一种连翘提取物的制备方法与流程

1.本发明涉及植物提取领域，特别涉及一种连翘提取物的制备方法。


背景技术：

2.连翘为木犀科(oleaceae)连翘属(forsythia vahl)，其果实可入药，具有清热解毒，散结消肿的功效，含有挥发性成分、苯乙醇苷类、木脂素类、三萜类及酚酸类等成分，主要为连翘苷、连翘酯苷、异连翘酯苷，挥发油、连翘酚、香豆精、齐墩果酸、皂苷等，主要含有连翘酯苷a、连翘酯苷f、连翘苷以及连翘脂素等成分，连翘叶是连翘植物叶片，资源丰富，具有与连翘果实基本相同的化学成分，有的成分含量甚至高于果实；
3.当前，连翘酯苷a的提取分离方法：直接用水提取或水提物再用有机溶剂提取，提取物经硅胶制备薄层析或柱层析分离得到产物。梁文藻等(药物分析杂志，1986，6(5)，263
‑
266)从连翘中提取连翘酯苷a产物是采用化学分离方法，然后用制备性薄层板进行纯化，最后得到纯品，该提取方法效率低、大量使用了有毒有机溶剂；“一种连翘酯苷a制备方法”，公开号：cn101215302b，该发明精制工艺简单，提取效率高，按连翘酯苷a不同用途对纯度的要求，纯度可达85～99％，但是提取率只有0.5～2％，远不足以工业化生产。并且上述对连翘酯苷a的提取是在中性条件下提取，并未从酸性或碱性条件下，将连翘酯苷a提取的更完全。


