一种环状RNA原位检测方法与流程

一种环状rna原位检测方法
技术领域
1.本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种环状rna原位检测方法。


背景技术：

2.环状rna(circularrna，circrna)是在转录过程中，通过可变剪接形成的一类首尾相接的环状rna分子。与它的线性转录本相比，环状rna由于没有5’和3’端，因此更加的稳定，不易被rna酶降解。越来越多的证据表明，环状rna在许多的重要的疾病和癌症当中发挥着重要的作用。
3.核酸原位检测技术能够对细胞和组织样本中的dna和rna进行定位检测。传统的核酸原位检测技术为原位杂交技术(ish)，该方法通过标记的检测探针与目标核酸进行杂交，未结合的探针被洗去，与目标核酸特异杂交的检测探针通过标记被检测，从而实现目标核酸的检测。其中，单分子荧光原位杂交技术(smfish)通过在单个rna分子上杂交多个检测探针获得足够强的信号而实现对单个rna分子进行原位检测。与传统的ish相比，单分子荧光原位杂交技术具有更高的灵敏度和特异性。然而，由于技术本身原理的限制，smfish技术无法将同一基因的线性rna转录本和环状rna区分开来，因而不适用于环状rna的原位检测。
4.目前，国内实验室常用的环状rna检测试剂盒是美国acd公司的basescope的原位杂交试剂盒，它是基于分支dna技术(branched dna technology，bdna)的原理开发应用的。其中bdna技术是由一对双z形探针杂交至靶序列，通过逐级放大信号，最后采用红色显色底物检测。单个rna转录本显示为红色点状或团簇状信号。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种环状rna原位检测方法。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种环状rna原位检测方法，包括如下步骤：
8.(1)设计至少一锁式探针，该至少一锁式探针与待测样品中的待检测的环状rna特异的杂交互补；
9.(2)通过能够以rna为模板连接dna的dna连接酶将与上述环状rna特异互补杂交的锁式探针沿所述环状rna补齐核苷酸，获得至少一环形模板；
10.(3)以上述至少一环形模板为扩增模板，进行滚环扩增，获得至少一滚环扩增产物；
11.(4)将上述至少一滚环扩增产物与至少一检测探针杂交以进行环状rna的原位检测。
12.在本发明的一个优选实施方案中，所述待测样品为培养的细胞、组织中的细胞或组织切片中的细胞。
13.进一步优选，所述待测样品为组织切片中的细胞。
14.在本发明的一个优选实施方案中，所述dna连接酶为splintr连接酶。
15.在本发明的一个优选实施方案中，所述滚环扩增所用的酶为phi29聚合酶。
16.在本发明的一个优选实施方案中，所述检测探针修饰有荧光标记物、显色标记物、酶标记物、放射性标记物、磁性标记物或发光密度标记物。
17.在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一锁式探针含有自然和/或非自然核苷酸。
18.在本发明的一个优选实施方案中，所述待测样品为组织切片中的细胞，所述dna连接酶为splintr连接酶，所述滚环扩增所用的酶为phi29聚合酶。
19.进一步优选的，所述检测探针修饰有荧光标记物、显色标记物、酶标记物、放射性标记物、磁性标记物或发光密度标记物。
20.更进一步优选的，所述至少一锁式探针含有自然和/或非自然核苷酸。
21.本发明的有益效果是：
22.1.本发明通过滚环扩增实现对信号的放大，其前提是将检测目标核酸分子转化为检测与目标核酸分子特异对应的环状核酸分子。该方法通过一条单链dna构成锁式探针的两段区域与目标核酸的靶序列特异杂交，当探针两端的碱基与靶序列完全互补时，dna连接酶将探针两端连接形成一个环状dna分子，而后通过滚环扩增(rca)对环状dna分子进行扩增，最后再用检测探针检测扩增产物实现对目标rna的检测。
23.2.本发明能够高灵敏地检测环状rna在不同组织或者同一组织不同部位的存在和分布状况。与现有的basescope技术相比，减少了检测的步骤，不需要特殊仪器设备，缩短了检测时间，操作简单，性能稳定。
附图说明
24.图1为本发明实施例1的原理示意图。
25.图2为本发明实施例1的检测结果图。
26.图3为本发明实施例2与basescope的检测cdr1as的效果对比图。
具体实施方式
27.以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。实施例1小鼠小脑为实验样品考察锁式探针法原位检测环状rna cdr1as和phf21a。
28.本实施例的原理如图1所示，具体包括如下步骤：
29.(一)组织样本制备：
