一种清肺解毒的中药组合物和药物制剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及中药领域，具体涉及一种清肺解毒的中药组合物和药物制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.冠状病毒在系统分类上属冠状病毒科(coronaviridae)冠状病毒属(corona virus)。冠状病毒属的病毒是具外套膜(envelope)的正链单股rna病毒，直径约80
‑
120nm，其遗传物质是所有rna病毒中最大的，对于人、鼠、猪、猫、犬、禽类等脊椎动物具有感染性。冠状病毒的存在为人类和动物的生存与健康带来了严重的威胁，给全球的经济发展带来了严重的影响。
3.2019年底爆发的新型冠状病毒肺炎(简称新冠肺炎)疫情作为国际关注的突发公共卫生事件正在全球范围内流行，作为一种全新的高传染性疾病，对其认识需不断探索和完善，然而目前尚无特效药物。
4.过去几千年中，中医药在治疗疾病方面发挥了重要作用，帮助人类战胜了几次大的流行疾病，因此，充分发挥中医药优势，开发有效的冠状病毒治疗的中药成为当下一个迫在眉睫需要解决的课题。


技术实现要素：

5.因此，本发明的目的在于提供一种清肺解毒的中药组合物和药物制剂及其制备方法和应用，所述中药组合物和/或药物制剂对于冠状病毒所致疾病或者冠状病毒感染具有良好的预防和治疗效果。
6.按照重量份数计，所述中药组合物包括麻黄7
‑
12份、生石膏28
‑
33份、柴胡8
‑
13份、黄芩13
‑
18份、青蒿13
‑
18份、苍术8
‑
13份、马鞭草28
‑
33份、藿香13
‑
18份和甘草8
‑
13份。
7.进一步地，包括如下重量份的原料药：麻黄9份、生石膏30份、柴胡10份、黄芩15份、青蒿15份、苍术10份、马鞭草30份、藿香15份和甘草10份；
8.或者，麻黄7份、生石膏33份、柴胡8份、黄芩13份、青蒿13份、苍术13份、马鞭草33份、藿香13份和甘草8份；
9.或者，麻黄12份、生石膏28份、柴胡13份、黄芩18份、青蒿18份、苍术8份、马鞭草28份、藿香15份和甘草13份。
10.在某些优选的实施方式中，苍术选自炮制苍术，可以但不局限于制苍术、麸炒苍术、焦苍术，更优选麸炒苍术。麻黄可以但不局限于采用生麻黄。本发明中，藿香即为广藿香，广藿香的别称是藿香。甘草可以采用常规的生甘草或者甘草制品，例如炙甘草、甘草饮片等，优选采用生甘草。
11.本发明还提供了一种清肺解毒的中药组合物的制备方法，包括，按照选定的重量份数称取麻黄、生石膏、柴胡、黄芩、青蒿、苍术、马鞭草、藿香和甘草，混合后按常规提取方法提取或者分别按常规提取方法提取后混合，即得。
12.进一步地，所述常规提取方法包括煎煮提取、浸渍提取、渗漉提取、回流提取、超声提取和水蒸气蒸馏提取中的一种或几种。
13.在某些优选的实施方式中，所述提取溶剂选自水或体积百分数为5
‑
98％的醇溶液；醇溶液为含醇的水溶液，醇可以是乙醇或者甲醇等。
14.在某些优选的实施方式中，提取次数至少为1次，优选为1
‑
5次，更优选为1
‑
3次。
15.在某些优选的实施方式中，提取时间至少为10min，优选为20
‑
240min，更优选为30
‑
120min。
16.在某些优选的实施方式中，提取溶剂的体积与原料药重量的比值为≥2l/kg；优选为3
‑
20l/kg，更优选为5
‑
10l/kg。
17.在某些优选的实施方式中，还可以采用常规的精制方法进行精制处理，例如但不局限于柱层析，膜过滤等方法处理。
18.本发明还提供了一种药物制剂，包括本发明任一所述的清肺解毒的中药组合物或者任一所述的制备方法所制得的清肺解毒的中药组合物，以及任选地一种或者多种药学上可接受的载体。
19.所述药物制剂的质量与其采用的中药组合物的质量之比为25
‑
35：126
‑
171，优选为30：144。
20.在某些优选的实施方式中，所述药物制剂选自液体制剂、固体制剂或者半固体制剂中的一种。
21.在具体的实施方式中，所述药物制剂为凝胶剂、乳霜剂、片剂、胶囊剂、散剂、合剂、丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆剂、煎膏剂、栓剂、气雾剂、贴膏剂、软膏剂、注射剂、喷剂、搽剂、酊剂、湿敷剂、糊剂或者洗剂。
22.在具体的实施方式中，所述药学上可接受的载体选自药学上可接受的溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗粘合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂、高分子骨架材料和成膜材料中的至少一种。
