一种中药组合物在制备防治骨质疏松症药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及医药技术领域，更具体地，涉及一种中药组合物在制备防治骨质疏松症药物中的应用。


背景技术：

2.骨质疏松是中老年人，尤其是绝经后妇女的一种常见病、多发病，是以骨量减少、骨微观结构退化为特征所致骨脆性增加、易于发生骨折的一种全身代谢性骨骼疾病。破骨细胞是一种在人体内行使骨吸收功能的终末分化细胞，也是临床一线抗骨质疏松药物的关键靶标。破骨细胞的过度激活引起骨吸收和骨形成间骨重建平衡失调，导致骨量下降、皮质骨变薄、松质骨骨小梁数量变少等退行性改变。
3.骨重建是维持机体内正常骨代谢的主要过程，而破骨细胞的过度分化是引起骨重建失衡的关键因素，目前临床上针对骨吸收的化学和生物药主要包括双膦酸盐类和核因子κb受体活化因子配体抑制剂等，而此类化学合成药物在长期服用过程中会引起不同程度的下颌骨坏死、骨关节和肌肉疼痛、蜂窝织炎等不良反应(余伯龙,李义凯.使用双膦酸盐类药物的不良反应[.中国骨质疏松杂志,2011,17(01):80
‑
85)。开发安全有效的抗骨吸收防治骨质疏松药物具有重要的应用价值。


技术实现要素：

[0004]
本发明针对现有技术的不足，旨在提供一种安全、有效的抗骨吸收以防治骨质疏松症的药物，本发明提供的中药组方为老药新用，能够通过抑制破骨细胞分化防治骨质疏松症，尤其是女性绝经后骨质疏松症。
[0005]
本发明的目的是提供一种中药组合物在制备防治骨质疏松症药物中的应用。为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
[0006]
本发明首先提供了一种中药组合物在制备防治骨质疏松症药物中的应用，所述中药组合物由以下重量份的各组分组成：
[0007]
制附子20～30份、淫羊藿10～15份、干姜10～15份、甘草10～15份、人参6～12份、丹参6～12份、虎杖6～12份、茯苓6～12份、黄柏3～5份、黄芩2～4。
[0008]
上述中药组合物为本发明发明人前期研制的一种用于治疗艾滋病的药物组合物(中国专利cn102641489b)，发明人在药理学实验中，意外地发现该组合物还可有效抑制破骨细胞分化，改善因雌激素缺乏导致的骨丢失，可用于防治骨质疏松症尤其是雌激素缺乏导致的骨质疏松，开发了老药方的新用途，也为骨质疏松症的治疗提供了一种新的药物选择。
[0009]
此外，发明人研究表明，去掉任何一种组分或者改变其用量配比，其在抑制破骨细胞分化以及改善骨丢失方面效果都有所降低，表明本发明的上述组合物配伍得当，可协同发挥最佳的防治骨质疏松的功效。
[0010]
本发明通过micro
‑
ct扫描观察到卵巢摘除大鼠的骨组织中骨密度、骨体积分数、
骨小梁数量明显降低，松质骨内的骨微结构发生退行性改变。给药本发明中药组合物后，骨密度、骨体积分数和骨小梁数量明显增加。通过h&e染色组织病理学分析结果表明，去卵巢大鼠股骨下端松质骨区域内骨小梁数量明显减少，相对骨体积分数明显降低，而中药组合物给药组大鼠的相对骨体积分数明显升高，说明中药组合物对雌激素缺乏导致的骨量丢失具有保护作用。
[0011]
本发明研究发现，卵巢摘除的雌性大鼠的骨组织内破骨细胞形成明显增多，骨表面破骨细胞数和破骨细胞周长百分比均明显增加。而给药本发明中药组合物的大鼠骨组织内骨表面破骨细胞数和破骨细胞周长百分比明显降低；同时，卵巢摘除大鼠骨组织中骨吸收功能相关基因碳酸酐酶2、基质金属蛋白酶9、组织蛋白酶k和空泡型h atp酶mrna表达明显升高，骨吸收功能相关蛋白抗酒石酸酸性磷酸酶、基质金属蛋白酶9和c
‑
fos表达水平明显升高。而给药本发明中药组合物可显著降低碳酸酐酶2、基质金属蛋白酶9和组织蛋白酶k的mrna表达以及抗酒石酸酸性磷酸酶、基质金属蛋白酶9和c
‑
fos蛋白表达水平，表明该中药组合物具有明确的抗骨吸收功能的作用。本发明进一步研究发现经rankl诱导的bmms细胞可分化为多核破骨细胞，破骨细胞内tracp、ctsk、mmp9、car2和atp6v0d2等骨吸收功能相关蛋白和基因mrna水平明显升高。细胞中加入中药组合物干预之后，可显著抑制rankl诱导的破骨细胞分化，并且呈剂量依赖性和时间依赖性地抑制tracp、ctsk、mmp9、car2和atp6v0d2等骨吸收功能相关蛋白和基因mrna表达水平，表明给药本发明中药组合物，对破骨细胞的形成和分化具有明显的抑制作用，可显著抑制破骨细胞特异性蛋白和基因表达，抑制骨吸收。
[0012]
本发明所述中药组合物的质量控制方法包括如下步骤：
[0013]
(1)按照中国药典薄层色谱法项下规定的方法，组合物中乌头碱限量，不得多于规定限度；组合物中应检出淫羊藿、甘草、虎杖、干姜、人参和黄芩；
[0014]
(2)按照中国药典高效液相色谱法项下规定的方法，组合物中双酯型生物碱乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的总量不得超过规定限度；组合物中淫羊藿苷、甘草酸、虎杖苷和黄芩苷的含量不得低于规定限度。
[0015]
且专利cn102641489b中的数据已充分显示了该中药组合物具有的安全性，因此，本发明为防治骨质疏松症，尤其是女性绝经后骨质疏松症提供了一种安全、有效的方式。
[0016]
优选地，所述中药组合物由以下重量份的各组分组成：
[0017]
制附子20份、淫羊藿10份、干姜10份、甘草10份、人参6份、丹参6份、虎杖6份、茯苓6份、黄柏3份、黄芩3份。
[0018]
作为一种优选地可实施方式，所述中药组合物是将原料药先经水提，后经醇提得到。
[0019]
优选地，所述中药组合物的制备方法包括如下步骤：
[0020]
s1.取原料药，加水煎煮3～4次，每次加入15～25倍量的水，煎煮2～3h，放冷，滤过，合并滤液；
[0021]
s2.将滤液离心，取上清液并浓缩至原料药重，得水提浓液；
[0022]
