一种线结构复合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及一种线结构复合物及其制备方法和应用，具体涉及一种使用壳聚糖和葛根素作为原料通过固相合成法获得的兼具抗菌和促成骨的复合物材料，属于生物材料领域。


背景技术：

2.壳聚糖又称为脱乙酰甲壳素，是由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰作用得到的，属高分子直链型多糖。壳聚糖具有一定的抗菌性，但是高浓度的壳聚糖对细胞有毒性。葛根素是一种从葛根里面提取得到的中药成分，不仅具有清除内毒素(lps)的作用，而且可以调节机体的免疫反应。但是，葛根素不具有抗菌作用，并且高浓度使用时对细胞有毒性。lps对细菌膜的形成发挥着重要的作用，利于细菌的增殖。lps能够促使巨噬细胞向1型分化，不利于组织的愈合。除此之外，lps会诱发持续高热，引起多种并发症。


技术实现要素：

3.为了解决现有技术中存在的抗菌后lps释放引起的并发症难题，本发明的目的在于提供了一种线结构复合物(或称抗菌促成骨复合物)及其制备方法和应用，以填补现有技术的空白。
4.一方面，本发明提供了一种线结构复合物，所述线结构复合物是由壳聚糖和葛根素通过固相反应形成的具有线状结构的复合物。
5.在本公开中，通过将壳聚糖和葛根素复合制备得到线结构复合物，不仅可以杀死细菌，而且可以清除内毒素，得到具有免疫调节抗菌和成骨的复合材料。
6.较佳的，所述线结构复合物的线结构直径为60～200nm，。
7.较佳的，所述线结构复合物中壳聚糖和葛根素的质量比为(0.25～5)：1，优选为(0.5～2)：1。
8.另一方面，本发明提供了一种上述的线结构复合物的制备方法，包括：(1)将壳聚糖和葛根素加入反应器皿中，再加入酸溶液作为溶剂，得到混合物；(2)将所得混合物在物理混合作用下发生固相反应，再加入去离子水或酸溶液进行溶解，最后经过冷冻干燥，得到所述线结构复合物。
9.在本发明中，将将壳聚糖和葛根素加入反应器皿中，以酸溶液作为溶剂，得到混合物。将混合物再经过物理混合作用产生的物理外力下使得混合物中局部温度升高，进而使得壳聚糖和葛根素发生固相反应，其固相反应实质为，葛根素与壳聚糖在外力提供的局部高温下发生化学反应，其可能的化学反应为壳聚糖的氨基与葛根素的羟基发生缩合反应或与羰基发生亲核取代反应。同时，在酸溶液的存在下，葛根素与壳聚糖的反应产物析出结晶形成线结构复合物。随后，再加入去离子水或酸溶液进行溶解，得到混合溶液。将所得混合溶液再经过冷冻干燥，得到所述线结构复合物。
10.较佳的，所述壳聚糖的脱乙酰度为85～100％；所述葛根素的纯度为90～100％。
11.较佳的，通过外界作用实现固相反应，所述外界物理混合作用的方式包括研磨、机械球磨、搅拌、或混合离心；所述研磨的时间为2～20分钟；所述机械球磨的转速为60～600转/分钟，时间为2分钟～5小时；所述搅拌的转速为100～1000转/分钟，时间为2分钟～5小时；所述混合离心的转速为重力加速度50g～12000g，时间为2分钟～20分钟。
12.较佳的，所述酸溶液为含有有机酸和/或无机酸的溶液；优选地，所述有机酸为乙酸、酒石酸、草酸、苹果酸、枸椽酸、抗坏血酸、苯甲酸、水杨酸、咖啡酸中的至少一种，所述无机酸为氢氟酸、盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、中的至少一种；更优选地，所述酸溶液的浓度为0.1～10m。
13.较佳的，所述固相反应的时间为2～20分钟。其中，线结构复合物的直径随复合物合成时间增加而增加。
14.较佳的，所述干燥的方式为自然风干、烘干、或冷冻干燥；所述烘干的温度为40～80℃，时间为2～12小时；所述冷冻干燥的温度为-30～-50℃，时间为5～48小时。