23.本发明还提供了上述药物制剂的制备方法，包括如下步骤：
24.水蒸气蒸馏步骤：按照选定的重量份数称取青蒿、苍术和藿香，混合，水蒸气蒸馏提取，分别收集挥发油和水提取液；
25.水煎煮步骤：按照选定的重量份数称取麻黄、生石膏、柴胡、黄芩、马鞭草和甘草，加水煎煮，固液分离，收集液体；
26.颗粒剂的制备步骤：将水蒸气蒸馏步骤制得的水提取液和所述水煎煮步骤制得的液体合并，浓缩，干燥，加入或者不加辅料，制成药物制剂半成品，混入所述挥发油，即得药物制剂。
27.在某些优选的实施方式中，干燥之后还包括粉碎步骤。
28.在某些优选的实施方式中，制成药物制剂半成品之后还包括干燥步骤。
29.在某些优选的实施方式中，水煎煮步骤中，固液分离选自过滤或者离心。
30.在某些优选的实施方式中，所述的药物制剂的制备方法，包括如下步骤：
31.按照选定的重量份数称取青蒿、苍术和藿香，混合，加至少2倍量的水进行水蒸气
蒸馏提取，提取时间为至少10min，分别收集挥发油和水提取液；按照选定的重量份数称取麻黄、生石膏、柴胡、黄芩、马鞭草和甘草，加水煎煮至少1次，每次加水至少2倍量，每次煎煮至少10min，合并水煎液，固液分离，收集液体；将水蒸气蒸馏步骤制得的水提取液和所述水煎煮步骤制得的液体合并，浓缩，干燥，粉碎，加入或者不加辅料，制成药物制剂半成品，喷入所述挥发油，混匀，即得。
32.在更优选的实施方式中，所述的药物制剂的制备方法，包括如下步骤：
33.按照选定的重量份数称取青蒿、苍术和藿香，混合，加5
‑
10倍量水进行水蒸气蒸馏提取0.5
‑
2小时，分别收集挥发油和水提取液；按照选定的重量份数称取麻黄、生石膏、柴胡、黄芩、马鞭草和甘草，加水煎煮1
‑
3次，每次加水5
‑
10倍量，每次煎煮0.5
‑
2小时，合并水煎液，固液分离，收集液体；将水蒸气蒸馏步骤制得的水提取液和所述水煎煮步骤制得的液体合并，浓缩至相对密度为1.20
‑
1.25(50℃)，干燥，粉碎，加入或者不加辅料，制成药物制剂半成品，喷入所述挥发油，混匀，即得。
34.在某些优选的实施方式中，药物制剂半成品可以是颗粒剂、粉剂或者片剂。
35.本发明还提供了一种本发明任一所述的中药组合物，或者本发明的任一所述的制备方法制得的中药组合物；所述药物制剂为本发明任一所述的药物制剂，或者本发明的任一所述的制备方法制得的药物制剂在制备预防和/或治疗冠状病毒所致疾病或者冠状病毒感染的药物中的应用。
36.进一步地，所述冠状病毒选自sars病毒、mers病毒、229e病毒、nl63病毒、oc43病毒、hku1病毒和covid
‑
19病毒中的至少一种。
37.所述病毒所致疾病包括呼吸道炎症和/或急性肺损伤和/或急性呼吸窘迫综合征。
38.所述呼吸道炎症选自鼻炎、咽炎、喉炎、气管炎、支气管炎和/或肺炎。
39.所述中药组合物制备的药物可以抑制炎症因子tnf
‑
α、il
‑
6、il
‑
1β中至少一种的表达，和/或，减少炎性浸润细胞的数量。
40.所述中药组合物和/或药物制用于制备治疗冠状病毒感染导致的凝血功能异常或者障碍的药物。所述中药组合物制备的药物可以抑制d2d表达。
41.所述中药组合物制备的药物可以调节免疫功能。
42.中药组合物和/或药物制剂用于制备调节冠状病毒感染导致的代谢紊乱或者失常的药物。
43.优选的，所述代谢包括蛋白质的生物合成、氨基酸代谢和/或糖代谢；
44.优选的，所述调节冠状病毒感染导致的代谢紊乱或者失常是指上调鞘氨醇水平、下调尿嘧啶水平、下调4
‑
羟基肉桂酸水平中的至少一种。
45.此外，本发明的中药组合物和/或药物制剂制备的药物还可以调节免疫功能。
46.本发明的中药组合物和/或药物制剂制备的药物还可以抑制冠状病毒感染导致的小鼠或者患者肺指数的升高。
47.本发明技术方案，具有如下优点：
48.1.本发明提供的中药组合物，通过临床研究与基础研究反复优化复方中药物组成与含量后获得，方中以麻黄、生石膏和柴胡合为君药；以黄芩、青蒿、苍术共为臣药；马鞭草、藿香共为佐药；甘草为方之使药。上述诸药共奏清热解毒、宣肺平喘之功效，对冠状病毒所致疾病或者冠状病毒感染起到积极治疗作用，尤其是对新型冠状病毒(covid
‑
19)普通型疗
效更加优良。
49.其中，麻黄、生石膏、柴胡合而为君药，麻黄性辛、微苦，温。归肺经、膀胱经。有发汗解表，宣肺平喘，利水消肿之功效。与生石膏配伍，辛凉宣泄，清肺平喘。生石膏性味甘、辛，性大寒。归肺、胃经。有清热泻火，除烦止渴之功效。柴胡性味辛、苦，性微寒。归肝、胆、肺经。有和解表里之功效。
50.黄芩、青蒿、苍术共为臣药。黄芩味苦，性寒。归肺、胆、脾、大肠、小肠经。有清热燥湿，泻火解毒之功效。青蒿味苦、辛，性寒。归肝、胆经。有清虚热之功效。用于温邪伤阴。苍术，味辛、苦，性温。归脾、胃、肝经。有燥湿健脾，祛风散寒之功效。黄芩、苍术清实热，青蒿清虚热，三药共奏全面清热之功效。