技术实现要素：

4.鉴于此，本发明提出一种连翘提取物的制备方法，解决对连翘酯苷a提取效率低的问题。
5.本发明的技术方案是这样实现的：一种连翘提取物的制备方法：包括以下步骤：
6.s1、连翘叶处理：将连翘叶清洗，烘干，粉碎，过120～250目筛得干燥的连翘叶粉，备用；
7.s2、酶解：将s1获得的连翘叶粉在80～120℃下与水混合，所述连翘叶粉和水的质量体积g/ml为1～3:20～50，调节ph值至4
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7，混合均匀后加入复合酶，调节温度为40～50℃下酶解1～3h，干燥，得到连翘酶解物，在此温度下，使连翘叶中的有效成分溶出；
8.s3、配制提取溶剂：将乙醇、甲酰胺、戊二醇混合，经搅拌速率为400～600rpm下搅拌40～60min，有效针对目标成分的提取，得到提取溶剂；
9.s4、超声辅助提取：取s2得到的连翘酶解物，加入s3得到提取溶剂，在功率为500～700w下进行两段超声提取，调节ph为2一次提取40～60min，得到连翘粗提液a，将连翘粗提液a再加入上述提取溶剂，调节ph为7二次提取30～50min，得到连翘粗提液b，分别ph值为2和7的作用下进行超声提取，调节酶解物与提取溶剂之间的比例，控制超声技术，使在强酸、强碱的环境下活性较强连翘酯苷a提取更完全，得到连翘酯苷a含量高；
10.s5、萃取反洗：将s4得到的连翘粗提液b，用石油醚萃取40～60s，去脂溶性色素，过滤，取滤液，再用水饱和的正丁醇溶液萃取30～50s，除去大部分水溶性杂质，收集萃取液，干燥，得连翘提取物。
11.进一步的，所述s2中的复合酶由果胶酶、鼠李糖苷酶、磷脂酶组成，复合酶的选择。
12.进一步的，所述s2中的复合酶由质量比为1～3:0.5～2:1～2的果胶酶、鼠李糖苷酶、磷脂酶组成，在此比例下对连翘的酶解起到较好的作用，果胶酶、鼠李糖苷酶能削弱连翘内壁与外壁之间的连接，磷脂酶去除连翘中其余油脂成分，科学配比更好的酶解，且易于控制。
13.进一步的，所述s3中的提取溶剂为50～60vol％的乙醇、70～90vol％甲酰胺、20～40vol％戊二醇的混合液。
14.进一步的，所述s3中的提取溶剂的50～60vol％的乙醇、70～90vol％甲酰胺、20～40vol％戊二醇按体积比为0.1～1:1.3～2:1制得的混合液，在此配比下，获得的有效成分含量更高。
15.进一步的，所述s4中连翘酶解物与提取溶剂的质量体积g/ml比为0.5～1:20～40。
16.进一步的，所述s4中连翘粗提液a与提取溶剂的体积比为1～3:9。
17.进一步的，所述s5中连翘粗提液b与石油醚的体积比g/ml为1：10～20。
18.进一步的，所述s5中滤液与水饱和的正丁醇溶液的体积比g/ml为1：10～20。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
20.本发明的方法对连翘中的连翘酯苷a高效提取，连翘酯苷a含量为5mg/g以上，连翘酯苷a提取转移率77％以上；先将连翘叶酶解，选择果胶酶、鼠李糖苷酶、磷脂酶作为复合酶，调节温度进行酶解，将连翘叶粉酶解后将连翘叶中的有效成分溶出，有利于对连翘酯苷a的提取；配制提取溶剂，能针对目标产品进行有效提取，调整最佳配比，获得的有效成分含量更高；采用不同ph值下进行超声提取，调节酶解物与提取溶剂之间的比例，控制超声技术，发掘出连翘酯苷a在强酸、强碱的环境下，能将活性较强连翘酯苷a提取更完全，得到连翘酯苷a含量高，适合工业化生产。
具体实施方式
21.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
22.本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
23.本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
24.实施例1
25.一种连翘提取物的制备方法：包括以下步骤：
26.s1、连翘叶处理：将连翘叶清洗干净，去除烂叶，烘干，粉碎，过120目筛得干燥的连翘叶粉，备用；取果胶酶1g、鼠李糖苷酶0.5g、磷脂酶1g混合制得复合酶；
27.s2、酶解：取连翘叶粉10g在80℃下与200ml水混合，调节ph值至4，混合均匀后加入复合酶，调节温度为40℃下酶解1h，干燥，得到连翘酶解物；
28.s3、配制提取溶剂：将50vol％乙醇1ml、70vol％甲酰胺13ml、20vol％戊二醇10ml混合，经搅拌速率为400rpm下搅拌40min，得到提取溶剂；
29.s4、超声辅助提取：取s2得到的连翘酶解物5g，加入s3得到提取溶剂200ml，在功率为500w下进行两段超声提取，调节ph为2一次提取40min，得到连翘粗提液a，将连翘粗提液a再加入提取溶剂，连翘粗提液a与提取溶剂的体积比为1:9，调节ph为7提取30min，得到连翘粗提液b，
30.s5、萃取反洗：取1ml连翘粗提液b，用10ml石油醚萃取40s，过滤，取滤液，再用10ml水饱和的正丁醇溶液萃取30s，收集萃取液，干燥，得连翘提取物。
31.实施例2
32.一种连翘提取物的制备方法：包括以下步骤：
33.s1、连翘叶处理：将连翘叶清洗干净，去除烂叶，烘干，粉碎，过250目筛得干燥的连翘叶粉，备用；取果胶酶3g、鼠李糖苷酶2g、磷脂酶2g混合制得复合酶；
34.s2、酶解：取连翘叶粉30g在120℃下与500ml水混合，调节ph值至7，混合均匀后加入复合酶，调节温度为50℃下酶解3h，干燥，得到连翘酶解物；
35.s3、配制提取溶剂：将60vol％乙醇10ml、90vol％甲酰胺20ml、40vol％戊二醇10ml混合，经搅拌速率为600rpm下搅拌60min，得到提取溶剂；
36.s4、超声辅助提取：取s2得到的连翘酶解物10g，加入s3得到提取溶剂400ml，在功率为700w下进行两段超声提取，调节ph为2一次提取60min，得到连翘粗提液a，将连翘粗提液a再加入提取溶剂，连翘粗提液a与提取溶剂的体积比为3:9，调节ph为7提取50min，得到连翘粗提液b；
37.s5、萃取反洗：取1ml连翘粗提液b，用20ml石油醚萃取60s，过滤，取滤液，再用20ml水饱和的正丁醇溶液萃取50s，收集萃取液，干燥，得连翘提取物。