s3.在水提浓液加入两倍体积浓度为85～95％(v/v)的乙醇，搅拌均匀，静置6～10小时，离心，取上清液，去除乙醇，浓缩干燥，即得到所述中药组合物。
[0023]
此外，本发明上述组合物提取物可制备成药学上可接受的不同剂型，包括片剂、溶
液剂、混悬剂、乳剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、微囊、微球、注射液、脂质体或气雾剂等，用于骨质疏松症的治疗，也可以给予骨质疏松症潜在患者服用用以预防骨质疏松症。
[0024]
进一步地，所述骨质疏松症为雌激素缺乏导致的骨质疏松症。
[0025]
进一步地，所述雌激素缺乏导致的骨质疏松症为绝经后骨质疏松症。
[0026]
进一步地，所述防治骨质疏松症为抑制骨组织内破骨细胞的分化、抑制破骨细胞形成。
[0027]
进一步地，所述防治骨质疏松症为增加骨密度、骨体积分数和骨小梁数量。
[0028]
优选地，当应用对象为动物(例如大鼠)时，所述中药组合物的有效剂量为1～4g/kg/d。当应用对象为人时，可按照药学领域的相关给药标准，相应折算成人体的给药量。
[0029]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0030]
本发明提供了前期研发的一种中药组合物的新应用，本发明首次研究表明该组合物可提高雌激素缺乏所致骨质疏松动物的骨组织骨密度、骨体积分数和骨小梁数量，抑制骨组织内破骨细胞形成，能够通过抑制破骨细胞分化防治骨质疏松症，特别是女性绝经后骨质疏松症。为骨质疏松尤其是雌激素缺乏导致的骨质疏松的防治提供了一种新型、安全、高效的药物来源。
附图说明
[0031]
图1中药组合物1对去卵巢大鼠骨组织形态计量学参数的影响(与sham组相比，
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，p<0.05；
##
，p<0.01；与ovx组相比，
**
，p<0.01；
***
，p<0.001)。
[0032]
图2中药组合物1对去卵巢大鼠的骨微结构的影响。
[0033]
图3中药组合物1对去卵巢大鼠骨组织形态学的影响(he，
×
200；与sham组相比，
###
，p<0.01；与ovx组相比，
*
，p<0.05；
***
，p<0.001)。
[0034]
图4中药组合物1对去卵巢大鼠骨组织中破骨细胞形成的影响(he，
×
200；与sham组相比，
#
，p<0.05；
##
，p<0.01；与ovx组相比，
*
，p<0.05；
**
，p<0.01)。
[0035]
图5中药组合物1对去卵巢大鼠骨吸收相关基因mrna表达的影响(与sham组相比，
#
，p<0.05；
##
，p<0.01；与ovx组相比，
*
，p<0.05；
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，p<0.01；
***
，p<0.001)。
[0036]
图6中药组合物1对去卵巢大鼠骨吸收相关蛋白表达的影响(与sham组相比，
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，p<0.05；
##
，p<0.01；与ovx组相比，
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，p<0.05；
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，p<0.01；
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，p<0.001)。
[0037]
图7中药组合物1对骨髓来源巨噬细胞(bmms)活力的影响(与对照组相比，
*
，p<0.05；
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，p<0.01；
***
，p<0.001)。
[0038]
图8中药组合物1抑制破骨细胞分化(与对照组相比，
**
，p<0.01；
***
，p<0.001)。
[0039]
图9中药组合物1抑制rankl诱导的破骨分化关键蛋白表达(与对照组相比，
*
，p<0.05；
**
，p<0.01；
***
，p<0.001)。
[0040]
其中，图中的各个缩写代号含义：sham：假手术组；ovx：卵巢摘除模型组；ev：戊酸雌二醇组；cmc：中药组合物；ld：中药组合物低剂量组；md：中药组合物中剂量组；hd：中药组合物高剂量组。
具体实施方式
[0041]
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例
只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0042]
药理实验在广州中医药大学实验动物中心进行，实验动物使用许可证号：syxk(粤)2018
‑
0001，广州中医药大学实验动物伦理委员会审核并通过动物实验伦理。
[0043]
实施例1中药组合物及其制备
[0044]
本实施例提供了七种组合物：
[0045]
1、原料药组成
[0046]
中药组合物1：
[0047]
制附子20份、淫羊藿10份、干姜10份、甘草10份、人参6份、丹参6份、虎杖6份、茯苓6份、黄柏3份、黄芩3份。
[0048]
中药组合物2：
[0049]
制附子20份、淫羊藿14份、干姜15份、甘草10份、人参10份、茯苓12份、虎杖6份、丹参10份、黄柏5份、黄芩3份。
[0050]
中药组合物3：
[0051]
制附子30份、淫羊藿15份、干姜10份、甘草15份、人参6份、茯苓6份、虎杖10份、丹参12份、黄柏3份、黄芩4份。
[0052]
中药组合物4：
[0053]
制附子27份、淫羊藿10份、干姜12份、甘草13份、人参12份、茯苓9份、虎杖12份、丹参6份、黄柏4份、黄芩2份。
[0054]
中药组合物5：
[0055]
