个月无病史、未使用抗生素；3)血清elisa抗原试剂盒检测，狂犬病、犬瘟热、细小病毒、犬传染性肝炎均为阴性；4)精神状态良好，采食无抗颗粒饲料积极，体温无异常；5)每天排便2次左右，粪便的含水率在60％～70％，粪便颜色为金黄色或褐色，形状为圆柱形、大小适中，有光泽、气味为正常的粪臭味。
37.(2)采集供体犬的新鲜粪便，将其装进无菌广口瓶，加入同等质量、浓度为15％的无菌甘油，置于冰上1个小时内运至实验室；在无菌操作台中进行低温操作，将所有采集的粪便置于无菌容器中，按粪便0.2g/ml的比例加入0.9％无菌生理盐水进行溶解，搅拌均匀；依次通过2.0、1.0、0.5、0.25mm无菌的不锈钢实验室用筛，过滤掉残渣和颗粒物，再次搅拌均匀；分装至50ml无菌离心管中，以6000r/min的速率于离心机中离心15min，离心后倒掉上清液，加入与溶解步骤相同体积的0.9％的无菌生理盐水，将沉淀均匀悬浮，即粪菌原液；将制备好的粪菌原液分装至50ml菌冻存管中，加入等体积的浓度30％的无菌甘油，于
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80℃冰箱冷冻保存。
38.fmt实验前，将冷冻保存的菌液于37℃水浴锅中解冻9min，然后以6000r/min的速率于离心机中离心15min，除去甘油和上清液，加入1/2粪菌原液体积、浓度为0.9％的无菌生理盐水重悬沉淀得到高剂量fmt菌液；加入相等粪菌原液体积、浓度为0.9％的无菌生理盐水重悬沉淀得到中剂量fmt菌液；加入2倍粪菌原液体积、浓度为0.9％的无菌生理盐水重悬沉淀得到低剂量fmt菌液。
39.(3)选取来源于同一外祖母、45～55日龄、健康的20头昆明犬狼青品系幼公犬作为fmt受体，并随机分为control(空白对照组)、kml(低剂量组)、kmm(中剂量组)、kmh(高剂量组)4组，每组5头。
40.实验周期为58d，其中第1～14d每天10：00用16号灌胃针对幼犬进行灌胃，具体分组及灌服剂量如表1所示。
41.表1试验分组及灌服剂量
[0042][0043]
分别于每天的8:00、14:00、20:00单独、定量饲喂幼犬无抗颗粒饲料，自由饮水，采食排便后清理圈舍，并用0.1％新洁尔灭对圈舍进行消毒。每天11:00、17:00对幼犬进行警用性能训练。
[0044]
饲养实验结束后，将幼犬装上普通卡车，在水泥山路路面行驶120km，达到目的地1h后，前腿静脉采血、制备血清，采用比色法，使用酶标仪检测谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨
酶(ast)、碱性磷酸酶(alp)、乳酸脱氢酶(ldh)、犬血清葡萄糖(glu)、肌酸激酶(ck)；采用酶联免疫分析法，使用酶标仪检测犬皮质醇(cor)、犬促肾上腺皮质激素(acth)指标，进行幼犬运输抗应激能力测定。
[0045]
(4)fmt对昆明犬运输应激指标的影响如表2所示。与control组相比，fmt各组血清中alt、ast、ck、alp、glu、acth、cor、ldh含量均有所下降，其中kml组和kmm组差异显著(p<0.05)；且与kmm组比较，kml组alt、ast、acth含量显著降低(p<0.05)。
[0046]
表2 fmt对昆明犬运输应激指标的影响
[0047][0048]
注：同一行，字母不同者表示差异显著(p<0.05)。
[0049]
警犬在执行任务前要通过运输的方式到任务点，在运输过程中存在多种应激源促进警犬发生运输应激，导致警犬体力消耗、免疫力下降，严重时会引起相关疾病，影响警用性能的发挥，降低任务完成的质量。研究表明，alt、ast、ck、glu、ldh主要存在于动物的肌肉、心脏、肝脏的细胞浆或线粒体中，当受到应激时其血清浓度升高；同时，当动物受到应激时会激活下丘脑
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垂体
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肾上腺轴促进acth和cor激素分泌，血清浓度升高。
[0050]
结果表明，与control组相比，fmt各组血清中alt、ast、ck、glu、ldh、acth和cor浓度均有所下降，其中kml组和kmm组各项指标均显著降低，且kml组抗运输应激能力优于kmm组。说明合理选择供体、受体，应用fmt技术可提高警犬的抗运输应激能力，对警犬警用性能发挥具有保障作用，且kml组效果最优，表明fmt提高警犬抗运输应激能力作用有剂量差异。
[0051]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0052]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。