泸定百合抗病相关基因CAT的EST-STS分子标记引物及其应用的制作方法

泸定百合抗病相关基因cat的est
‑
sts分子标记引物及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学及基因工程技术领域，具体的说是泸定百合抗病相关基因cat的est
‑
sts分子标记引物及其应用。


背景技术：

2.百合为百合科百合属多年生球根花卉，花姿优美，色彩艳丽，深受人们喜爱，是世界五大鲜切花之一，由百合尖孢镰刀菌转化型引起的百合鳞茎腐烂病是目前百合生产中危害最为严重的病害，且镰刀菌病害发生后危害严重，对百合切花的产量、品质及市场价格影响很大。而且镰刀菌是一类能引起多种作物根腐、茎腐的土传真菌，很难进行有效防治。虽然在生产上可以通过物理或化学手段防治百合病害，但需要投入大量的人力、物力，且化学防治可能会对环境造成污染。
3.过氧化氢酶(catalase,cat)是一类广泛存在于动植物和微生物体内的酶，是生物体内主要抗氧化酶之一，其生物学功能主要是催化分解细胞内的h2o2，防止细胞过氧化，提高植物体内抗氧化酶活性和抗氧化代谢的水平可以增强植物本身的抗性，cat在病害防御、胁迫应答、延缓衰老等方面起着重要作用。大量研究表明cat与植物的抗性相关。
4.现在市场上最常见的切花百合品种为东方百合品系，但东方百合对百合镰刀菌枯萎病的抗性表现最差，而亚洲百合、la百合以及部分中国野生百合等对百合镰刀菌具有较强的抗性，有研究者已通过一些如rapd、aflp等分子标记对亚洲百合的镰刀菌病害抗性进行了分析，但是现有技术方法在实践的过程，需要构建百合抗/感病杂交后代群体，由于构建百合抗/感病杂交后代群体的工作程序繁琐，导致鉴定的效率进度缓慢。


技术实现要素：

5.为了弥补现有技术的不足，解决现有技术方法在实际工作过程中，需要构建百合抗/感病杂交后代群体，由于构建百合抗/感病杂交后代群体的工作程序繁琐，导致鉴定的效率进度缓慢问题，本发明提出的泸定百合抗病相关基因cat的est
‑
sts分子标记引物及其应用。
6.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：泸定百合抗病相关基因cat的est
‑
sts分子标记引物，包括est
‑
sts分子标记引物，且一对所述est
‑
sts分子标记引物包括正向引物以及反向引物；
7.所述正向引物的核苷酸(dna)序列号如下seq id no.1所示，且所述反向引物的核苷酸(dna)序列号如下seq id no.2所示：
[0008]5’‑
aactacaattcgccgttct
‑3’
(seq id no.1)；
[0009]5’‑
cgaggtactcctggtgc
‑3’
(seq id no.2)。
[0010]
泸定百合抗病相关基因cat的est
‑
sts分子标记引物的应用，该应用包括以下流程：
[0011]
s1：准备est
‑
sts引物聚合酶链反应(pcr)扩增试剂、仪器设备以及est
‑
sts引物；
[0012]
s2：按照dna试剂盒说明书提取百合新鲜叶片dna；
[0013]
s3：取上一步骤适量dna产物进行电泳以及紫外分光光度计检测其纯度和浓度；
[0014]
s4：另取适量dna产物进行稀释后作为pcr反应模板并对est
‑
sts引物进行pcr扩增；
[0015]
s5：pcr反应完成后，取适量pcr产物经电泳检测后再通过凝胶成像系统拍照，观察分析结果。
[0016]
优选的，所述s1中，主要的试剂包括plant genomic dna kit dna、pcr产物胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、感受态细胞、taq酶、la taq酶、反转录酶、pmd 18t vector试剂盒。
[0017]
优选的，所述s1中，主要的仪器设备包括pcr仪器、台式低温高速离心机、电泳设备、紫外可见分光光度计以及琼脂糖凝胶成像系统。
[0018]
优选的，所述s2中，百合新鲜叶片选取市场上不同品系栽培品种以及中国特有野生百合资源，如岷江百合、泸定百合、兰州百合以及川百合等23种百合资源，其中岷江百合以及泸定百合均存在现有的抗病鉴定资料。
[0019]
优选的，所述s4中，est
‑
sts引物包括权利要求1所述est
‑
sts分子标记引物。
[0020]
优选的，所述s4中，pcr的反应体系包括：dna 1μl；10μm的正向引物和10μm的反向引物各1μl；5
×
pcr buffer 2.5μl；10μm的dntp 0.5μl；mgcl21.5μl；taq dna聚合酶(1