51.马鞭草、藿香共为佐药。马鞭草性苦，凉。入肝、脾经。有清热解毒，活血散瘀，利水消肿之功效。藿香味辛，性温。归脾、胃、肺经。有化湿醒脾，辟秽和中，发表之功效。
52.甘草既可清热解毒，辛凉解肌，又可调和药性，护胃安中为方之使药。
53.以上诸药共奏清热解毒、宣肺平喘之功，对冠状病毒感染起到积极治疗作用。
54.2.本发明提供的中药组合物，配方中的九味中药，相辅相成，缺一不可，若采用黄连等其他具有清热燥湿作用的中药替换本发明的黄芩，亦或者采用黄柏或柴胡等其他具有清虚热作用的中药替换本发明的青蒿均会大大影响对冠状病毒感染的治疗作用。
55.3.本发明的中药组合物，不仅能够抑制冠状病毒感染小鼠肺指数升高，改善炎性细胞浸润，还能够抑制炎性因子tnf
‑
α、il
‑
6、il
‑
1β的升高，此外还能够调节冠状病毒感染小鼠的免疫功能和代谢，抑制冠状病毒感染小鼠的d2d表达升高，改善凝血功能异常或者障碍，说明本发明的中药组合物可用于预防和/或治疗冠状病毒感染，以及冠状病毒感染所致的呼吸道炎症，急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征等疾病。
56.4.本发明提供的药物制剂，可以根据实际应用将本发明的中药组合物制备成各种剂型，可以为外用、注射，也可以内服，例如可以但不局限于凝胶剂、乳霜剂、片剂、胶囊剂、散剂、合剂、丸剂、颗粒剂、溶液剂、糖浆剂、煎膏剂、栓剂、气雾剂、贴膏剂、软膏剂、注射剂等各种剂型。其中，颗粒剂更加方便使用，稳定性更高，适合工业化生产，保证了药物的治疗效果和安全性。
57.5.本发明提供的药物制剂的制备方法，优选将青蒿、苍术和藿香三味中药进行水蒸气蒸馏提取，其余原料药进行水煎煮提取，将蒸馏后的水提取液与水煎煮液合并浓缩，干燥，制成药物制剂半成品后再将挥发油混入，即得药物制剂成品，该方法可以充分利用青蒿、苍术和藿香的有效成分，避免其挥发性有效成分在提取液浓缩、干燥过程中丧失，提高有效成分含量，从而进一步提高对冠状病毒所致疾病的治疗效果。
附图说明
58.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
59.图1是本发明实验例1中正常对照组小鼠的he染色图；
60.图2是本发明实验例1中模型对照组小鼠的he染色图；
61.图3是本发明实验例1中磷酸氯喹片组小鼠的he染色图；
62.图4是本发明实验例1中连花清瘟组小鼠的he染色图；
63.图5是本发明实验例1中金花清感组小鼠的he染色图；
64.图6是本发明实验例1中清肺解毒颗粒大剂量组小鼠的he染色图；
65.图7是本发明实验例1中清肺解毒颗粒中剂量组小鼠的he染色图；
66.图8是本发明实验例1中清肺解毒颗粒小剂量组小鼠的he染色图。
具体实施方式
67.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
68.实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
69.所有药材质检合格，符合《中华人民共和国药典》标准。在提取过程中，倍量是指加入每克中药材加入水的毫升数。
70.实施例1
71.本实施例提供了一种中药组合物，包括，生麻黄9g、生石膏30g、柴胡10g、黄芩15g、青蒿15g、麸炒苍术10g、马鞭草30g、广藿香15g和生甘草10g。
72.本实施例还提供了包括上述中药组合物的药物制剂，其制法如下：按中药组合物的处方重量称取青蒿、麸炒苍术和广藿香，加10倍量水，用水蒸气蒸馏法提取挥发油2h，收集挥发油，备用；蒸馏后的水液另器收集，备用；按照处方量取生麻黄、生石膏、柴胡、黄芩、马鞭草和生甘草加水煎煮三次，第一次加10倍量水，煎煮1h，第二、三次各加8倍量水，各煎煮0.5h，合并煎煮液，滤过，滤液与上述蒸馏后的水液合并，减压浓缩至相对密度为1.20
‑
1.25(50℃)的稠膏，干燥，粉粹，加糊精，制成颗粒半成品，干燥，喷入上述蒸馏收集的挥发油，混匀，即得清肺解毒颗粒30g。
73.实施例2
74.本实施例提供了一种中药组合物，包括，生麻黄7g、生石膏33g、柴胡8g、黄芩13g、青蒿13g、苍术13g、马鞭草33g、藿香13g和甘草8g。
75.本实施例还提供了包括上述中药组合物的药物制剂，其制法如下：按中药组合物的处方重量称取青蒿、苍术和藿香，加5倍量水，用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间为1h，收集挥发油，备用；蒸馏后的水液另器收集，备用；按照处方量取生麻黄、生石膏、柴胡、黄芩、马鞭草和甘草加水煎煮三次，第一次加20倍量水，煎煮5h，第二、三次各加3倍量水，各煎煮0.5h，合并煎煮液，滤过，滤液与上述蒸馏后的水液合并，减压浓缩至相对密度为1.20