淫羊藿10份、甘草10份、人参6份、丹参6份、虎杖6份、茯苓6份、黄柏3份、黄芩3份。
[0056]
中药组合物6：
[0057]
制附子20份、干姜10份、甘草10份、丹参6份、虎杖6份、茯苓6份、黄柏3份、黄芩3份。
[0058]
中药组合物7：
[0059]
制附子10份、淫羊藿20份、干姜12.5份、甘草20份、人参7.82份、茯苓7.81份、虎杖7.81份、丹参7.81份、黄柏3.75份、黄芩2.5份。
[0060]
2、药物制备
[0061]
s1.照处方比例称取原料药，加纯水煎煮3次，每次加入20倍量的纯水，煎煮2h，放冷，滤过，合并滤液；
[0062]
s2.将滤液以15000rpm的转速离心10分钟，取上清液，将上清液浓缩至药液体积以升计等于药材总质量以千克计(即与原料药等重)，得水提浓液；
[0063]
s3.在水提浓液中加入两倍药液体积的含体积分数为95％的药用乙醇，搅拌均匀，静置6至10小时，以15000rpm的转速离心，取上清液，减压下回收乙醇并减压下浓缩成稠膏，喷雾干燥，或在80℃以下真空干燥、粉碎，即得。
[0064]
3、按照专利cn102641489b的方法对得到的组合物进行质量控制
[0065]
(1)按照中国药典薄层色谱法项下规定的方法，组合物中乌头碱限量，不得多于规定限度；组合物中应检出淫羊藿、甘草、虎杖、干姜、人参和黄芩；
[0066]
(2)按照中国药典高效液相色谱法项下规定的方法，组合物中双酯型生物碱乌头
碱、新乌头碱和次乌头碱的总量不得超过规定限度；组合物中淫羊藿苷、甘草酸、虎杖苷和黄芩苷的含量不得低于规定限度。
[0067]
实施例2中药组合物改善去卵巢大鼠骨丢失的作用
[0068]
1.实验方法
[0069]
1.1 动物分组及处理
[0070]
spf级雌性sprague
‑
dawley(sd)大鼠，6
‑
8月龄，体重350
±
20g。购于湖南斯莱克实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：scxk(湘)2016
‑
0002，动物合格证号：43004700063473。
[0071]
在spf级动物房适应性饲养一周，对大鼠进行卵巢摘除手术：腹腔注射3％戊巴比妥钠(40mg/kg)进行麻醉。俯卧位固定后，经腹背部肋缘下1cm脊柱两侧各1.5cm处，分别切两个1cm左右切口，拨开脂肪，将卵巢连同小部分脂肪一起结扎，切除卵巢，逐层缝合，用碘伏对伤口进行处理。
[0072]
假手术组(sham)大鼠作为正常对照：假手术的大鼠则同法切开暴露卵巢，切除一小部分脂肪，然后复位缝合。
[0073]
随机分组，每组10只，将去卵巢大鼠随机分为模型组(ovx)、阳性对照组(ev)、中药组合物低剂量组(ald)、中药组合物中剂量组(amd)、中药组合物高剂量组(ahd)；卵巢未切除的10只假手术组(sham)大鼠作为正常对照。其中，实验中所给的中药组合物为实施例1中制备的组合物1
‑
8。
[0074]
假手术组：灌服纯水(10ml/kg/次)，1天1次。
[0075]
去卵巢模型组：灌服纯水(10ml/kg/次)，1天1次。
[0076]
阳性对照组：戊酸雌二醇0.1mg/kg/次给大鼠灌胃(相当于人临床等效剂量1倍)，1天1次，给药90天。
[0077]
中药组合物低剂量组：中药组合物1g/kg/次给大鼠灌胃(相当于人临床等效剂量1倍)，1天1次，给药90天。
[0078]
中药组合物中剂量组：中药组合物2g/kg/次给大鼠灌胃(相当于人临床等效剂量2倍)，1天1次，给药90天。
[0079]
中药组合物高剂量组：中药组合物4g/kg/次给大鼠灌胃(相当于人临床等效剂量4倍)，1天1次，给药90天。
[0080]
实验周期90天，实验第89天各组大鼠均禁食，第90天使用3％戊巴比妥钠40mg/kg的剂量腹腔注射麻醉大鼠，采用腹主动脉取血将各组大鼠处死，收集的腹主动脉全血在室温静置2h后，4℃、3000rpm离心15min，将上层血清转移至干净的离心管后放置于
‑
80℃保存，用于血清生化指标的检测。取血后的大鼠，摘取心、肝、脾、肺、肾和子宫等脏器进行称重，计算脏器指数。取双侧股骨和胫骨，将附着在骨组织周围的软组织剔除干净后，用浸润了生理盐水的纱布将股骨和胫骨组织包裹，装入离心管后放在液氮中速冻，然后转移至
‑
80℃保存，用于骨组织蛋白和基因表达检测。将每组5只大鼠的右侧股骨放入4％多聚甲醛中固定48h，用于后续的micro
‑
ct扫描检测和组织病理学分析。
[0081]
1.2 骨组织micro
‑
ct扫描检测
[0082]
将右侧股骨放置测量平台上。设置扫描参数：80kv，88μa，每次扫描的旋转角度为0.4
°
，总共旋转180
°
扫描，9μm为一断层，扫描分辨率为9μm，单次扫描时间54min。使用
micro
‑
ct自带软件ct
‑
vox进行三维重建，使用ctan对股骨远端区域进行骨组织形态计量学参数计算。
[0083]
1.3 骨组织病理分析
[0084]
1.3.1 he染色
[0085]
⑴
固定：用4％多聚甲醛对骨组织进行固定，固定48h后将骨组织转移至脱钙液中脱钙30天；
[0086]
⑵
脱水与透明：脱钙后的组织由50％、75％、85％、95％和100％的乙醇逐级脱水，二甲苯透明三次；
[0087]
⑶
浸蜡与包埋：用熔点为60度的石蜡，将组织块放入包埋框石蜡内；
[0088]
⑷
切片与展片：先用刀片修去组织块周围多余的石蜡，保留3mm左右的石蜡，组织切片的厚度为5μm。展片的温度为43℃；
[0089]
⑸
烤片：把切片放至烤片机进行烤片，烤片温度50℃，烤片时间为60min；
[0090]
⑹
脱蜡水化：二甲苯10min—二甲苯10min—二甲苯10min—无水乙醇5min—95％乙醇5min—75％乙醇5min，水洗1min；
[0091]
⑺
放入harris苏木素液浸染6min，自来水洗干净；
[0092]
⑻
8％盐酸酒精分化2秒，自来水洗干净，温水返蓝2min；