30.将c57野生型小鼠脑(厦门大学医学院)解剖并固定在4％多聚甲醛(pfa)中，4℃过夜，然后转移到1
×
depc
‑
pbs中的30％蔗糖中脱水过夜。将它们包埋在
‑
80℃的最佳切割温度(oct)化合物中并冷冻，并使用徕卡低温恒温器(cat no.cm1905；leica，germany)制备15μm的冷冻切片。所有组织切片玻片在使用前均保存在
‑
80℃。
31.(二)组织样本预处理：
32.在室温(rt)下，将载玻片上的小鼠脑切片在4％(w/v)pfa
‑
depc
‑
pbs中预固定5min，然后在depc
‑
pbs
‑
t(depc处理的pbs中含有0.05％tween
‑
20(sigma))。然后在室温下用0.1mhcl(sigma)透化5min。在depc
‑
pbs
‑
t中洗涤两次后，浸入70％(v/v)、85％(v/v)和100％乙醇(vwr)里各2min，将载玻片风干。最后，将直径为9毫米、深度为0.8毫米的secure
‑
seal杂交室(thermo scientific)贴附到样品所在的表面。
33.(三)锁式探针杂交和滚环扩增：
34.本步骤所用锁式探针、滚环扩增引物和检测探针序列如表1所示。
35.(1)探针杂交
36.依次向1.5ml离心管中加入终浓度为6xssc，10％甲酰胺(sigma)的杂交缓冲液，锁式探针终浓度0.2μm，补充depc
‑
h2o至50μl，混匀离心后加入反应孔内，放入37℃恒温培养箱中反应2h。反应结束后用depc
‑
pbs
‑
t清洗3次。
37.(2)探针成环
38.50μl连接混合物包含1
×
splintr连接酶反应缓冲液(neb)、0.5u/ml splintr连接酶(neb)、1u/ml ribolock rnase inhibitor(thermo scientific)，0.2mg/ml bsa(neb)，补充depc
‑
h2o至50μl，添加到孔室中，并在37℃下孵育1h。反应结束后，用depc
‑
pbs
‑
t冲洗3次以去除未连接的锁式探针和酶。在50μl反应体系中加入终浓度为6xssc，10％甲酰胺的杂交缓冲液，0.2μm滚环扩增引物，补充depc
‑
h2o至50μl，于37℃反应30min后，用depc
‑
pbs
‑
t清洗3次。
39.(3)滚环扩增
40.含有1
×
phi29 dna聚合酶缓冲液(thermo scientific)、5％甘油、1mm dntp(thermo scientific)、1u/ml phi29聚合酶(thermo scientific)、1u/ml ribolock rnase inhibitor，0.2mg/ml bsa的rca混合物50μl加入反应孔中在室温下孵育过夜。然后用depc
‑
pbs
‑
t清洗3次。
41.(4)检测探针杂交和图像获取
42.将上述滚环扩增产物与检测探针杂交，最后用dapi进行细胞核染色之后检测。具体的步骤：配制50μl混合液其中包含20％甲酰胺的2
×
ssc，100nm荧光标记的检测探针，在37℃下孵育30min。反应结束后，用depc
‑
pbs
‑
t洗涤3次后，划圈标记反应位置并去除secure
‑
seal杂交室，将载玻片置于70％、85％和100％的梯度乙醇中脱水处理，各2min，空气晾干。最后加入含有100ng/ml dapi的gold antifade mountant封片剂(fermentas)室温下孵育10min后进行荧光显微镜检测并拍照。检测结果如图2所示，cdr1as和phf21a都在小脑的颗粒层有高表达。上半部分是整个小脑全局图，标尺为500μm，下半部分是局部图，标尺为200μm。。
43.实施例2小鼠小脑为实验样品对比锁式探针法和basescope法原位检测环状rna cdr1as。
44.本实施例中，锁式探针法检测cdr1as的方法如实施例1相同，商业化的basescope试剂盒按照生产商的说明书来完成。本实施例的检测对比结果如图3所示，可见在cdrlas基因的检测上，两种方法检测效率都很高。
45.表1实施例1和2中用到的所有探针序列：
[0046][0047][0048]
*划线处：与待检测的环状rna成环连接部位互补的序列；加粗：检测探针和滚环扩增引物杂交的位点。
[0049]
**所有购买的锁式探针均未经磷酸化处理。使用前，磷酸化如下进行：将2μm锁式探针、1
×
pnk缓冲液a(thermo scientific)、1mm atp(thermo scientific)、0.2u/μl t4多核苷酸激酶(thermo scientific)充分混合并在37℃下孵育30min，然后在65℃下将酶灭活10min。磷酸化的锁式探针可在
‑
20℃下储存直至使用。
[0050]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。