‑
1.25(50℃)的稠膏，干燥，粉粹，制成颗粒半成品，干燥，喷入上述蒸馏收集的挥发油，混匀，即得清肺解毒颗粒，干法压片，制成片剂。
76.实施例3
77.本实施例提供了一种中药组合物，包括，生麻黄12g、生石膏28g、柴胡13g、黄芩
18g、青蒿18g、苍术8g、马鞭草28g、藿香15g和甘草13g。
78.本实施例还提供了包括上述中药组合物的药物制剂，其制法如下：按中药组合物的处方重量称取青蒿、苍术和藿香，加20倍量水，用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间为3h，收集挥发油，备用；蒸馏后的水液另器收集，备用；按照处方量取生麻黄、生石膏、柴胡、黄芩、马鞭草和甘草加水煎煮二次，第一次加3倍量水，煎煮0.5h，第二次各加15倍量水，煎煮3h，合并煎煮液，滤过，滤液与上述蒸馏后的水液合并，减压浓缩至相对密度为1.20
‑
1.25(50℃)的稠膏，干燥，粉粹，制成颗粒半成品，干燥，喷入上述蒸馏收集的挥发油，混匀，即得清肺解毒颗粒，装入胶囊中，制成胶囊剂。
79.实验例1清肺解毒颗粒对冠状病毒感染小鼠的保护作用
80.1、实验材料
81.连花清瘟颗粒：北京以岭药业有限公司。国药准字z20100040。规格：每袋装6g。生产批号：2001053。
82.金花清感颗粒：聚协昌(北京)药业有限公司。国药准字z20160001。规格：每袋装5g(相当于饮片17.3g)，生产批号：20200101。
83.磷酸氯喹片：上海信宜天平药业有限公司。国药准字：h31020869。规格：0.25g/片
×
100片。生产批号：12200201。
84.清肺解毒颗粒：按照本发明实施例1的方法制备。
85.2、实验方法
86.(1)动物分组与给药
87.balb/c小鼠80只，按性别及体重随机分为正常对照组、模型对照组、磷酸氯喹片组、连花清瘟颗粒组、金花清感颗粒组、清肺解毒颗粒大剂量组、中剂量组、小剂量组，每组10只。
88.分组结束后，各组小鼠用乙醚轻度麻醉，以100个tcid50hcov
‑
229e病毒液滴鼻感染1次，45μl/只/次。取磷酸氯喹片、连花清瘟颗粒、金花清感颗粒分别研磨后溶于蒸馏水中，制得质量浓度分别为9.0mg/ml、165mg/ml、137.5mg/ml的受试药物溶液，取清肺解毒颗粒研磨后溶于蒸馏水中，制得质量浓度分别为550mg/ml、275mg/ml、137.5mg/ml的受试药物溶液。感染后，磷酸氯喹片组、连花清瘟颗粒组、金花清感颗粒组、清肺解毒颗粒(简称qfjd)大剂量组、清肺解毒颗粒中剂量组、清肺解毒颗粒小剂量组分别以0.18、3.3、2.75、11、5.5、2.75g
·
kg
‑1·
d
‑1的剂量依次灌胃给予上述对应的受试药物溶液，按照0.2ml/10g体重/次，每天灌胃一次，连续4天。
89.(2)称重并计算肺指数和肺指数抑制率
90.第5天称重后，小鼠眼眶静脉丛采血(3滴血收集于10ml 1
×
pbs中，其余血液收集血清后
‑
80℃保存)。解剖小鼠收集肺脏，称重后，左侧肺叶固定于4％的多聚甲醛溶液中，其余肺脏
‑
80℃保存。实验终点之前死亡小鼠不计入统计结果中。按照如下公式计算肺指数和肺指数抑制率。实验数据采用graphpad prism5.0软件进行统计学分析，组间差异采用t检验，p<0.05为差异具有统计学意义。
91.肺指数＝肺湿重(g)/体质量(g)
×
100％；
92.肺指数抑制率＝(模型对照组肺指数
‑
给药组肺指数)/(模型对照组肺指数
‑
正常对照组肺指数)
×
100％。
93.(3)he染色法检测小鼠肺组织病理变化
94.固定好的小鼠肺脏采用体积百分数为75％乙醇水溶液脱水，再用二甲苯透明，然后用石蜡包埋；包埋好的蜡块用切片机切成4
‑
6μm的薄片，热水中展平后贴于载玻片，然后置于45℃恒温箱中烘干；切片采用苏木精
‑
伊红(he)染色；将he染色后的切片置于光学显微镜下，观察肺脏组织的病理学改变，并拍照。
95.3、实验结果
96.(1)肺指数和肺指数抑制率
97.表1清肺解毒颗粒对冠状病毒感染小鼠肺指数的影响
[0098][0099]
注：与模型组比较
**
p<0.01，
***
p<0.001。
[0100]
试验结果显示，采用hcov
‑
229e病毒株感染小鼠，小鼠肺指数升高，与正常对照组比较有显著性差异(p<0.001)。各给药组小鼠分别给予相应药物后，小鼠肺指数值呈现不同的变化趋势。清肺解毒颗粒3个剂量组肺指数均有降低的趋势，与模型对照组比较均具有显著性差异(p<0.05)。磷酸氯喹片组肺指数降低趋势最大，与正常对照组比较有显著性差异(p<0.01)。连花清瘟颗粒组和金花清感颗粒组肺指数与模型对照组比较均无显著性差异(p>0.05)。