[0093]
⑼
放入95％乙醇清洗1min，伊红浸染2s，95％乙醇清洗，无水乙醇清洗；
[0094]
⑽
中性树胶封片；
[0095]
⑾
显微镜下镜检，并进行图像采集分析；
[0096]
⑿
使用image j软件分析相对骨体积分数。
[0097]
1.3.2 抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)染色
[0098]
采用trap染色试剂盒对骨组织表达的trap进行染色观察，具体操作如下：
[0099]
⑴
石蜡切片脱蜡至水：将2.7.1中制得的石蜡切片依次放入环保透明剂
①
10min—环保透明剂
②
10min—环保透明剂
③
无水乙醇10min—95％酒精5min—85％酒精5min—75％酒精5min，自来水洗，蒸馏水洗三遍；
[0100]
⑵
trap孵育液的配制：将trap染液b、a、sodium tartate solution等比例混合混匀，现配现用；
[0101]
⑶
孵育染色：将切片用组化笔画圈后放在湿盒中，蒸馏水清洗干净，滴加现配的trap孵育液，于37℃烤箱孵育30min，倾去工作液，双蒸水洗1min；
[0102]
⑷
加入足量的ampd
‑
hcl(ph 9.4)滴加切片孵育10min；
[0103]
⑸
蒸馏水清洗干净；
[0104]
⑹
甲基绿复染核，蒸馏水清洗，晾干封片；
[0105]
⑺
显微镜下镜检，并进行图像采集分析，
[0106]
⑻
使用image j软件分析骨表面破骨细胞数和破骨细胞周长百分比。
[0107]
1.4 荧光定量pcr检测骨组织骨吸收相关基因mrna表达
[0108]
1.4.1 rna提取：称取左侧股骨约0.1g，置于预先冷冻干燥的洁净研钵中，将组织粗略研磨后快速加入液氮研磨至组织成粉末状，转移至1.5ml离心管中；每管中加入1ml trizol裂解液，用移液枪充分混匀，碎冰中静置15min；加入200μl氯仿，剧烈颠摇混匀，冰上静置3min；12000
×
g，4℃离心15min；吸取上清至离心管中，加入等上清体积的异丙醇，轻轻
颠倒摇匀；冰上静置15min；12000
×
g，4℃离心10min；吸弃上清，加入1ml 75％乙醇清洗rna沉淀；7500
×
g，4℃离心5min，吸弃上清液，短暂离心，吸弃残留液体，晾干3—5min；加入11μl rnase
‑
free水溶解沉淀。
[0109]
1.4.2 rna浓度测定：取1μl rna溶液滴加至超微量紫外/可见分光光度计检测rna的浓度和纯度，a260/a280的值应保持在1.8
–
2.2之间。
[0110]
1.4.3 rna逆转录cdna：rna和random primer混合液配制：10μlexperimental rna和2μl random primer(25um)。上述混合物70℃加热2min，之后置于冰上立即冷却至少5min；放在冰上直到加入逆转录反应混合液，逆转录反应混合液配制：4μl 5
×
m
‑
mlv buffer，1μl dntp mixture(10mm)，0.5μlrnase inhibitor(40u/ul)，0.5μl m
‑
mlv(200u/ul)，2μl nuclease
‑
free water；每个反应准备8μl逆转录反应混合液，在冰上混匀。将12μl rna和random primer混合液和8μl逆转录反应混合液混合，在pcr热循环仪中设置30℃，10min；42℃，60min；70℃，15min；4℃，∞。
[0111]
1.4.4 荧光定量pcr检测mrna表达
[0112]
⑴
引物设计与合成
[0113]
通过引物设计软件primer 5.0和primer bank网站设计和查找actb、ctsk、atp6v0d2、ca2、mmp9的pcr引物，引物分别针对不同的外显子，以actb作为内参对照基因。所有pcr引物均由生工生物工程有限公司合成。
[0114]
荧光定量pcr引物序列
[0115][0116][0117]
⑵
将1.5ml反应管置于冰上，配置pcr反应体系混合液：pcr反应体系混合液配制：10μl sybr premix ex taqⅱ，0.8μl pcr forward primer(10μm)，0.8μl pcr reverse primer(10μm)，0.4μl rox reference dyeⅱ(50
×
)，8μl cdna rnase
‑
free water。
[0118]
⑶
混合液用移液器混匀，1500
×
g，离心1min。
[0119]
⑷
将96孔板放置abi 7500仪器进行扩增，扩增条件如下：
[0120]
①
预变性50℃，2min和95℃，10min；
[0121]
②
扩增：95℃，15s；60℃，1min进行40个循环；
[0122]
③
熔解曲线：95℃，15s；60℃，1min；95℃，30s；60℃,15s。
[0123]
⑸
荧光定量pcr结果根据2
‑
δδct法进行分析。
[0124]
1.5 western blot检测骨组织骨吸收相关蛋白表达
[0125]
1.5.1 蛋白样品制备
[0126]
1.5.1.1 骨组织总蛋白提取：向ripa裂解液中按100:1的比例加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，置于冰上保存；称取左侧股骨约0.15g，置于预先冷冻干燥的洁净研钵中，将组织粗略研磨后快速加入液氮研磨至组织成粉末状，转移至1.5ml离心管中；加入1ml配置好的裂解液，置于摇床上4℃摇40min；12000rpm，4℃离心30min，吸取上清液转移至新的离心管中。
[0127]
1.5.1.2 蛋白浓度测定：按照碧云天生物技术有限公司bca蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(货号：p0010s)说明书操作。
[0128]