15.第三方面，一种生物医用材料，包括：生物医用基材，以及负载于生物医用基材表面的由上述的线结构复合物组成的涂层；优选地，所述生物医用基材选自医用纱布、医用敷料、植入物钛基金属、阳极氧化表面处理的钛基金属(简称阳极氧化钛基金属)、或微弧氧化表面处理的钛基金属(简称微弧氧化钛基金属)、聚醚醚酮peek、磺化表面处理的peek(简称磺化peek)、或氧化锆陶瓷。
16.第四方面，本发明还提供了一种上述线结构复合物在制备抗菌敷料和骨植入体材料中的应用。
17.有益效果：(1)本发明中，所制备的抗菌促成骨复合物可负载在硬组织植入体表面，体外实验中证明具有：良好的抗革兰氏阴性菌和抗革兰氏阳性菌作用；促进骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化；调节巨噬细胞表型及其因子分泌。体内实验表明本发明合成的抗菌促成骨复合物能够有效的降低由于内毒素释放引起的高热反应，并且能够促进感染骨的再生，提供了一种兼具抗菌成骨和降低术后并发症的骨植入材料；(2)本发明中，抗菌促成骨复合物的制备工艺稳定可控，操作简单，成本低，易于实现，便于推广应用。
附图说明
18.图1为实施例1中使用乙酸作为酸性溶剂合成的冻干线结构复合物的扫描电镜照片，其中(a)壳聚糖、(b)葛根素、(c)壳聚糖复合葛根素冻干复合物，从图中可知单一组分壳聚糖和葛根素无明显结构，两者经固相反应冻干后，其复合物呈现显著的线结构，且线结构直径为60-200nm；图2为使用hf酸(a)、盐酸(b)和硝酸(c)作为溶剂合成的冻干复合物的扫描电镜照片，从图中可知使用不同无机酸作为溶剂，冻干复合物尽管形貌有差异，但均存在线结构；图3为壳聚糖、葛根素和实施例5所得风干复合物的抗菌性对比图，其中(a)壳聚糖、(b)葛根素、(c)壳聚糖复合葛根素的线结构复合物培养并重新移植至琼脂板上培养后的大肠
杆菌菌落图，从图中可知壳聚糖与葛根素抗菌性不佳，两者经固相反应得到的线结构复合物具有优异的抗大肠杆菌能力；图4为实施例1合成的线结构复合物使用纱布负载后的细菌增殖情况照片，(a)大肠杆菌(b)金黄色葡萄球菌，从图中可知负载到纱布后，与空白对照组相比，壳聚糖具有一定的抗金葡菌能力，但会促进大肠杆菌增殖；葛根素无抗菌能力；不同质量比的壳聚糖和葛根素复合后均呈现优异的抗菌性能；图5为实施例1制备的线结构复合物含量对骨髓间充质干细胞的毒性测试照片，从图中可知壳聚糖和葛根素直接混合和固相反应得到的复合物均具有较好的细胞相容性，较低含量下对细胞增殖几乎无影响；图6为实施例7中将原料和线结构复合物分别负载到骨植入体材料上的扫描电镜图片，其中(a)磺化peek、(b)负载壳聚糖的磺化peek、(c)负载葛根素的磺化peek、(d)负载抗菌促成骨复合物的磺化peek，从图中可知线结构复合物可负载到磺化peek的三维孔道结构中(peek：聚醚醚酮组；sp：磺化peek组；spp：葛根素负载的磺化peek组；spc：壳聚糖负载的磺化peek组；spp@c：线结构复合物负载的磺化peek；图7为实施例7制备的负载线结构复合物的磺化peek抗大肠杆菌的菌的作用，从图中可知负载线结构复合物的磺化peek对大肠杆菌具有优秀的杀菌作用：扫描电镜图片中线结构负载的磺化peek表面细胞膜破裂；涂板结果显示线结构负载的磺化peek无明显可见的菌落(peek：聚醚醚酮组；sp：磺化peek组；spp：葛根素负载的磺化peek组；spc：壳聚糖负载的磺化peek组；spp@c：线结构复合物负载的磺化peek)；图8为实施例7制备的负载线结构复合物的磺化peek抗金黄色葡萄球的作用，从图中可知线结构负载的磺化peek对金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用(peek：聚醚醚酮组；sp：磺化peek组；spp：葛根素负载的磺化peek组；spc：壳聚糖负载的磺化peek组；spp@c