[0101]
清肺解毒颗粒3个剂量组肺指数抑制率与剂量大、小呈正相关，均高于连花清瘟颗粒组和金花清感颗粒组，大剂量组肺指数抑制率与磷酸氯喹片组相当。
[0102]
(2)he染色结果
[0103]
见图1
‑
8所示，模型对照组小鼠中，肺部表现为中度间质性肺炎，肺泡隔增宽伴炎细胞浸润。与模型对照组小鼠的肺部相比，经清肺解毒颗粒治疗的小鼠肺组织病变有一定的减轻，主要表现为肺泡隔增宽伴炎细胞浸润。大剂量组改善程度与磷酸氯喹片相当。连花清瘟颗粒组、金花清感颗粒组肺组织病理改善不明显。说明本发明的清肺解毒颗粒用于治疗冠状病毒感染引起的肺炎病变。
[0104]
实验例2清肺解毒颗粒对冠状病毒感染小鼠炎症反应的影响
[0105]
1、实验方法
[0106]
elisa法检测小鼠血清中炎性因子表达水平，待测样本来自于实验例1各组动物经
实验方法步骤(2)眼眶静脉丛采血。分别采用mouse tnf
‑
αelisa kit、mouse il
‑
1βelisa kit、mouse il
‑
6elisa kit、mouse il
‑
4elisa kit试剂盒(由上海酶联免疫技术有限公司提供)，检测过程严格按照试剂盒操作说明进行。取试剂盒在室温下平衡60分钟。酶标包被板上设置标准品孔、样本孔和空白孔。标准品孔各加不同浓度的标准品50μl。样本孔中先加样本稀释液40μl，然后再分别加入待测样本10μl(样本最终稀释度为5倍)。空白对照孔不加样本及酶标试剂，其余各步操作相同。加样将样本加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。用封板膜封板后置37℃温育1h；洗板，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，重复5次，拍干；每孔先加入显色剂a 50μl，再加入显色剂b 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。每孔加入终止液50μl，终止反应(蓝色立即转黄色)。酶标仪检测各孔在450nm的吸光度(od值)，计算表达量。
[0107]
2、实验结果
[0108]
表2清肺解毒颗粒对冠状病毒肺炎小鼠血清中细胞因子表达的影响
[0109][0110]
注：与模型组比较
*
p<0.05,
**
p<0.01,
***
p<0.001。
[0111]
采用hcov
‑
229e病毒株感染小鼠，试验结果显示：
[0112]
(1)模型对照组小鼠血清中tnf
‑
α表达量明显升高，与正常对照组比较有显著性差异(p<0.001)。各给药组小鼠分别给予相应药物后，tnf
‑
α表达量呈现不同的变化趋势。清肺解毒颗粒3个剂量组tnf
‑
α表达量均有降低的趋势，与模型对照组比较均具有显著性差异(p<0.001，p<0.01，p<0.05)。金花清感颗粒组tnf
‑
α表达量降低，与模型对照组比较有显著性差异(p<0.05)。磷酸氯喹片组、连花清瘟颗粒组tnf
‑
α表达量与模型对照组比较无显著性差异(p>0.05)。
[0113]
(2)模型对照组小鼠血清中il
‑
1β表达量明显升高，与正常对照组比较有显著性差异(p<0.001)。各给药组小鼠分别给予相应药物后，il
‑
1β表达量呈现不同的变化趋势。清肺解毒颗粒3个剂量组il
‑
1β表达量均有降低的趋势，与模型对照组比较均具有显著性差异(p<0.001，p<0.01)。金花清感颗粒组、磷酸氯喹片组il
‑
1β表达量降低，与模型对照组比较有显著性差异(p<0.001)。连花清瘟颗粒组il
‑
1β表达量与模型对照组比较无显著性差异(p>0.05)。
[0114]
(3)模型对照组小鼠血清中il
‑
6表达量明显升高，与正常对照组比较有显著性差异(p<0.001)。各给药组小鼠分别给予相应药物后，il
‑
6表达量呈现不同的变化趋势。清肺解毒颗粒3个剂量组il
‑
6表达量均有降低的趋势，与模型对照组比较均具有显著性差异(p<
0.001)。磷酸氯喹片组、连花清瘟颗粒组、金花清感颗粒组il
‑
6表达量均降低，与模型对照组比较均有显著性差异(p<0.001)。
[0115]
(4)模型对照组小鼠血清中il
‑
4表达量明显降低，与正常对照组比较有显著性差异(p<0.001)。各给药组小鼠分别给予相应药物后，il
‑
4表达量与模型对照组比较均具无显著性差异(p>0.05)。
[0116]
综上所述，清肺解毒颗粒能够抑制炎性细胞因子表达，在所测试的指标中，其抑制作用优于对照药物。
[0117]
实验例3清肺解毒颗粒对冠状病毒感染小鼠凝血功能的影响
[0118]
1、实验方法
[0119]