1.5.2 蛋白免疫印迹相关试剂配制、聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭、抗体免疫反应、化学发光成像、图像分析等实验方法参照文献所述(屈赵.中草药来源黄酮类化合物的神经保护作用及机制研究[d].广州中医药大学,2018.)。
[0129]
1.6 肝肾功能生化指标检测：按照南京建成生物工程研究所的丙氨酸氨基转移酶(alt)测试盒、天门冬氨酸氨基转移酶(ast)测试盒、肌酐(cre)测定试剂盒、尿素氮(bun)测试盒说明书检测血清中alt、ast、cre和bun含量。
[0130]
1.7 统计学分析
[0131]
采用spss 25.0软件对数据进行统计学处理，计量资料进行正态性检验，符合正态分布则两组间比较采用两独立样本t检验，三组或三组以上之间比较采用单因素方差检验分析，不符合正态分布采用mann
‑
whitney u检验；采用graphpad prism 8.0对统计数据进行作图。正态分布的数据用均数
±
标准差(mean
±
sd)表示，非正态分布的数据用中位数联合四分位数表示，p<0.05表示差异具有统计学意义。
[0132]
2.实验结果
[0133]
2.1 中药组合物对去卵巢大鼠骨组织形态计量学参数的影响
[0134]
采用micro
‑
ct扫描计算各组大鼠右侧股骨下端松质骨的骨密度(bmd)、骨体积分数(bv/tv)、骨小梁数量(tb.n)和骨小梁分离度(tb.sp)，结果如图1和表1所示。与假手术组相比，模型组的骨密度(p<0.05)、骨体积分数(p<0.01)和骨小梁数量(p<0.01)均明显降低，骨小梁分离度有升高趋势；与模型组相比，中药组合物1治疗显示了剂量依赖地增加骨密度、骨体积分数、骨小梁数和降低骨小梁分离度的效果(趋势)，且中药组合物1高剂量(hd)组骨密度(p<0.05)、骨体积分数(p<0.01)和骨小梁数量(p<0.01)的增加具有统计学意义。组合物5和6高剂量组对骨体积分数和骨小梁分离度有一定改善，但组合物5
‑
7中小剂量则对骨密度、骨体积分数、骨小梁数量和骨小梁分离度数据没有明显影响。
[0135]
表1中药组合物对去卵巢大鼠骨组织形态计量学参数的影响(n＝5)
[0136][0137][0138]
注：与sham组相比，
#
，p<0.05；
##
，p<0.01；与ovx组相比，
**
，p<0.01；
***
，p<0.001。数据以mean
±
sd表示。
[0139]
此外，发明人对组合物2
‑
4的实验结果也表明，与模型组相比，中药组合物治疗显示了剂量依赖地增加骨密度、骨体积分数、骨小梁数和降低骨小梁分离度的效果，且高剂量(hd)组骨密度(p<0.05)、骨体积分数(p<0.05)和骨小梁数量(p<0.05)的增加具有统计学意义。
[0140]
2.2 中药组合物1对去卵巢大鼠的骨微结构的影响
[0141]
图2骨组织三维重建图结果显示：假手术组骨小梁数目多且致密，骨小梁之间分离度较低；而模型组骨小梁数量明显减少，骨小梁间隙变大且稀疏；与模型组相比，中药组合物低中高剂量组呈剂量依赖性的趋势提高了骨小梁的数量以及降低了骨小梁之间的分离度。
[0142]
2.3 中药组合物1对去卵巢大鼠骨组织形态学的影响
[0143]
图3为中药组合物1对去卵巢大鼠骨组织形态学的影响，从图中看到，与假手术组相比，模型组股骨下端松质骨区域内骨小梁数量明显减少，且骨体积分数明显低于假手术组；与模型组相比，中药组合物低中高剂量组也呈剂量依赖性趋势提高骨体积分数，其中中
药组合物高剂量组骨体积分数升高最为明显。
[0144]
2.4 中药组合物对去卵巢大鼠骨组织内破骨细胞形成的影响
[0145]
trap染色结果显示(表2和图4)，与假手术组相比，模型组大鼠骨组织内破骨细胞数量明显增加，骨表面破骨细胞数n.oc/bs(单位骨小梁长度破骨细胞数)明显增加(p<0.01)，破骨细胞周长百分比oc.s/bs(破骨细胞覆盖的骨小梁周长占骨小梁表面总周长的百分比)明显增加(p<0.05)；与模型组相比，中药组合物1在低剂量组大鼠骨组织中骨表面破骨细胞数和破骨细胞周长百分比(p<0.05)有所降低，而中剂量可明显降低骨表面破骨细胞数(p<0.05)，高剂量组大鼠骨表面破骨细胞数和破骨细胞周长百分比均明显降低(p<0.01)。组合物6高剂量组对骨表面破骨细胞数和破骨细胞周长百分比有一定改善，但组合物5
‑
7中小剂量则对骨表面破骨细胞数和破骨细胞周长百分比数据没有明显影响。组合物5
‑
7对骨表面破骨细胞数和破骨细胞周长百分比数据没有明显影响，或者虽有一定程度减少但差异不具有显著性。
[0146]
表2中药组合物对去卵巢大鼠骨组织中破骨细胞形成的影响(n＝3)
[0147][0148]
注：与sham组相比，
#
，p<0.05；
##
，p<0.01；与ovx组相比，
*
，p<0.05；
**
，p<0.01。n.oc/bs(/mm)＝破骨细胞数/骨小梁长度，oc.s/bs(％)＝破骨细胞覆盖骨小梁长度/骨小梁总长度。数据以mean
±
sd表示。
[0149]
此外，发明人对组合物2
‑
4的实验结果也表明，与模型组相比，中药组合物2
‑
4的中高剂量可明显降低骨表面破骨细胞数和破骨细胞周长百分比(p<0.05)。
[0150]
2.5 中药组合物对去卵巢大鼠骨组织中骨吸收相关基因mrna表达的影响
[0151]
见表3和图5，与假手术组相比，模型组大鼠骨组织中ca2(p<0.01)、mmp9(p<0.01)、ctsk(p<0.01)和atp6v0d2(p<0.05)的mrna表达明显升高；与模型组相比，中药组合物1的低、中、高剂量组均可明显抑制去卵巢大鼠骨组织中ca2(p<0.05)和mmp9(p<0.05和p<0.01)基因mrna的表达水平；而且中、高剂量组还可明显抑制去卵巢大鼠骨组织中ctsk基因mrna的表达水平(p<0.05和p<0.01)；但对atp6v0d2基因mrna的表达水平没有明显影响。中药组合物5中高剂量组和中药组合物7高剂量组对ca2表达有一定程度上的影响；而中药组合物5