‑
1.5u)0.2μl；ddh2o 17.3μl。
[0021]
优选的，所述s4中，pcr反应的反应条件为：温度控制94℃预变性2
‑
4min、温度控制94℃变性30
‑
40s、温度控制51℃退火30
‑
40s以及温度控制72℃且延伸30
‑
40s，总共完成33个循环；最后温度控制在72℃延伸10min。
[0022]
优选的，所述s5中，取适量pcr产物电泳检测具体为：取适量pcr产物经质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测pcr产物的扩增片段长度。
[0023]
优选的，所述s5中，pcr反应结束后的产物，其中切取较明亮的扩增条带进行测序鉴定，鉴定结果显示扩增条带为cat基因产物。
[0024]
本发明的技术效果和优点：
[0025]
本发明提供的泸定百合抗病相关基因cat的est
‑
sts分子标记引物及其应用，通过一对est
‑
sts分子标记引物可以对包括中国野生百合、亚洲百合、东方百合和la百合等在内的对百合镰刀菌枯萎病表现不同抗/感病的不同百合品系进行鉴定；且不仅可以对百合镰刀菌枯萎病表现不同抗性的百合资源进行抗性鉴定，还可以在一定程度上对不同百合品系进行鉴定区别；应用该方法可以直接对不同百合资源进行百合镰刀菌枯萎病抗性鉴定，不需要构建百合抗/感病杂交后代群体，省去了构建百合抗/感病杂交后代群体的繁琐工作程序，且该分子标记来自est，而est序列保守性较高，在家族和种属间的通用性比来源于非表达序列的标记(如ssr标记)更高，特别适用于远缘物种间(如不同百合品系间)的比较鉴定研究，且est
‑
sts分子标记开发简单、快捷、费用低，相对于传统的鉴定方法，其更高效。
附图说明
[0026]
下面结合附图对本发明作进一步说明。
[0027]
图1是本发明中应用的流程图；
[0028]
图2是本发明中pcr产物凝胶电泳图；
具体实施方式
[0029]
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
[0030]
本发明所述的泸定百合抗病相关基因cat的est
‑
sts分子标记引物，包括est
‑
sts分子标记引物，且一对所述est
‑
sts分子标记引物包括正向引物以及反向引物；
[0031]
所述正向引物的核苷酸(dna)序列号如下seq id no.1所示，且所述反向引物的核苷酸(dna)序列号如下seq id no.2所示：
[0032]5’‑
aactacaattcgccgttct
‑3’
(seq id no.1)；
[0033]5’‑
cgaggtactcctggtgc
‑3’
(seq id no.2)。
[0034]
实施例一
[0035]
泸定百合抗病相关基因cat的est
‑
sts分子标记引物的应用，该应用包括以下流程：
[0036]
s1：准备est
‑
sts引物聚合酶链反应(pcr)扩增试剂、仪器设备以及est
‑
sts引物；
[0037]
s2：按照dna试剂盒说明书提取百合新鲜叶片dna；
[0038]
s3：取上一步骤适量dna产物进行电泳以及紫外分光光度计检测其纯度和浓度；
[0039]
s4：另取适量dna产物进行稀释后作为pcr反应模板并对est
‑
sts引物进行pcr扩增；
[0040]
s5：pcr反应完成后，取适量pcr产物经电泳检测后再通过凝胶成像系统拍照，观察分析结果。
[0041]
作为本发明的一种实施方式，所述s1中，主要的试剂包括plant genomic dna kit dna、pcr产物胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、感受态细胞、taq酶、la taq酶、反转录酶、pmd 18t vector试剂盒。
[0042]
作为本发明的一种实施方式，所述s1中，主要的仪器设备包括pcr仪器、台式低温高速离心机、电泳设备、紫外可见分光光度计以及琼脂糖凝胶成像系统。
[0043]
作为本发明的一种实施方式，所述s2中，百合新鲜叶片选取市场上不同品系栽培品种以及中国特有野生百合资源，如岷江百合、泸定百合、兰州百合以及川百合等23种百合资源，其中岷江百合以及泸定百合均存在现有的抗病鉴定资料。
[0044]
作为本发明的一种实施方式，所述s4中，est
‑
sts引物包括权利要求1所述est
‑
sts分子标记引物。
[0045]
作为本发明的一种实施方式，所述s4中，pcr的反应体系包括：dna 1μl；10μm的正向引物和10μm的反向引物各1μl；5