：线结构复合物负载的磺化peek)；图9为实施例7制备的负载线结构复合物的磺化peek抗绿脓杆菌的作用，从图中可知线结构复合物对绿脓杆菌具有优秀的抗菌作用(peek：聚醚醚酮组；sp：磺化peek组；spp：葛根素负载的磺化peek组；spc：壳聚糖负载的磺化peek组；spp@c：线结构复合物负载的磺化peek)；图10为实施例7制备的负载线结构复合物的磺化peek对骨髓间充质干细胞的毒性(a)和碱性磷酸酶表达(b)，从图中可知负载线结构复合物的恍惚apeek材料可促进干细胞的增殖和成骨分化指标alp的表达(peek：聚醚醚酮组；sp：磺化peek组；spp：葛根素负载的磺化peek组；spc：壳聚糖负载的磺化peek组；spp@c：线结构复合物负载的磺化peek)；图11为实施例7制备的线结构复合物对巨噬细胞表型的调节作用(a)和对细胞因子的调节作用(b)，ccr7和tnf-α为m1型巨噬细胞的表面特异蛋白和细胞因子；cd206和il-10分别为m2型巨噬细胞的表面特异蛋白和细胞因子，从图中可知线结构巨噬细胞可促进巨噬细胞向m2型分化；图12为实施例7制备的线结构复合物的lps清除作用，从图中可知线结构复合物负载的磺化peek可有效清除lps(peek：聚醚醚酮组；sp：磺化peek组；spp：葛根素负载的磺化peek组；spc：壳聚糖负载的磺化peek组；spp@c：线结构复合物负载的磺化peek)；图13为实施例7制备的负载线结构复合物的磺化peek植入大鼠体内的体温检测，从图
中可知线结构复合物负载的磺化peek可有效降低骨髓炎模型小鼠的时候体温(peek：聚醚醚酮组；sp：磺化peek组；spp：葛根素负载的磺化peek组；spc：壳聚糖负载的磺化peek组；spp@c：线结构复合物负载的磺化peek)；图14为实施例7制备的负载线结构复合物的磺化peek植入大鼠体内的成骨情况，从图中可知最上面一排分别是植入体内后的三色荧光；中间一排左侧为三色荧光对的定量结构，右侧为骨小梁的bv/tv；最下面一排为micro-ct二维重建结果，可进一步看出线结构复合物负载的磺化peek可促进骨髓炎模型小鼠的体内新骨生成。(peek：聚醚醚酮组；sp：磺化peek组；spp：葛根素负载的磺化peek组；spc：壳聚糖负载的磺化peek组；spp@c：线结构复合物负载的磺化peek)；图15为实施例8制备的线结构复合物的扫描电镜图片，其中(a)研磨0min、(b)研磨5min、(c)研磨20min、(d)研磨5min后60℃加热1h、(e)研磨5min后100℃加热1h，从图中可知，随着研磨时间的延长，线结构更加明显，数量和线直径随之增加，加热会破坏线结构；图16为实施例8制备的线结构复合物的加入细菌液后的细菌增殖情况图，其中(a)大肠杆菌、(b)金黄色葡萄球菌，横坐标“1-6”依次对应“control”、“5min”、“0min”、“20min”、“5min-60”、“5min-100”，由图16可知，复合物研磨5min后，对两种细菌均具有有意的抗菌能力，研磨0min，抗菌性不佳，研磨20min后，复合物失去抗菌能力，可能与研磨时间过长研磨过程中局部高温破坏材料组分及性能有关。研磨5min并加热(60℃和100℃)后，材料同样具有优异的抗菌能力。
具体实施方式
19.以下通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
20.在本公开中，使用壳聚糖和葛根素作为原料，通过固相合成法，得到兼具抗菌和促成骨的线结构复合物。其中，所述复合物具有线状结构，该复合物体系中包含大量氢键。在可选的实施方式中，线结构复合物中线结构的直径可为60～200nm。
21.在本发明的一实施方式中，使用壳聚糖和葛根素作为原料，选用酸溶液作为溶剂，并通过外界物理混合作用实现固相合成，获得的线结构复合物。