实验例1各组动物经实验方法步骤(2)眼眶静脉丛采血后，室温静置2h，于4℃3000r
·
min
‑1离心15min；收集上清液，
‑
80℃保存，待测。elisa法采用mouse d
‑
dimer(d2d)elisa kit试剂盒(购自武汉华美生物工程有限公司)，严格按照试剂盒说明书的方法检测小鼠血清中d二聚体(d2d)表达水平。
[0120]
2、实验结果
[0121]
表3清肺解毒颗粒对冠状病毒肺炎小鼠血清中d2d表达的影响
[0122][0123]
注：与模型组比较
*
p<0.05,
**
p<0.01,
***
p<0.001。
[0124]
采用hcov
‑
229e病毒株感染小鼠，试验结果显示：
[0125]
模型对照组小鼠血清中d2d表达量明显升高，与正常对照组比较有显著性差异(p<0.001)。各给药组小鼠分别给予相应药物后，d2d表达量呈现不同的变化趋势。清肺解毒颗粒3个剂量组d2d表达量均有降低的趋势，与模型对照组比较均具有显著性差异(p<0.001)。磷酸氯喹片组、连花清瘟颗粒组、金花清感颗粒d2d表达量降低，与模型对照组比较无显著性差异(p>0.05)。
[0126]
清肺解毒颗粒能够抑制d2d的表达。磷酸氯喹片、连花清瘟颗粒、金花清感颗粒未显示出抑制作用。
[0127]
实验例4清肺解毒颗粒对冠状病毒感染小鼠免疫功能的影响
[0128]
1、实验方法
[0129]
流式细胞术检测小鼠外周血淋巴细胞。向10mlpbs中滴入3滴血(来自上述实验例1各组动物经实验方法步骤(2)眼眶静脉丛采血)，混匀；4℃，2000r/min离心15min；用移液管吸出上清液，红色沉淀中加入1ml红细胞裂解液，吹打混匀，待液体呈红色透明澄清后，加入10mlpbs终止裂解；4℃，2000r/min离心5min；弃上清，吸净红色悬着液，沉淀用5mlpbs重悬；4℃，2000r/min离心5min；弃上清，加入500l封闭液(含5％fbs的pbs)，重悬，移入1.5mlep管中；4℃，2000r/min离心5min；甩净上清，加入50μl抗体(pe标记抗小鼠cd45r抗体，percpcy5.5标记抗小鼠cd4抗体，apc标记抗小鼠cd8a抗体各0.3μl)，4℃避光孵育30min；加入1mlpbs重悬，4℃，2000r/min离心5min；甩净上清，加入2％多聚甲醛固定液，重悬细胞，放入4℃避光保存。样本收集后，第2天上机检测。
[0130]
2、实验结果
[0131]
表4清肺解毒颗粒对冠状病毒肺炎小鼠外周血淋巴细胞百分比的影响
[0132][0133]
注：与模型组比较*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
[0134]
采用hcov
‑
229e病毒株感染小鼠，试验结果显示：
[0135]
(1)模型对照组小鼠外周血cd4 t细胞百分比降低，与正常对照组比较有显著性差异(p<0.01)。各给药组分别给予相应药物后，小鼠cd4 t细胞百分比呈现不同的变化趋势。清肺解毒颗粒3个剂量组cd4 t细胞百分比均有升高的趋势，与模型对照组比较均具有显著性差异(p<0.01，p<0.001)。磷酸氯喹片组、连花清瘟颗粒组、金花清感颗粒组cd4

t细胞百分比升高，与模型对照组比较均有显著性差异(p<0.05，p<0.01)。
[0136]
(2)模型对照组小鼠外周血cd8

t细胞百分比降低，与正常对照组比较有显著性差异(p<0.05)。各给药组分别给予相应药物后，小鼠cd8

t细胞百分比呈现不同的变化趋势。清肺解毒颗粒3个剂量组cd8

t细胞百分比均有升高的趋势，与模型对照组比较均具有显著性差异(p<0.01，p<0.05)。磷酸氯喹片组、连花清瘟颗粒组、金花清感颗粒组cd8

t细胞百分比升高，与模型对照组比较有显著性差异(p<0.01)。连花清瘟颗粒组、金花清感颗粒组cd8

t细胞百分比有升高的趋势，与模型对照组比较均无显著性差异。
[0137]
清肺解毒颗粒具有免疫调节作用，作用程度优于连花清瘟颗粒和金花清感颗粒。清肺解毒颗粒的药效水平，均与剂量成正相关。
[0138]
实验例4清肺解毒颗粒对冠状病毒感染小鼠总体代谢的调节作用
[0139]
1、待测样品的处理与检测
[0140]
(1)本部分实验采用lc
‑
ms技术检测小鼠血清中代谢物质的变化。样本来源于实验例1各组动物经实验方法步骤(2)眼眶静脉丛采血。将所有样本在4℃下融化；自每个样本中取100μl于2ml离心管中；每个离心管加入400μl甲醇，振荡60s，充分混匀；在12000rpm4℃离心10min，取全部上清液，转移至新的2ml离心管中，真空浓缩干燥；150μl2
‑