38.实施例3
39.一种连翘提取物的制备方法：包括以下步骤：
40.s1、连翘叶处理：将连翘叶清洗干净，去除烂叶，烘干，粉碎，过200目筛得干燥的连翘叶粉，备用；取果胶酶2g、鼠李糖苷酶1.8g、磷脂酶1.5g混合制得复合酶；
41.s2、酶解：取连翘叶粉20g在100℃下与400ml水混合，调节ph值至5，混合均匀后加入复合酶，调节温度为45℃下酶解2h，干燥，得到连翘酶解物；
42.s3、配制提取溶剂：将55vol％乙醇7ml、80vol％甲酰胺16ml、30vol％戊二醇10ml混合，经搅拌速率为500rpm下搅拌50min，得到提取溶剂；
43.s4、超声辅助提取：取s2得到的连翘酶解物7g，加入s3得到提取溶剂300ml，在功率为600w下进行两段超声提取，调节ph为2一次提取50min，得到连翘粗提液a，将连翘粗提液a再加入体积分数为55％的提取溶剂，连翘粗提液a与提取溶剂的体积比为2:9，调节ph为7提取40min，得到连翘粗提液b；
44.s5、萃取反洗：取1ml连翘粗提液b，用15ml石油醚萃取50s，过滤，取滤液，再用15ml水饱和的正丁醇溶液萃取40s，收集萃取液，干燥，得连翘提取物。
45.实施例4
46.本实施例与实施例3的区别在于，s2中的复合酶由质量比为4:0.3:3的果胶酶、鼠李糖苷酶、磷脂酶组成。
47.实施例5
48.本实施例与实施例3的区别在于，s2中的复合酶由2g果胶酶、1.8gβ
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葡萄糖苷酶、1.5g纤维素酶组成。
49.实施例6
50.本实施例与实施例3的区别在于，s3中的提取溶剂为乙醇12ml、甲酰胺23ml、戊二醇5ml。
51.实施例7
52.本实施例与实施例3的区别在于，s4中取3g连翘酶解物与500ml提取溶剂超声。
53.对比例1
54.本对比例与实施例3的区别在于，s2步骤中未将连翘叶粉酶解。
55.对比例2
56.本对比例与实施例3的区别在于，s3步骤中的提取溶剂为乙醇。
57.对比例3
58.本对比例与实施例3的区别在于，s4步骤中使用一段超声，调节ph为2提取50min。
59.一、连翘提取物中连翘酯苷a的含量测定
60.1.仪器与试药
61.agilent1100高效液相色谱仪，包括g1310a单元泵、g1313a自动进样器、g1314a vwd检测器、co
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201柱温箱、安捷伦色谱工作站；ab204
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n型电子分析天平(mettler toledo)。
62.连翘酯苷a对照品(批号111810
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201405，购自中国食品药品检定研究院，含量以94.1％计)。
63.供试品为本发明的实施例1～7和对比例1～3制得的连翘提取物；
64.甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，水为娃哈哈纯净水。
65.2.含量测定方法
66.照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录vi d)测定。
67.色谱条件与系统适用性试验 采用dikma diamonsil
‑
c18(4.6mm
×
250mm，5μm)色谱柱；甲醇
‑
0.05％磷酸水溶液(34∶66)为流动相；检测波长为330nm；体积流量1.0ml/min；柱温30℃；进样量10μl。
68.对照品溶液的制备 取连翘酯苷a对照品，精密称定12.32mg(纯度以94.1％计)，加甲醇溶解制成连翘酯苷a对照品储备溶液(0.4637mg/ml)。精密吸取连翘酯苷a对照品储备溶液1.0ml，置10ml量瓶中，用50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
69.供试品溶液的制备 取本品实施例1～7和对比例1～3的连翘提取物，分为10组，每组三组平行试验，研细，取约0.7g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
70.测得连翘酯苷a含量后计算出提取率和提取转移率
71.连翘酯苷a提取转移率的计算公式如下：
72.提取转移率＝连翘酯苷a含量/连翘提取物含量
×
100％
73.3.实验结果
[0074] 连翘酯苷a含量(mg/g)连翘酯苷a提取转移率％实施例15.6380.42实施例25.7281.85实施例35.8082.86实施例45.6180.26实施例55.5779.68
实施例65.4177.33实施例75.4778.26对比例14.8669.54对比例24.5264.58对比例34.5765.37
[0075]
由上表结果可知，本发明的方法获得连翘酯苷a的含量较高，连翘酯苷a提取转移率也比较高，说明本发明方法对连翘中的连翘酯苷a有效提取，实施例1～7和对比例1比较，将连翘叶粉酶解后将连翘叶中的有效成分溶出，有利于对连翘酯苷a的提取，与对比例2比较，在提取过程中，配制一定比例的提取溶剂，有效针对目标成分的提取，与对比例3比较，调节不同ph值使用两段超声提取，得出在强酸、强碱的条件下，能将活性较强连翘酯苷a提取更完全；
[0076]
实施例1～3和实施例4、5比较，复合酶的选择和比例对连翘的酶解起到较好的作用，果胶酶、鼠李糖苷酶能削弱连翘内壁与外壁之间的连接，磷脂酶去除连翘中其余油脂成分，科学配比更好的酶解，且易于控制；与实施例6比较，提取溶剂的配比能针对目标产品进行有效提取，调整最佳配比，获得的有效成分含量更高，与实施例7比较，酶解物与提取溶剂之间的比例更为重要，在合适的配比内，控制超声技术，使连翘酯苷a含量更高，连翘酯苷a的提取转移率达到80％以上。
[0077]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。