22.在可选的实施方式中，壳聚糖的脱乙酰度可为85～100％。使用的葛根素纯度可为90～100％。所用原料中，壳聚糖与葛根素的质量比为0.25—5，优选为0.5—2。
23.在可选的实施方式中，固相合成使用的溶剂为稀释的无机酸、稀释的有机酸、或稀释的无机酸和有机酸的混合溶液。无机酸可为氢氟酸、盐酸、硫酸、硝酸等中的至少一种。有机酸可为乙酸、酒石酸、草酸、苹果酸、枸椽酸、抗坏血酸、苯甲酸、水杨酸、咖啡酸等中的至少一种。使用的酸溶液的浓度可为0.1～10m。加入酸溶液和壳聚糖的比为(100～300)μl：(25～100)mg，复合物具有剪切变稀性能。
24.在可选的实施方式中，外界物理混合作用可为固相研磨过程(即研磨)、机械球磨、搅拌和混合离心等手段。其中，在线结构复合物在合成后，其颜色随时间变化，由淡白色逐渐变为乳白色，其原因为反应过程中，复合物逐渐析出结晶，发生一系列颜色变化。物理混合作用的时间可为2分钟～5小时。例如，所述研磨的时间可为2～20分钟。所述机械球磨的转速可为60～600转/分钟，时间可为2分钟～5小时。所述搅拌的转速可为100～1200转/分
钟，时间可为2分钟～5小时。所述混合离心的转速为重力加速度50～12000g，时间可为2～20分钟。而且，上述外界物理混合作用的作用力过大或/和作用时间过长，所得线结构复合物抗菌效果、生物活性降低，这主要是由于所得线结构在外力作用下，由于外力过大产生的局部温度过高，导致反应无法正常进行，获得的复合物失去生物活性。
25.固相反应完成后，加入去离子水或上述酸溶液以溶解所得高分子的线结构复合物，得到混合溶液。
26.将混合溶液进行干燥，得到线结构复合物。在可选的实施方式中，干燥的方式可为自然风干、烘干、或冷冻干燥等。其中，烘干的温度可为40～80℃，时间可为2～12小时。冷冻干燥的温度可为-30～-50℃，时间可为5～24小时。
27.此外，还可根据不同的干燥方式对所得线结构复合物重新命名。例如，自然风干后所得线结构复合物可命名为风干复合物。烘干后所得线结构复合物可命名为烘干复合物。冷冻干燥后所得线结构复合物可命名为冻干复合物、或冻干海绵等。
28.在本发明中，所得线结构复合物可直接应用于体内和体表。例如，将线结构复合物(抗菌促成骨复合物)进一步装载或涂覆在植入体、纱布等生物医用基材表面，形成生物医用涂层，制备得到装载线结构复合物的生物医用材料(例如，抗菌敷料、骨植入体等)。该生物医用涂层表面可以提高生物材料的抗菌性和成骨性。将线结构复合物负载于基材表面的方法包括但不仅限于浸泡、旋涂、喷洒和直接涂抹等。
29.本发明中，所制备的抗菌促成骨复合物，具有良好的抗菌作用，可以负载于应用在体表或体内的生物医用基材表面(例如，包括医用纱布、医用敷料、植入物钛基金属、阳极氧化或微弧氧化等表面处理的钛基金属、peek、磺化等表面处理的peek和氧化锆陶瓷等材料表面)，实现在不同领域对抗菌和促成骨的要求，并且该复合物使用壳聚糖和中药进行复合，具有很好的生物安全性，有望于临床应用。
30.在本发明中，线结构复合物具有纳米线结构，且具有良好的抗菌性能，能够促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，调节巨噬细胞表型和相关细胞因子的分泌。例如，所得线结构复合物对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均较明显的抗菌效果。所得线结构复合物能够清除细菌释放的内毒素。所得线结构复合物能够促进巨噬细胞呈现为m2型，并且促进巨噬细胞分泌抗炎因子。骨髓间充质干细胞能够在由线结构复合物组成的涂层表面快速向成骨细胞方向分化，显示出优异的成骨相容性。
31.下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