×
pcr buffer 2.5μl；10μm的dntp 0.5μl；mgcl21.5μl；taq dna聚合酶(1
‑
1.5u)0.2μl；ddh2o 17.3μl。
[0046]
作为本发明的一种实施方式，所述s4中，pcr反应的反应条件为：温度控制94℃预变性2min、温度控制94℃变性40s、温度控制51℃退火30s以及温度控制72℃且延伸30s，总共完成33个循环；最后温度控制在72℃延伸10min。
[0047]
作为本发明的一种实施方式，所述s5中，取适量pcr产物电泳检测具体为：取适量pcr产物经质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测pcr产物的扩增片段长度。
[0048]
作为本发明的一种实施方式，所述s5中，pcr反应结束后的产物，其中切取较明亮的扩增条带进行测序鉴定，鉴定结果显示扩增条带为cat基因产物。
[0049]
实施例二
[0050]
泸定百合抗病相关基因cat的est
‑
sts分子标记引物的应用，该应用包括以下流程：
[0051]
s1：准备est
‑
sts引物聚合酶链反应(pcr)扩增试剂、仪器设备以及est
‑
sts引物；
[0052]
s2：按照dna试剂盒说明书提取百合新鲜叶片dna；
[0053]
s3：取上一步骤适量dna产物进行电泳以及紫外分光光度计检测其纯度和浓度；
[0054]
s4：另取适量dna产物进行稀释后作为pcr反应模板并对est
‑
sts引物进行pcr扩增；
[0055]
s5：pcr反应完成后，取适量pcr产物经电泳检测后再通过凝胶成像系统拍照，观察分析结果。
[0056]
作为本发明的一种实施方式，所述s1中，主要的试剂包括plant genomic dna kit dna、pcr产物胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、感受态细胞、taq酶、la taq酶、反转录酶、pmd 18t vector试剂盒。
[0057]
作为本发明的一种实施方式，所述s1中，主要的仪器设备包括pcr仪器、台式低温高速离心机、电泳设备、紫外可见分光光度计以及琼脂糖凝胶成像系统。
[0058]
作为本发明的一种实施方式，所述s2中，百合新鲜叶片选取市场上不同品系栽培品种以及中国特有野生百合资源，如岷江百合、泸定百合、兰州百合以及川百合等23种百合资源，其中岷江百合以及泸定百合均存在现有的抗病鉴定资料。
[0059]
作为本发明的一种实施方式，所述s4中，est
‑
sts引物包括权利要求1所述est
‑
sts分子标记引物。
[0060]
作为本发明的一种实施方式，所述s4中，pcr的反应体系包括：dna 1μl；10μm的正向引物和10μm的反向引物各1μl；5
×
pcr buffer 2.5μl；10μm的dntp 0.5μl；mgcl21.5μl；taq dna聚合酶(1
‑
1.5u)0.2μl；ddh2o 17.3μl。
[0061]
作为本发明的一种实施方式，所述s4中，pcr反应的反应条件为：温度控制94℃预变性4min、温度控制94℃变性35s、温度控制51℃退火35s以及温度控制72℃且延伸35s，总共完成33个循环；最后温度控制在72℃延伸10min。
[0062]
作为本发明的一种实施方式，所述s5中，取适量pcr产物电泳检测具体为：取适量pcr产物经质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测pcr产物的扩增片段长度。
[0063]
作为本发明的一种实施方式，所述s5中，pcr反应结束后的产物，其中切取较明亮的扩增条带进行测序鉴定，鉴定结果显示扩增条带为cat基因产物。
[0064]
实施例三
[0065]
泸定百合抗病相关基因cat的est
‑
sts分子标记引物的应用，该应用包括以下流程：
[0066]
s1：准备est
‑
sts引物聚合酶链反应(pcr)扩增试剂、仪器设备以及est
‑
sts引物；
[0067]
s2：按照dna试剂盒说明书提取百合新鲜叶片dna；
[0068]
s3：取上一步骤适量dna产物进行电泳以及紫外分光光度计检测其纯度和浓度；
[0069]
s4：另取适量dna产物进行稀释后作为pcr反应模板并对est
‑
sts引物进行pcr扩
增；
[0070]
s5：pcr反应完成后，取适量pcr产物经电泳检测后再通过凝胶成像系统拍照，观察分析结果。
[0071]
