一种生物素结合蛋白以及亲和柱制备方法与流程

1.本方法属于生物技术领域，具体涉及一种生物素结合蛋白及亲和柱制备方法。


背景技术：

2.在生物化学中，生物素化蛋白质就是生物素与蛋白质等大分子物质共价结合的产物。生物素－亲和素系统(biotin
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avidin—system，bas)是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。随着各种生物素衍生物的问世，bas很快被广泛应用于医学各领域。近年大量研究证实，生物素—亲和素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合。生物素与亲和素之间高亲合力的牢固结合以及多级放大效应，使bas免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。它已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。
3.由于生物素的分子量不大(分子量为244.31)，生物素化反应快速、高效且不易被干扰。生物素化的分子能通过生物素与链霉亲和素、亲和素相互作用，且不受高热、ph、蛋白酶解的影响。生物素与链霉亲和素、亲和素的结合特异且高效，因此这一互作在生物技术的许多领域有着广泛的应用。另外，多个生物素化分子可以发生交联来形成个科研人员感兴趣的蛋白，同时允许和多个链霉亲和素、亲和素、中性亲和素蛋白结合，增加了对此蛋白的检测灵敏度。此外还有大量的生物素化分子的应用有待开发。
4.但由于生物素化蛋白与链霉亲和素结合过于牢固，很难在非变性情况下分开，从而限制这一技术的发展。通过了解，市面上也有部分相应的亲和柱产品，但其效果不尽如人意。通过查阅文献2010/0311076 al 12/2010 takakura et al.及2010/0330701 al 12/2010 takakura et al.，我们发现了一种生物素结合蛋白，它与生物素化蛋白结合不仅特异性和效率都很高，而且可以通过提高生物素浓度来使两者很好的分离，最终可以通过制备出相应的亲和柱纯化出生物素化水平达100％的蛋白。