氯苯丙氨酸(4ppm)80％甲醇溶液复溶，上清液使用0.22μm膜过滤，得到待测样本；自每个待测样本各取20μl混合成qc样本，(qc：qualitycontrol，用来校正混合样品分析结果的偏差以及由于分析仪器自身原因所造成的失误)；用剩余待测样本进行lc
‑
ms检测。
[0141]
色谱条件：仪器采用thermovanquish，使用acquityuplchsst31.8μm(2.1
×
150mm)色谱柱，自动进样器温度设为8℃，以0.25ml/min的流速，40℃的柱温，进样2μl进行梯度洗脱，流动相为正离子0.1％甲酸水(b2)
‑
0.1％甲酸乙腈(a2)；负离子5mm甲酸铵水(b1)
‑
乙腈(a1)。梯度洗脱程序为0～1min，2％a2/a1；1～9min，2％～50％a2/a1；9～12min，50％～98％a2/a1；12～13.5min，98％a2/a1；13.5～14min，98％～2％a2/a1；14～20min，2％a2
‑
正模式(14～17min，2％a1
‑
负模式)
[0142]
质谱条件：仪器使用thermoqexactivefocus，电喷雾离子源(esi)，正负离子电离模式，正离子喷雾电压为3.50kv，负离子喷雾电压为2.50kv，鞘气30arb，辅助气10arb。毛细管温度325℃，以分辨率70000进行全扫描，扫描范围81～1000，并采用hcd进行二级裂解，碰撞电压为30ev，同时采用动态排除去除无必要的ms/ms信息。
[0143]
2、数据的统计处理
[0144]
(1)原始数据处理
[0145]
a)通过proteowizard软件(v3.0.8789)将获得的原始数据转换成mzxml格式(xcms输入文件格式)。
[0146]
b)利用r(v3.3.2)的xcms程序包进行峰识别(peaksidentification)、峰过滤(peaksfiltration)、峰对齐(peaksalignment)，主要参数有bw＝2,ppm＝15,peakwidth＝c(5,30),mzwid＝0.015,mzdiff＝0.01,method＝centwave。
[0147]
c)得到包括质核比(masstochargeratio,m/z)和保留时间(retentiontime,rt)及峰面积(intensity)等信息的数据矩阵；正离子模式获得13516个前体分子(precursormolecule)，负离子模式获得10922个前体分子，导出数据至excel进行后续分析。
[0148]
d)为使不同量级的数据能够进行比较，对数据进行峰面积的批次归一化(batchnormalization)。
[0149]
由于代谢组数据具有多维且某些变量间高度相关的特点，运用传统的单变量分析无法快速、充分、准确地挖掘数据内潜在的信息。因此在分析代谢组数据需要运用化学计量学原理和多元统计的方法，对采集的多维数据进行降维和归类分析，从而挖掘提炼出最有用的信息。通常，在对代谢组学数据进行多元统计分析之前,需要将数据进行适当权重转换，即标准化(scaling)处理。本实验在多元统计分析前对数据进行自适(uv)换算处理，以获得更加可靠且直观的结果。本分析中使用的多元统计分析(r语言ropls包)方法有：主成分分析(principalcomponentanalysis,pca)、偏最小二乘判别分析
(partialleastsquares
‑
discriminantanalysis,pls
‑
da)、正交
‑
偏最小二乘判别分析(orthogonalpartialleastsquaresdiscriminantanalysis,opls
‑
da)。
[0150]
(2)差异表达代谢物的方差分析
[0151]
代谢物是动物或植物中新陈代谢的产物。实验组和对照组之间的上调或下调代谢物称为差异表达代谢物，它可以识别异常的代谢变化，也可以与差异表达代谢物相关的途径结合讨论。在这项研究中，筛选了代谢物的差异表达，相关条件如下：p
‑
value≤0.05且vip≥1。
[0152]
在本项研究中，筛选出代谢物，两组之间使用studentt检验，多组之间使用单因素方差分析。p值：student'st检验，p值≤0.05表示差异具有统计学意义。vip：投影中的重要性；指示变量对模型的重要性。单向方差分析p值：单因素和多个独立样本的平均值比较。两组之间采用学生t检验，多组之间采用单因素方差分析。
[0153]
正离子模式下，模型对照组和正常对照组共获得2402个差异表达的代谢产物，清肺解毒颗粒组和模型对照组共获得3222个差异表达的代谢产物。负离子模式下，模型对照组和正常对照组共获得2311个差异表达的代谢产物，清肺解毒颗粒组和模型对照组共获得2564个差异表达的代谢产物。然后，对每组差异表达的代谢物进行了层次聚类分析。结果发现，正常对照组和模型对照组，清肺解毒颗粒组和模型对照组间样品的代谢组学差异最显著。