‑
7各剂量组对mmp9、ctsk和atp6v0d2的表达水平都没有明显影响。
[0152]
表3各组大鼠骨组织中骨吸收相关基因mrna表达的比较(n＝4)
[0153][0154][0155]
注：与sham组相比，
#
，p<0.05；
##
，p<0.01；与ovx组相比，
*
，p<0.05；
**
，p<0.01。
[0156]
此外，发明人对组合物2
‑
4的实验结果也表明，与模型组相比，中药组合物2
‑
4的低、中、高剂量组均可明显抑制去卵巢大鼠骨组织中ca2(p<0.05)和mmp9(p<0.05)基因mrna的表达水平；而且中、高剂量组还可明显抑制去卵巢大鼠骨组织中ctsk基因mrna的表达水平(p<0.05和p<0.01)；同时对atp6v0d2基因mrna的表达水平也没有明显影响。
[0157]
2.6 中药组合物对去卵巢大鼠骨组织中骨吸收相关蛋白表达的影响
[0158]
结果见表4和图6，与假手术组相比，模型组大鼠骨组织中骨吸收相关蛋白tracp(p<0.05)、ctsk(p<0.01)和c
‑
fos(p<0.01)蛋白表达明显升高；与模型组相比，中药组合物1的
低中高三个剂量都能显著抑制tracp蛋白表达(p<0.001)，且中药组合物1的高剂量(hd)可明显抑制ctsk(p<0.05)和c
‑
fos(p<0.01)的蛋白表达，作用强度与阳性对照药物接近。而中药组合物5
‑
7对骨吸收相关蛋白ctsk和c
‑
fos水平的异常升高没有影响；仅在高剂量下有一定的改善骨吸收相关蛋白tracp水平的作用(p<0.05)。总体效果低于组合物1。
[0159]
表4各组大鼠骨组织中骨吸收相关蛋白表达的比较(n＝3)
[0160][0161][0162]
注：与sham组相比，
#
，p<0.05；
##
，p<0.01；与ovx组相比，
*
，p<0.05；
**
，p<0.01；
***
，p<0.001。
[0163]
此外，发明人对组合物2
‑
4的实验结果也表明，与模型组相比，中药组合物2
‑
4的低中高三个剂量都能显著抑制tracp蛋白的过高表达(p<0.01)，且高剂量(ahd)可明显抑制ctsk(p<0.05)和c
‑
fos(p<0.05)的蛋白的过高表达。
[0164]
实施例3中药组合物抑制破骨细胞分化的作用
[0165]
1.实验方法
[0166]
1.1 实验动物
[0167]
spf级雄性c57bl/6小鼠，6
‑
8周龄，购于广州中医药大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：scxk(粤)2018
‑
0034，动物合格证号：440005800012347。
[0168]
1.2 主要试剂配制
[0169]
⑴
细胞完全培养基：采用含10％澳洲胎牛血清和1％双抗的α
‑
mem培养基，用于
mc3t3
‑
e1细胞、骨髓来源单核细胞和诱导破骨细胞培养。
[0170]
⑵
中药组合物储备液配制：将中药组合物(实施例1的中药组合物1
‑
7)用dmso完全溶解制成50mg/ml的储备液，分装放置于
‑
20℃保存备用。
[0171]
⑶
rankl储备液配制：将10μg rankl溶解于1ml含有1％bsa的pbs中，混匀，分装放置于
‑
80℃保存备用。
[0172]
⑷
m
‑
csf储备液配制：将10μg m
‑
csf溶解于1ml含有1％bsa的pbs中，混匀，分装放置于
‑
80℃保存备用。
[0173]
⑸
破骨细胞分化诱导液：将浓度为10μg/ml的rnakl和10μg/ml的m
‑
csf加入到α
‑
mem完全培养液中，混匀，使rankl终浓度为50ng/ml，m
‑
csf终浓度为20ng/ml，即得。
[0174]
1.3 中药组合物醇提取物的制备
[0175]
取实施例1中药组合物的醇提取物，用于细胞药理实验。
[0176]
醇提取物的制备：
[0177]
⑴
将5g中药组合物加入到40ml甲醇(分析纯)中，浸泡30min；
[0178]
⑵
25khz，250w，超声30min；
[0179]
⑶
取出液体，8000rpm离心20min，取上清；
[0180]
⑷
剩余颗粒继续加入40ml甲醇溶液，超声30min；
[0181]
⑸
取出液体，8000rpm，离心20min；
[0182]
⑹
重复
⑷
和
⑸
步骤；
[0183]
⑺
将三次提取的上清液合并，减压下蒸除甲醇，50℃真空干燥，留样备用。
[0184]
1.4 c57bl/6小鼠骨髓单核细胞(bone marrow monocytes)的提取与培养
[0185]
⑴
使用过量二氧化碳处死小鼠，将小鼠浸泡于75％酒精中消毒5min；
[0186]
⑵
无菌条件下取出小鼠双侧股骨，用纱布逐步剥离股骨周围肌肉和软组织，将双侧股骨放置于含有无血清α
‑
mem培养基的培养皿中；
[0187]
⑶
将股骨放置75％酒精中，然后用无血清α
‑
mem培养基清洗5次；剪去股骨两端暴露骨髓腔，用0.45mm针头注射器抽取培养基插入骨髓腔中反复冲洗骨髓腔，直到骨髓腔变白；将冲洗骨髓腔后的培养基转移至50ml无菌离心管中；
[0188]
⑷
4℃，800
×
g离心5min，弃上清收集细胞沉淀；加入红细胞裂解液，轻轻吹打细胞重悬，置于冰上8min；加入无血清α
‑
mem培养基终止细胞裂解，4℃，500
×
g离心10min，弃上清收集细胞沉淀；
[0189]
⑸
加入完全培养液重悬细胞，在培养箱孵育过夜；次日，转移上清液至15ml离心管中，收集未贴壁细胞；加入含有20ng/ml m
‑
csf的完全培养液，随后接种于t25培养瓶，置于培养箱中培养约4天；
[0190]
⑹
4天后，培养瓶中贴壁的细胞即为原代骨髓源巨噬细胞(bone marrow macrophages，bmms)；吸弃上清，无菌pbs洗涤后加入胰酶放置培养箱中孵育5—10min，镜下观察瓶内细胞消化情况，当大部分细胞变圆后加入培养基终止消化，收集细胞备用。