技术实现要素：

5.本发明目的是制备相应生物素结合蛋白并使用该蛋白制备出相应的亲和柱，从而可以通过该柱纯化出生物素化水平达100％的蛋白。
6.具体步骤如下：
7.1.将该种生物素结合蛋白的碱基序列经优化后合成至相应的载体上。
8.2.将步骤1中的载体转化至大肠杆菌的感受态细胞，经培养后进行表达鉴定，挑选出表达的菌种进行扩大培养，并于优化后的条件进行诱导表达，收集菌体后进行纯化。
9.3.将上一步纯化后得到的蛋白经透析更换相应buffer后，与泡发好的填料进行螯合，再进行一系列操作得到相应的亲和素柱。
10.4.使用上一步得到的亲和素柱来纯化生物素化水平不足100％的蛋白，将纯化得到的蛋白用链霉亲和素柱进行检测，检测显示蛋白全部与链霉亲和素柱结合，即证实制备的亲和素柱有效。
11.5.由上述技术方案可知，本发明提供了一种生物素结合蛋白，且制备出的亲和素
柱可纯化出生物素化水平达100％的蛋白。
附图说明
12.图1为本发明中通过纯化得到的生物素结合蛋白。该蛋白为大肠杆菌表达的可溶性蛋白。
13.图2为本发明中案例转甲状腺素蛋通过常规纯化获得，该蛋白为大肠杆菌表达的可溶性蛋白。
14.图3为本发明中案例转甲状腺素蛋白通过链霉亲和素柱测试，灰度分析得出其生物素化水平约为60％。
15.图4为本发明中案例转甲状腺素蛋白通过相应的亲和素柱纯化，最终得到生物素化水平为100％的蛋白。
16.图5为本发明中链霉亲和素柱对通过亲和素柱纯化得到的转甲状腺素蛋白生物素化水平的验证测试。
具体实施方式
17.结合以下实例对本发明做进一步的说明:
18.将本发明的生物素结合蛋白碱基序列进过优化克隆至相应载体，经转化，表达鉴定扩大培养，收集纯化后再与填料螯合，最终制备出相应的亲和柱。本发明使用的实验蛋白为转甲状腺素蛋白，将该蛋白的碱基序列优化并添加his及avi标签后克隆至相应载体，并于大肠杆菌中诱导表达时加入生物素，可使部分蛋白生物素化，常规的纯化制备的转甲状腺素蛋白经链霉亲和素验证，只能得到生物素化与未生物素化蛋白的混合物，为了得到生物素化水平达100％的蛋白，我们使用该种生物素结合蛋白制备的亲和素柱对混合物进行纯化，再将制备的蛋白用链霉亲和素柱验证其生物素化水平，达100％。
19.1.将本发明的生物素结合蛋白的氨基酸序列进行大肠杆菌密码子的优化，得出对应碱基序列后，将其合成到对应载体中，最终得到相应的质粒。
20.2.将得到的质粒转化至大肠杆菌宿主细胞rosettaplyss(de3)中，涂布平板后，于第二天挑克隆进行小量诱导并进行诱导条件优化，得出表达量较好的菌种以及诱导条件。
21.3.将得到的菌种接入试管进行活化，之后转接入摇瓶中扩大培养，待大瓶中菌液od至0.6
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0.8时，加入诱导剂iptg至其终浓度为0.1mm，诱导后培养温度为18℃，时长为16h。
22.4.将诱导完成的菌液于7000rpm/min，5min离心，收集菌体，用裂解液重悬，然后冰浴超声破碎，裂解液组成为：50mm tris,ph8.0,500mm nacl，12000rpm/min，20min离心去除沉淀。
23.5.对步骤4中的上清进行纯化，用ni柱与上清孵育2h后洗杂，再分别用50mm tris，500mm nacl，ph8.0，20mm咪唑；50mm tris，500mm nacl，ph8.0，50mm咪唑；50mm tris，500mm nacl，ph8.0，250mm咪唑对ni柱进行洗脱，并将各组分进行还原性sds
‑
page电泳鉴定。
24.6.取纯度较好的组分合并透析至工作液：0.1m nahco
3，
0.5m nacl，ph8.3，收取蛋白后用bca法测定蛋白浓度并进行还原性sds
‑
page电泳鉴定。
25.7.取用适量的填料干粉于1mm hcl中4℃泡发2
‑
3h，泡发完成后用一级水冲洗5倍柱体积，再用工作液冲洗5倍柱体积，最后与步骤6得到的蛋白按每8mg蛋白1ml填料于4℃过
夜螯合。
26.8.将步骤7的填料截留后，用一级水冲洗填料5倍柱体积，再用封闭液：0.1m tris
‑
hcl，ph8.0冲洗5倍柱体积，最后将填料于4℃浸没于封闭液中2
‑
3h，填料与工作液体积比为1：1。
27.9.封闭完成后，将填料用一级水冲洗5倍柱体积，用酸液：0.1m醋酸钠缓冲液，0.5m nacl，ph4.0，冲洗5倍柱体积，再用一级水冲洗5倍柱体积，再用碱液：0.1m tris
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hcl，0.5m nacl，ph8.0，冲洗填料5倍柱体积，最后再用保存液：pbs，50％甘油，ph7.4，冲洗填料5倍柱体积并保存。由此，生物素结合蛋白的亲和柱制备完成。
28.10.将转甲状腺蛋白的碱基序列经优化并添加his及avi标签后合成至原核表达载体中，再转化至大肠杆菌宿主细胞rosetta plyss(de3)中，涂布平板，于第二天挑克隆进行小量诱导并进行诱导条件优化，得出表达量较好的菌种以及诱导条件。
29.11.将得到的菌种接入试管进行活化，之后转接入摇瓶中扩大培养，待大瓶中菌液od至0.6
‑
0.8时，加入诱导剂iptg至其终浓度为0.2mm，诱导后培养温度为18℃，时长为16h。
30.12.将诱导完成的菌液于7000rpm/min，5min离心，收集菌体，用裂解液重悬，然后冰浴超声破碎，裂解液组成为：50mm tris,ph8.0,500mm nacl，12000rpm/min，20min离心去除沉淀。
31.13.对步骤12中的上清进行纯化，用ni柱与上清孵育2h后洗杂，再分别用50mm tris，500mm nacl，ph8.0，20mm咪唑；50mm tris，500mm nacl，ph8.0，50mm咪唑；50mm tris，500mm nacl，ph8.0，250mm咪唑对ni柱进行洗脱，并将各组分进行还原性sds
‑
page电泳鉴定。
32.14.选取纯度较好的组分透析至50mm tris，500mm nacl，ph8.0,10％甘油，3h后换一次透析液，3h收取蛋白。取用120ul蛋白，与120ulpbs混合均匀后取200ul稀释后蛋白，使用200ul链霉亲和素柱对该蛋白的生物素化水平进行测试，重力上样2遍后，使用50mm tris，500mm nacl，10％甘油，ph8.0对链霉亲和素柱分别洗涤一倍柱体积，一倍柱体积，三倍柱体积，将各组分进行还原性sds
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page电泳鉴定，通过软件image j灰度分析得出该蛋白的生物素化水平为60％。
33.15.取1ml生物素化水平为60％的转甲状腺素蛋白与200ul亲和素柱孵育1h后，50mm tris，500mm nacl，10％甘油，ph8.0洗杂，再分别用50mm tris，500mm nacl，ph8.0，5mm生物素；50mm tris，500mm nacl，ph8.0，10mm生物素对亲和素柱进行洗脱，并将各组分进行还原性sds
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page电泳鉴定。
34.16.将洗脱组分的蛋白透析至50mm tris，500mm nacl，10％甘油，ph8.0中，3h后更换透析液，去除生物素，收取蛋白后，取120ul转甲状腺素蛋白与120ulpbs混合均匀，用200ul的链霉亲和素柱进行重力上样，再使用50mm tris，500mm nacl，10％甘油，ph8.0分别洗杂一倍柱体积，一倍柱体积，三倍柱体积，最后对各组分进行还原性sds
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page电泳鉴定，通过软件image j灰度分析得出转甲状腺素蛋白全部与链霉亲和素柱结合，即生物素化水平达到100％。