32.实施例1滴加200μl的0.875m乙酸润湿50mg的壳聚糖的去离子水溶液中，再加入52mg的葛根素(壳聚糖和葛根素的质量比为1：1.04)，研磨5分钟，然后加入10ml 0.175m乙酸溶解所获得的抗菌促成骨复合物；将所获得的0.175m乙酸溶解所获得的抗菌促成骨复合物用冷冻干燥机(-40℃)冷冻干燥24小时，获得抗菌促成骨复合物的冻干海绵，标记为c@p1。
33.实施例2滴加200μl的2.85m hf酸润湿50mg的壳聚糖的去离子水溶液中，再加入52mg的葛根素(壳聚糖和葛根素的质量比为1：1.04)，研磨5分钟，然后加入10ml的0.57m hf酸溶解所获得的抗菌促成骨复合物；将所获得的0.57m hf酸溶解所获得的抗菌促成骨复合物用冷冻干燥机(-40℃)冷冻干燥24小时，获得抗菌促成骨复合物的冻干海绵，标记为c@p2。
34.实施例3a)滴加200μl的1.632m盐酸润湿50mg的壳聚糖的去离子水溶液中，再加入52mg的葛根素(壳聚糖和葛根素的质量比为1：1.04)，研磨5分钟，然后加入10ml的0.324m hcl酸溶解所获得的抗菌促成骨复合物；b)将所获得的0.324m hcl酸溶解所获得的抗菌促成骨复合物用冷冻干燥机(-40℃)冷冻干燥24小时，获得抗菌促成骨复合物的冻干海绵，标记为c@p3。
35.实施例4滴加200μl的1.127m硝酸润湿5mg/ml的壳聚糖的去离子水溶液中，再加入5.2mg/ml的葛根素(壳聚糖和葛根素的质量比为1：1.04)，研磨5分钟，然后加入0.225m乙酸溶解所获得的抗菌促成骨复合物；将所获得的0.225m硝酸溶解所获得的抗菌促成骨复合物用冷冻干燥机(-40℃)冷冻干燥24小时，获得抗菌促成骨复合物的冻干海绵，标记为c@p4。
36.实施例5滴加200μl的0.875m乙酸润湿50mg的壳聚糖，再加入52mg的葛根素(壳聚糖和葛根素的质量比为1：1.04)，研磨5分钟，然后加入10ml 0.175m乙酸溶解所获得的抗菌促成骨复合物；将所获得的0.175m乙酸溶解所获得的抗菌促成骨复合物滴加在24孔板内置于通风橱内风干8小时，得到线结构复合物，标记为c@p5。
37.实施例6a)滴加200μl的0.875m乙酸润湿50mg的壳聚糖，再加入5.2mg/ml的葛根素(壳聚糖和葛根素的质量比为1：1.04)，研磨5分钟，然后加入0.175m乙酸溶解所获得的抗菌促成骨复合物；b)将所获得的0.175m乙酸溶解所获得的抗菌促成骨复合物涂抹于医用纱布表面，经过干燥后，得到抗菌敷料，标记为c@p6。
38.实施例7医用peek材料经过抛光后经过乙醇、丙酮、去离子水依次分别清洗三遍，使用浓硫酸对其进行磺化处理，然后使用120℃水热处理4小时后取出自然晾干；滴加200μl的0.875m乙酸润湿5mg/ml的壳聚糖，再加入5.2mg/ml的葛根素(壳聚糖和葛根素的质量比为1：1.04)，研磨5分钟，然后加入10ml的0.175m乙酸溶解所获得的抗菌促成骨复合物；取500μl溶于0.175m乙酸的抗菌促成骨复合物浸泡磺化peek(标记为peek)于24孔板内，使用摇床，在37.5℃下反应24小时；取出样品，用pbs清洗两遍后取出自然晾干，即获得装载线结构复合物的磺化peek材
料。采用上述方法制备装载壳聚糖的磺化peek材料和装载葛根素的磺化peek材料，标记为spp：葛根素负载的磺化peek组；spc：壳聚糖负载的磺化peek组；spp@c：线结构复合物负载的磺化peek。
39.实施例8a)滴加200μl的0.875m乙酸润湿50mg的壳聚糖的去离子水溶液中，再加入52mg的葛根素(壳聚糖和葛根素的质量比为1：1.04)，分别研磨0分钟(即不研磨)、5分钟和20分钟，然后加入10ml 0.175m乙酸溶解所获得的抗菌促成骨复合物；b)将所获得的0.175m乙酸溶解所获得的抗菌促成骨复合物分别于60℃和100℃烘箱中加热1小时，得到复合物标记为5min-60和5min-100。