[0191]
1.5 中药组合物醇提取物对bmms细胞增殖的作用
[0192]
⑴
用含有20ng/ml m
‑
csf的完全培养基将1.4
⑹
中获得的bmms细胞配制为10
×
104/ml的细胞悬液，铺于96孔板中，每孔加入100μl细胞悬液，空白组、对照组及各浓度给药组均设置3个复孔，细胞培养板置于37℃、5％co2培养箱中培养过夜；
[0193]
⑵
次日细胞贴壁良好，小心吸弃原有培养基，加入含有不同浓度中药组合物醇提物(0
‑
100μg/ml)的20ng/ml m
‑
csf的培养液，置于培养箱中孵育48h或72h；
[0194]
⑶
小心吸弃培养基，每孔加入含10％cck
‑
8的无血清培养基100μl，于培养箱中继续培养2h，用酶标仪检测450nm波长处od值，根据(给药组od值—空白组od值)/(对照组od值—空白组od值)
×
100％公式计算各给药组细胞活力。
[0195]
⑷
上述实验重复3次，最后结果为三次结果的平均值。
[0196]
1.6 中药组合物醇提取物对rankl诱导的破骨细胞分化的影响
[0197]
⑴
收集1.4
⑹
中获得的bmms细胞，加入1ml含有20ng/ml m
‑
csf的完全培养基重悬细胞并计数；
[0198]
⑵
不同浓度中药组合物醇提取物对破骨分化的影响：将bmms细胞以1
×
104/孔的密度接种于96孔板中，放置于细胞培养箱孵育过夜；吸弃原培养基，阴性对照组(不诱导破骨分化)加入20ng/ml m
‑
csf的完全培养基，诱导分化各组则加入破骨细胞诱导分化培养基，中药组合物醇提取物各组同时加入不同浓度(10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)的中药组合物。诱导过程中每两天更换一次培养基。培养5天后，细胞用4％多聚甲醛固定，并进行trap染色观察破骨细胞的形态和数量。
[0199]
⑶
固定浓度的中药组合物醇提取物作用不同时间段对破骨分化的影响：将bmms细胞以1
×
104/孔的密度接种于96孔板中，放置于细胞培养箱孵育过夜；吸弃原培养基，对照组加入含0.1％dmso破骨细胞诱导分化培养基，给药组加入含50μg/ml中药组合物醇提取物的破骨细胞诱导分化培养基。分别在分化诱导的第0、1、3、5天，采用4％多聚甲醛固定细胞，并进行trap染色。
[0200]
1.7 破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)染色
[0201]
采用抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)染色试剂盒，按其提供的操作说明对破骨细胞进行染色观察。具体操作如下：
[0202]
⑴
细胞固定：采用4％多聚甲醛固定细胞20min，再采用37℃预热的去离子水清洗细胞2遍(吸弃水分时注意避开细胞)；
[0203]
⑵
trap染液准备
[0204]
①
取0.6ml离心管，加入0.125ml fast garnet gbc base solution和0.125ml sodium nitrite solution，轻轻颠倒混合30s，静置2min；
[0205]
②
15ml离心管，加入10ml 37℃预热的去离子水，再加入
①
步骤中配制的混合液，最后加入125μl naphthol as
‑
bl phosphate solution和500μl acetate solution，混匀；
[0206]
③
配制好的染液需避光保存；
[0207]
⑶
染色：固定好的细胞(96
‑
孔板)，每孔加入100μl trap染液，37℃避光孵育30min；
[0208]
⑷
洗涤：吸弃染液，细胞用去离子水清洗3遍；
[0209]
⑸
破骨细胞分化情况观察：光学显微镜下观察破骨细胞分化形态，被染成紫色且胞内含有三个或三个以上细胞核的多核细胞，即为成熟的破骨细胞。
[0210]
1.8 实时荧光定量pcr(rt
‑
qpcr)检测破骨分化基因mrna表达
[0211]
1.8.1 细胞样品准备
[0212]
分别按如下
⑴
和
⑵
所述进行细胞接种和给药
[0213]
⑴
将bmms细胞以15
×
104/孔的密度接种于6孔板，放置于细胞培养箱孵育过夜；吸弃原培养基，加入含有不同浓度(0μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)中药组合物醇提取物的破骨细胞诱导分化培养基继续培养，每两天更换一次培养基，培养5天后提取rna；
[0214]
⑵
将bmms细胞以15
×
104/孔的密度接种于6孔板，放置细胞培养箱孵育过夜；吸弃原培养基，对照组加入破骨细胞诱导分化培养基，给药组加入含50μg/ml中药组合物醇提取物的破骨细胞诱导分化培养基，分别继续培养0、1、3、5天后提取rna。
[0215]
1.8.2 细胞样品的总rna提取
[0216]
取出细胞板，吸弃培养基，预冷pbs清洗一遍；每孔加入500μl trizol裂解液，用移液枪充分混匀，碎冰中静置15min；加入100μl氯仿，剧烈颠摇混匀，冰上静置3min；12000
×
g，4℃离心15min；吸取上清至离心管中，注意不要吸到中间蛋白层，加入等上清体积的异丙醇，轻轻颠倒摇匀；冰上静置15min；12000
×
g，4℃离心10min；吸弃上清，加入1ml 75％乙醇清洗rna沉淀；7500
×
g，4℃离心5min，吸弃上清液，短暂离心，吸弃残留液体，晾干3
–
5min；加入11μl rnase
‑
free水溶解沉淀，即得rna溶液样本。
[0217]
1.8.3 rna浓度测定
[0218]
实验方法同实施例2的1.4节所述。
[0219]
1.8.4 rna逆转录cdna
[0220]
实验方法同实施例2的1.4节所述。
[0221]
1.8.5 荧光定量pcr检测mrna表达
[0222]
实验方法同实施例2的1.4节所述。
[0223]