[0154]
(3)代谢物的鉴定
[0155]
首先确认代谢物精确分子量(分子量误差<30ppm)，后根据ms/ms模式所得碎片信息在humanmetabolome database(hmdb)(http://www.hmdb.ca)，metlin(http://metlin.scripps.edu)，massbank(http://www.massbank.jp/)，lipidmaps(http://www.lipidmaps.org)，mzclound(https://www.mzcloud.org)，以及帕诺米克自建标准品数据库中进一步匹配注释获得代谢物准确信息。模型对照组和正常对照组总共匹配了99种差异表达的代谢产物，清肺解毒颗粒组和模型对照组总共匹配了131种差异表达的代谢产物。
[0156]
(4)z
‑
score(标准分数)的计算
[0157]
z
‑
score是基于代谢物的相对含量转换而来的，用于衡量同一水平上代谢物的相对含量的高低。z
‑
score的计算是基于参考数据集(对照组)的平均值和标准差进行的，计算公式为：z＝(x
‑
μ)/σ。其中x为某一具体分数，μ为平均数，σ为标准差。计算b组的z得分，同时以a组为对照组。计算c组的z得分，同时以b组为对照组。当z分数为负值时，代谢物被下调；当z分数为正值时，代谢物被上调。结果显示，正常对照组和模型对照组中有55个上调的差异表达代谢物和40个下调的差异表达代谢物。清肺解毒颗粒组和模型对照组中有32个上调的差异表达代谢物和99个下调的差异表达代谢物。其中，模型对照组与正常对照组相比，鞘氨醇(sphingosine)显著下调，尿嘧啶(uracil)、4
‑
羟基肉桂酸(4
‑
hydroxycinnamic acid)显著上调；清肺解毒颗粒组与模型对照组比较，鞘氨醇显著上调，尿嘧啶、4
‑
羟基肉桂酸显著下调。
[0158]
(5)metpa数据库对代谢通路进行分析
[0159]
metpa是metaboanalyst(www.metaboanalyst.ca)的一部分，主要基于kegg代谢通路。metpa数据库通过代谢通路浓缩和拓扑分析，识别出可能的受生物扰动的代谢通路，进而对代谢物的代谢通路进行分析。采用metpa数据库可以分析两组差异代谢物的相关代谢
通路，采用的数据分析算法是超几何检验，pathway拓扑结构采用的是relative
‑
betweeness centrality。基于使用kegg途径和metpa数据库进行的代谢途径分析。本研究分析出模型对照组和正常对照组间差异表达代谢产物的代谢途径有40种，清肺解毒颗粒组和模型对照组差异表达代谢产物的代谢途径有45种。
[0160]
对比模型对照组和正常对照组，清肺解毒颗粒组和模型对照组间impact大于0.1的差异代谢物途径，从中筛选出共同的差异代谢物途径包括：
[0161]
1)丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢途径(alanine,aspartate and glutamate metabolism)；2)精氨酸和脯氨酸代谢途径(arginine and proline metabolism)；3)d
‑
谷氨酰胺和d
‑
谷氨酸代谢途径(d
‑
glutamine and d
‑
glutamate metabolism)；4)视黄醇代谢；5)酪氨酸代谢(tyrosine metabolism)；6)柠檬酸盐循环(tca循环citrate cycle tca cycle)；7)组氨酸代谢(histidine metabolism)；8)半胱氨酸和蛋氨酸(cysteine and methionine metabolism)；9)乙醛酸和二羧酸的代谢的代谢(glyoxylate and dicarboxylate metabolism)。这些代谢通路主要涉及蛋白质的生物合成、氨基酸代谢和糖代谢。在血清中，清肺解毒颗粒可直接参与调控以上与hcov
‑
229e肺炎密切相关的代谢通路，从而发挥其治疗冠状病毒肺炎的作用。
[0162]
综上所述，本发明的中药组合物或者清肺解毒颗粒对冠状病毒肺炎模型小鼠具有明显的治疗作用，治疗效果基本具有量效关系。清肺解毒颗粒大剂量组治疗冠状病毒肺炎的作用接近磷酸氯喹片；连花清瘟颗粒和金花清感颗粒未显示明显的治疗作用。清肺解毒颗粒能够改善感染小鼠肺部病理状态，抑制冠状病毒肺炎小鼠肺部炎性细胞因子表达水平，改善冠状病毒肺炎小鼠的免疫状态，改善凝血功能，对冠状病毒肺炎小鼠代谢具有调节作用。
[0163]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。