作为本发明的一种实施方式，所述s1中，主要的试剂包括plant genomic dna kit dna、pcr产物胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、感受态细胞、taq酶、la taq酶、反转录酶、pmd 18t vector试剂盒。
[0072]
作为本发明的一种实施方式，所述s1中，主要的仪器设备包括pcr仪器、台式低温高速离心机、电泳设备、紫外可见分光光度计以及琼脂糖凝胶成像系统。
[0073]
作为本发明的一种实施方式，所述s2中，百合新鲜叶片选取市场上不同品系栽培品种以及中国特有野生百合资源，如岷江百合、泸定百合、兰州百合以及川百合等23种百合资源，其中岷江百合以及泸定百合均存在现有的抗病鉴定资料。
[0074]
作为本发明的一种实施方式，所述s4中，est
‑
sts引物包括权利要求1所述est
‑
sts分子标记引物。
[0075]
作为本发明的一种实施方式，所述s4中，pcr的反应体系包括：dna 1μl；10μm的正向引物和10μm的反向引物各1μl；5
×
pcr buffer 2.5μl；10μm的dntp 0.5μl；mgcl21.5μl；taq dna聚合酶(1
‑
1.5u)0.2μl；ddh2o 17.3μl。
[0076]
作为本发明的一种实施方式，所述s4中，pcr反应的反应条件为：温度控制94℃预变性3min、温度控制94℃变性40s、温度控制51℃退火30s以及温度控制72℃且延伸40s，总共完成33个循环；最后温度控制在72℃延伸10min。
[0077]
作为本发明的一种实施方式，所述s5中，取适量pcr产物电泳检测具体为：取适量pcr产物经质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测pcr产物的扩增片段长度。
[0078]
作为本发明的一种实施方式，所述s5中，pcr反应结束后的产物，其中切取较明亮的扩增条带进行测序鉴定，鉴定结果显示扩增条带为cat基因产物。
[0079]
根据上述实施例三得出试验结果，如下表1所示：
[0080]
表1
[0081]
[0082]
[0083][0084]
根据表一可以看出，表1中的23个百合资源对镰刀菌表现抗/感及抗/感强弱分级；不同品系的鉴别区分：从图2中可以看到，用cat基因的est
‑
sts分子标记引物在包括野生百合、东方百合、亚洲百合和la百合在内的4个不同百合系列中的pcr扩增条带有明显差别，而亚洲百合、la百合以及中国野生百合中的川百合(c)的扩增结果完全一致：2条pcr扩增产物大概在400bp左右(250bp和500bp之间)，这2条扩增产物之间大小差别约50bp；中国野生百合由于地域分布差别较大，所以条带也不完全一样，但在一定程度上也可以区别与其它品系百合，从图2中可以看出，由于泸定百合(ld)与岷江百合(mj)进化关系较近，所以它们的3个扩增条带完全一样：除了在1200bp左右有一条最大的扩增条带外，在250bp和500bp之间还有2条较明显的扩增条带，且这2条扩增条带的大小明显区别于亚洲百合和la百合的2条扩增条带，而川百合(c)由于与亚洲百合及la百合的遗传关系较近，所以它们的扩增结果也相似。而兰州百合(lz)的扩增条带完全区别于其它百合，仅在400bp左右具有一条扩增条带，这个条带与亚洲百合、la百合及川百合的2条扩增条带中的最大条带一致的；而东方百合品系的扩增结果完全不同于其它百合品系：几乎没有扩增条带，说明东方百合可能缺失该cat基因，这可能与其易感染百合镰刀菌病害有一定关系。
[0085]
抗病鉴定结果：结合图2，抗病百合都有cat基因扩增产物的明显条带，而感病百合无cat基因扩增产物的明显条带。
[0086]
通过一对est
‑
sts分子标记引物可以对包括中国野生百合、亚洲百合、东方百合和la百合等在内的对百合镰刀菌枯萎病表达不同抗/感病的不同百合品系进行鉴定；且不仅可以对百合镰刀菌枯萎病表现不同抗性的百合资源进行抗性鉴定，还可以在一定程度上对不同百合品系进行鉴定区别；该应用方法可以直接对不同百合资源进行百合镰刀菌枯萎病抗性鉴定，不需要构建百合抗/感病杂交后代群体，省去了构建百合抗/感病杂交后代群体的繁琐工作程序，且该分子标记来自est，而est序列保守性较高，在家族和种属间的通用性
比来源于非表达序列的标记(如ssr标记)更高，特别适用于远缘物种间(如不同百合品系间)的比较鉴定研究，且est
‑
sts分子标记开发简单、快捷、费用低，相对于传统的鉴定方法，其更高效。
[0087]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。