荧光定量pcr引物序列
[0224][0225]
1.9 western blot检测破骨细胞分化蛋白表达
[0226]
1.9.1 蛋白样品制备
[0227]
1.9.1.1 细胞样品准备：分别按如下
⑴
和
⑵
所述进行细胞接种和给药
[0228]
⑴
将bmms细胞以15
×
104/孔的密度接种于6孔板，放置细胞培养箱孵育过夜；吸弃原培养基，加入含有不同浓度(0μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)中药组合物的破骨细胞诱导分化培养基继续培养，每两天更换一次培养基，培养5天后提取细胞蛋白；
[0229]
⑵
将bmms细胞以15
×
104/孔的密度接种于6孔板，放置细胞培养箱孵育过夜；吸弃原培养基，对照组加入破骨细胞诱导分化培养基，给药组加入含50μg/ml中药组合物的破骨细胞诱导分化培养基，分别继续培养0、1、3、5天后提取细胞蛋白。
[0230]
1.9.1.2 细胞总蛋白提取：向ripa裂解液中按100:1的比例加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，置于冰上保存；取出细胞板，吸弃培养板中的培养基，用预冷pbs洗涤两次；往培养板孔中加入150μl ripa裂解液，轻轻晃动培养板使裂解液覆盖细胞，在冰上裂解20min，用枪头反复吹打裂解液使细胞充分裂解；将裂解液转移至1.5ml离心管管中，12000rpm，4℃离心20min，吸取上清液(总蛋白)转移至新的离心管中
[0231]
1.9.1.3 蛋白浓度测定步骤：按照碧云天生物技术有限公司bca蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(货号：p0010s)说明书操作。
[0232]
1.9.2 蛋白免疫印迹相关试剂配制、聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭、抗体免疫反应、化学发光成像、图像分析等实验方法参照文献所述(屈赵.中草药来源黄酮类化合物的神经保护作用及机制研究[d].广州中医药大学,2018.)。
[0233]
1.10 统计学分析
[0234]
方法同实施例2的1.7节所述。
[0235]
2.实验结果
[0236]
2.1 中药组合物1醇提取物对bmms细胞活力的影响
[0237]
实验结果显示，10
‑
100μg/ml浓度的中药组合物1作用于细胞48h或72h，对bmms并未表现出细胞毒性，反而具有明显促增殖作用(p<0.05)。见表5和图7。
[0238]
表5不同浓度中药组合物1醇提取物对bmms细胞活力的影响(n＝3)
[0239][0240][0241]
注：与对照组相比，
*
，p<0.05；
**
，p<0.01；
***
，p<0.001。数据以mean
±
sd表示。
[0242]
2.2 中药组合物醇提取物抑制破骨细胞分化
[0243]
实验结果显示，未经过rankl诱导的bmms细胞不能被染色，呈单核细胞态；经过rankl诱导而未加中药组合物干预的bmms细胞可被染色，且表现为巨大的多核破骨细胞，诱导形成的破骨细胞平均数为77.89
‑
85.44；而经过本专利中药组合物干预后破骨细胞形成明显减少：在中药组合物1醇提取物浓度分别为10、25和50μg/ml组时，破骨细胞平均数依次显著降低为47(p<0.01)、11.33(p<0.001)和5(p<0.001)，如表6和图8所示。相应浓度的中药组合物5
‑
7醇提取物组，破骨细胞平均数也有不同程度的降低，以高浓度组降低的破骨细胞平均数更明显(p<0.05和p<0.01)，但总体效果不如中药组合物1醇提取物。
[0244]
表6中药组合物醇提取物抑制破骨细胞分化(n＝3)
[0245][0246]
注：与对照组相比，
*
，p<0.05；
**
，p<0.01；
***
，p<0.001。数据以mean
±
sd表示。
[0247]
此外，发明人研究表明10
‑
50μg/ml浓度的中药组合物2
‑
4醇提取物干预后，破骨细胞的形成也显著减少(p<0.01和p<0.001)。
[0248]
2.3 中药组合物1醇提取物抑制破骨分化标志性基因mrna表达
[0249]
实验结果显示，与对照组相比，中药组合物1醇提取物可剂量依赖地抑制破骨细胞分化标志性基因car2、tracp、ctsk、atp6v0d2、dcstamp和calcr的mrna表达。其中，中药组合物1醇提取物在50μg/ml和25μg/ml浓度下能显著抑制所有6个基因的表达，在10μg/ml浓度下可显著抑制tracp、ctsk和calcr的mrna表达，见表7和图9。
[0250]
表7中药组合物1醇提取物抑制rankl诱导的破骨分化关键基因mrna表达(n＝3)
[0251][0252]
注：与对照组相比，
*
，p<0.05；
**
，p<0.01；
***
，p<0.001。mrna相对表达值根据2
‑
δδct
法进行计算。数据以mean
±
sd表示。
[0253]
2.4 中药组合物1醇提取物抑制破骨分化标志性蛋白的表达
[0254]
实验结果显示，与对照组相比，中药组合物1醇提取物50μg/ml组可显著抑制mmp9、ctsk和tracp的表达；中药组合物1醇提取物25μg/ml组可显著抑制mmp9和ctsk的表达；而中药组合物1醇提取物10μg/ml组对mmp9、ctsk和tracp的表达无明显影响(表8和图9)。
[0255]
表8中药组合物1醇提取物抑制rankl诱导的破骨分化关键蛋白表达(n＝3)
[0256][0257][0258]
注：与对照组相比，
*
，p<0.05；
**
，p<0.01；
***
，p<0.001。蛋白表达比值＝目的蛋白灰度/β
‑
actin蛋白灰度值。数据以mean
±
sd表示。
[0259]
应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。